劉佳文 吳倩 張昭寰 童金蓉 黃振華 劉靜 潘迎捷 趙勇***

（1）上海海洋大學食品學院，上海 201306；2）上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；3）農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室（上海），上海 201306；4）上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

假單胞菌是常見的需氧型革蘭氏陰性細菌，廣泛地分布在空氣、土壤、水，以及人體皮膚、消化道和呼吸道中，可造成嚴重的水體污染，引起人體呼吸道、泌尿系統(tǒng)及血液等多部位的慢性或急性疾病。生物被膜是細菌細胞及其分泌物（如胞外多糖、胞外蛋白質(zhì)和胞外DNA等）黏附在生物或非生物材料表面而形成的多細胞聚集體［1］，生物被膜的形成加劇了假單胞菌的危害，可增強假單胞菌的致病性和耐藥性，嚴重威脅人類健康。

胞外多糖是假單胞菌生物被膜的主要成分，在其生物被膜黏附、發(fā)育、成熟過程中發(fā)揮重要作用，并能增強細菌對宿主細胞的侵襲力以及對抗生素類藥物的耐受性［2］。研究表明，與假單胞菌生物被膜形成直接相關(guān)的3種核心胞外多糖為：褐藻膠、Psl和Pel，它們分別通過褐藻膠生物合成系統(tǒng)（alginate biosynthetic system）、Psl生物合成系統(tǒng)（Psl biosynthetic system）和Pel生物合成系統(tǒng)（Pel biosynthetic system）進行合成和轉(zhuǎn)運［3］。這3個生物合成系統(tǒng)主要包含4類蛋白質(zhì)：胞內(nèi)蛋白、內(nèi)膜蛋白、周質(zhì)蛋白和外膜蛋白。胞內(nèi)蛋白位于細胞內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，參與胞外多糖的合成，并負責將多糖從胞內(nèi)向內(nèi)膜轉(zhuǎn)運。內(nèi)膜蛋白位于細胞內(nèi)膜，參與多糖的進一步修飾，并負責將多糖傳遞給周質(zhì)蛋白。周質(zhì)蛋白位于細胞的周質(zhì)空間中，負責將多糖從周質(zhì)空間到外膜。外膜蛋白位于細胞外膜，負責將胞外多糖轉(zhuǎn)運到細胞膜外，最終參與假單胞菌生物被膜的形成，使細菌能夠抵抗外界不良環(huán)境的入侵，導致嚴重的醫(yī)療、環(huán)境及食品安全問題［4］。

關(guān)于假單胞菌褐藻膠、Psl和Pel胞外多糖生物合成系統(tǒng)的研究已經(jīng)陸續(xù)開展（表1），明晰其具體的結(jié)構(gòu)和功能，有助于人們更好地理解假單胞菌生物被膜的形成機理，并為抗被膜制劑的研發(fā)提供精準的三維靶標和理論基礎(chǔ)。因此，本文系統(tǒng)地介紹了假單胞菌生物被膜3種核心胞外多糖的生物合成系統(tǒng)，并詳細地闡述了各蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能以及相互作用關(guān)系，最后對假單胞菌生物被膜胞外多糖生物合成系統(tǒng)的進一步研究提出展望。

Table 1 Function of known structure proteins in the core exopolysaccharide biosynthetic systems of Pseudomonas表1假單胞菌核心胞外多糖生物合成系統(tǒng)中已知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的功能

1 褐藻膠胞外多糖生物合成系統(tǒng)

褐藻膠是一種由β-D-甘露糖醛酸及其C5異構(gòu)體α-L-古羅糖醛酸組成的陰離子多糖［18］，是假單胞菌生物被膜的主要成分，也是假單胞菌產(chǎn)生黏附性的主要原因。褐藻膠的合成和轉(zhuǎn)運需要13個蛋白質(zhì)：胞內(nèi)蛋白AlgA、AlgC和AlgD；內(nèi)膜蛋白Alg8、Alg44；周 質(zhì) 蛋 白AlgI、AlgJ、AlgF、AlgX、AlgG和AlgL；外膜蛋白AlgK和AlgE。它們的合成和轉(zhuǎn)運過程如圖1所示。首先，單糖在AlgA、AlgC和AlgD的作用下轉(zhuǎn)化為GDP-甘露糖酸，然后GDP-甘露糖酸經(jīng)聚合酶（Alg8和Alg44）的催化后生成甘露聚糖。在AlgI、AlgJ、AlgF和AlgX的協(xié)同作用下，通過乙?；饔脤υ摼酆衔镞M行改性，并通過AlgG及AlgL將其異構(gòu)化，形成成熟的褐藻膠。最后，成熟的褐藻膠在AlgK參與的周質(zhì)多蛋白復合物介導下穿過外膜的AlgE蛋白轉(zhuǎn)運到細胞外。

1.1 胞內(nèi)褐藻膠前體合成酶AlgA、AlgC和AlgD

褐藻膠的前體物質(zhì)D-甘露糖酸在細菌細胞內(nèi)合成，其合成主要分為以下4步：a.果糖-6-磷酸在AlgA的磷酸甘露糖異構(gòu)酶（PMI）活性作用下生成甘露糖-6-磷酸；b.甘露糖-6-磷酸經(jīng)AlgC催化生成甘露糖-1-磷酸；c.甘露糖-1-磷酸進一步在AlgA的GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）活性作用下生成GDP-甘露糖；d.GDP-甘露糖在AlgD的催化下生成GDP-甘露糖酸［19］。這些參與核苷酸結(jié)合的酶至少存在1個羅斯曼（Rossmann）折疊結(jié)構(gòu)域，由交替的β鏈和α螺旋組成的二級結(jié)構(gòu)，中心的6股平行β折疊連接到周圍的5個α螺旋，這種結(jié)構(gòu)能夠產(chǎn)生或結(jié)合糖核苷酸前體［4］。

AlgA是一種雙功能酶，表現(xiàn)出磷酸甘露糖異構(gòu)酶（PMI）和GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）活性［20］，但其結(jié)構(gòu)尚未確定。Regni等［5］在2002年解析了AlgC的晶體結(jié)構(gòu)，是一種磷酸甘露糖變位酶，包含4個大小相近的結(jié)構(gòu)域，這4個結(jié)構(gòu)域排列成“心形”，并在其中心形成1個大的活性位點裂縫。研究表明，前3個結(jié)構(gòu)域具有相同的拓撲結(jié)構(gòu)，由夾在兩個α螺旋之間的4股β折疊混合組成，而第4個結(jié)構(gòu)域具有類似于TBP超家族蛋白（TATA-box binding protein superfamily）的結(jié)構(gòu)，由2個α螺旋和4股反向β折疊組成。此外，AlgC結(jié)構(gòu)中還包含4個活性位點：位于108位的絲氨酸涉及磷酰基團轉(zhuǎn)移；位于242～246的殘基具有Mg2+螯合性；位于324～328殘基的糖結(jié)合環(huán)能區(qū)分相關(guān)的糖底物；位于421位的精氨酸能與雙磷酸化反應(yīng)中間體相互作用。若基于這些活性位點設(shè)計抑制劑，將有可能抑制褐藻膠的生物合成，促進宿主免疫系統(tǒng)對細菌生物被膜的清除作用，增加抗生素的療效。

Fig.1 Alginate extracellular polysaccharide biosynthetic system圖1褐藻膠胞外多糖生物合成系統(tǒng)

AlgD是一種GDP-甘露糖脫氫酶（GMD），2003年Snook等［6］得到了該蛋白質(zhì)與GDP-甘露酸復合物的晶體結(jié)構(gòu)。研究表明，AlgD是一個結(jié)構(gòu)域交換的二聚體，每個亞基包含2個大小相似的結(jié)構(gòu)域，分別位于N端和C端，由33個殘基的α螺旋連接，其活性位點位于兩個結(jié)構(gòu)域的裂縫中。N端結(jié)構(gòu)域包含完整的二核苷酸結(jié)合基序，由一個6股平行的β折疊和5個α螺旋組成。C端結(jié)構(gòu)域以3個α螺旋開始，隨后是一個二核苷酸結(jié)合基序。AlgD單體的N端結(jié)構(gòu)域與另一個AlgD單體的C端結(jié)構(gòu)域能夠緊密結(jié)合，高度交織形成二聚體，在細胞質(zhì)中，兩個AlgD二聚體相互作用形成四聚體結(jié)構(gòu)，從而將GDP-甘露糖催化成為GDP-甘露糖酸。

1.2 跨內(nèi)膜復合物Alg8和Alg44

Alg8和Alg44均位于假單胞菌細胞內(nèi)膜上，共同組成了跨內(nèi)膜的復合物［21］。Alg8是一種糖基轉(zhuǎn)移酶，其三維結(jié)構(gòu)未知，Oglesby等［22］預測其含有4個跨膜螺旋以及1個可溶性胞質(zhì)環(huán)。在胞質(zhì)環(huán)中存在2個結(jié)構(gòu)域，其中結(jié)構(gòu)域A與II類β糖基轉(zhuǎn)移酶的序列同源性較高，含有保守的天冬氨酸殘基和DXD氨基酸基序，可能分別是NDP-葡萄糖和受體分子的結(jié)合位點；結(jié)構(gòu)域B含有一個保守的天冬氨酸殘基和LXXRW氨基酸基序，可能負責將多個NDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移到受體分子。Remminghorst等［23］經(jīng)實驗證明，Alg8是褐藻膠生物合成的關(guān)鍵，alg8的過表達會導致褐藻膠產(chǎn)量增加、乙?；约安钕虍悩?gòu)化。

Alg44在體內(nèi)以同源二聚體的形式存在，其N端有1個錨定于膜上的信號肽，以及1個位于細胞質(zhì)的PilZ結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）并調(diào)節(jié)褐藻膠的聚合［24-26］。Whitney等［7］解析出了Alg44胞質(zhì)域與c-di-GMP復合物的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出1個分裂的桶狀結(jié)構(gòu)，包含6個反向平行的β鏈和1個α螺旋。Alg44蛋白C端含1個TM結(jié)構(gòu)和周質(zhì)域，其周質(zhì)域中包含膜融合蛋白（MFP）結(jié)構(gòu)，在褐藻膠前體GDP-甘露糖酸的聚合和修飾中發(fā)揮作用。Ogelsby等［22］認為Alg44蛋白的MFP結(jié)構(gòu)域能夠通過蛋白質(zhì)間相互作用，向Alg44的N端發(fā)送構(gòu)象信號，影響Alg8聚合D-甘露酸的能力，從而控制Alg44蛋白的PilZ結(jié)構(gòu)域與c-di-GMP結(jié)合。

1.3 周質(zhì)中乙?；揎椀鞍譇lgI、AlgJ、AlgF和AlgX

GDP-甘露糖酸形成多聚物后將進一步在周質(zhì)空間內(nèi)進行乙酰化修飾［27］，該乙?；^程發(fā)生在甘露糖殘基的C2和C3羥基，由AlgI、AlgJ、AlgF和AlgX構(gòu)成的乙?；瘡秃衔镞M行修飾。在細胞質(zhì)中，AlgI與未知的乙酰供體分子相互作用，并穿過內(nèi)膜將乙酰供體轉(zhuǎn)移到AlgJ或AlgF。AlgX從AlgJ或AlgF中接收乙酰供體分子，然后催化褐藻膠的直接O-乙?；?8］。目前關(guān)于AlgI的具體結(jié)構(gòu)尚未研究，AlgJ、AlgF和AlgX的結(jié)構(gòu)于近些年陸續(xù)得到解析。

Baker等［9］解析了惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）AlgJ周質(zhì)域的結(jié)構(gòu)，該蛋白質(zhì)含有4個平行的核心β鏈（β3、β6～8），在9個α螺旋（α1、α3～10）的包圍下共同形成了α/β/α折疊，兩個反向平行的β鏈（β4和β5）位于α/β/α折疊的側(cè)邊，且其頂部有一個α2、β2和β3鏈組成的帽子結(jié)構(gòu)。Ser-His-Asp保守催化三殘基是該蛋白質(zhì)表現(xiàn)出O-乙酰化活性的原因，其中D190和H192殘基位于帽子結(jié)構(gòu)中，而S288位于α/β/α折疊中。AlgF的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析，發(fā)布于PDB數(shù)據(jù)庫中（PDB ID：6CZT），具有2個串聯(lián)的β三明治結(jié)構(gòu)，介導AlgJ蛋白與AlgX蛋白相互作用，負責乙?；霓D(zhuǎn)移［3］。

Riley等［10］解析了銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）AlgX的晶體結(jié)構(gòu)，它是一種雙結(jié)構(gòu)域蛋白，其N端含有α/β/α拓撲結(jié)構(gòu)，包括7個核心α螺旋，與SGNH水解酶超家族具有結(jié)構(gòu)同源性，不同之處在于AlgX只包含5股平行β股的前4股，第5股為單殘基β橋（W153），且這4個核心β鏈的順序也不同。D174、H176和S269殘基組成了水解酶結(jié)構(gòu)域的催化三聯(lián)體，負責乙?；蚝衷迥z轉(zhuǎn)移。AlgX的C端為碳水化合物結(jié)合模塊（carbohydrate-binding module，CBM），呈現(xiàn)最常見的β三明治折疊，每個β折疊包含4個反向平行的β鏈。CBM中的芳香氨基酸和極性保守殘基存在于蛋白質(zhì)表面的凹槽中，形成一個獨特的底物識別“夾點”，該“夾點”的存在有助于增加多糖-蛋白質(zhì)復合物的穩(wěn)定性。因此，GDP-甘露聚糖可在C端與AlgX結(jié)合，通過夾點并沿保守路徑運動，然后通過AlgX的N端向GDP-甘露聚糖中添加乙?；瑥亩鴮崿F(xiàn)多聚物的改性。

1.4 周質(zhì)中異構(gòu)化蛋白AlgG和AlgL

AlgG是一種C5差向異構(gòu)酶，Wolfram等［8］解析了丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）AlgG蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，AlgG的主干是一個右手平行β螺旋，包括11個完整線圈和1個不完整線圈，每個線圈由3個β折疊組成，依次由3個轉(zhuǎn)彎環(huán)連接。線圈4～10形成一個碳水化合物結(jié)合/糖水解結(jié)構(gòu)域（carbohydrate-binding/sugar hydrolysis domains），N端的1個帽狀螺旋與2個反平行的β折疊共同形成該結(jié)構(gòu)域的蓋子。AlgG能在聚合物水平上將甘露酸殘基轉(zhuǎn)化為古魯酸，從而生成甘露酸、古魯酸交替排列的成熟褐藻膠。Jain等［29］認為AlgG除了具有異構(gòu)酶活性，還能保護新生褐藻膠在穿過周質(zhì)時不被AlgL降解。AlgL是一種褐藻膠水解酶，呈現(xiàn)（α/α）6桶狀折疊，能夠裂解沒有從周質(zhì)空間中轉(zhuǎn)出的褐藻膠，從而防止其在周質(zhì)空間的積累［30-31］。

1.5 外膜蛋白AlgK和AlgE

Keiski等［11］的結(jié)構(gòu)解析表明，AlgK是一種外膜脂蛋白，由22個α螺旋組成的緊湊超螺旋結(jié)構(gòu)，其中1個N端螺旋與超螺旋結(jié)構(gòu)的凹面相結(jié)合，其余21個反向平行的α螺旋聚集形成右手超螺旋。AlgK有3個蛋白質(zhì)相互作用位點，其中2個作用位點靠近N端的脂質(zhì)錨，從而直接與AlgE的周質(zhì)環(huán)相互作用，位于C端的作用位點可能與周質(zhì)蛋白或內(nèi)膜蛋白結(jié)合。研究認為，該蛋白質(zhì)具有至少9.5個TPR基序（tetratricopeptide-like repeat），在大型蛋白質(zhì)復合物的組裝中發(fā)揮支架作用，可與AlgE、Alg8和Alg44相連接，并與AlgX和AlgG一起形成跨周質(zhì)通道［32-33］。Tan等［34］研究認為，AlgK可能是以“末端對末端”的形式與AlgE的周質(zhì)孔相連接，有效延長了褐藻膠的輸出長度，以便于其通過AlgE的β桶。

Whitney等［12］在2011年對外膜蛋白AlgE的結(jié)構(gòu)進行了研究，證明該蛋白質(zhì)是由18個β股（S1～S18）組成的反向平行β桶狀結(jié)構(gòu)，含9個胞外環(huán)（L1～L9）和8個周質(zhì)環(huán)（T1～T8），能自發(fā)地結(jié)合到細胞外膜上，其內(nèi)部帶正電性，可與帶電負性的褐藻膠結(jié)合。Tan等［34］認為L2和T8分別為該蛋白質(zhì)的胞外門和周質(zhì)門，通過兩個門控的開放與關(guān)閉來調(diào)節(jié)褐藻膠的轉(zhuǎn)運。L2可能通過二價陽離子穩(wěn)定電負性的脂多糖（LPS），以防止LPS干擾褐藻膠的有效分泌。周質(zhì)環(huán)T8的構(gòu)象很靈活，可以向下和向外運動，負責將AlgE蛋白由“關(guān)閉”構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)椤伴_放”構(gòu)象，使AlgE與AlgK直接相互作用，從而促進褐藻膠向膜外轉(zhuǎn)運。胞外環(huán)L3和L7折疊到桶腔中，占據(jù)了通道的大部分體積從而限制孔隙的大小，有助于該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定［35］。研究還發(fā)現(xiàn)，AlgE的周質(zhì)T4是維持AlgE、AlgK、AlgX和Alg44形成穩(wěn)定多蛋白質(zhì)復合物的重要區(qū)域［36］。

2 Psl胞外多糖生物合成系統(tǒng)

Psl是一種由D-甘露糖、D-葡萄糖和L-鼠李糖組成的中性五糖［37］。其合成和轉(zhuǎn)運由Psl胞外多糖生物合成系統(tǒng)負責［38］。Psl操縱子包含12個基因（PslA、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L），當前只有PslG的周質(zhì)域結(jié)構(gòu)得到解析，其余蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)仍是未知。Psl胞外多糖的生物合成系統(tǒng)如圖2所示，糖-核苷酸前體經(jīng)PslB合成后，通過PslF、PslH、PslI和PslC轉(zhuǎn)移糖基形成Psl重復單元，然后由內(nèi)膜蛋白PslA提供一個位點，將Psl重復單元組裝到細胞質(zhì)的類異戊二烯脂質(zhì)上，同時在PslJ、PslK和PslL等內(nèi)膜蛋白的作用下，Psl多糖聚合并穿過細胞內(nèi)膜，隨后PslE作為周質(zhì)支架幫助Psl多糖穿過周質(zhì)，最終Psl多糖經(jīng)PslD到達細胞膜外［39］。

2.1 胞內(nèi)蛋白PslB、PslF、PslH、PslI和PslC

PslB、PslF、PslH、PslI和PslC位于細胞質(zhì)中，具體三維結(jié)構(gòu)均屬研究空白。PslB是一種與AlgA相似的雙功能酶，預測具有N端GMP結(jié)構(gòu)域和C端PMI結(jié)構(gòu)域，參與糖-核苷酸前體的生產(chǎn)［37］。PslF、PslH和PslI與分枝桿菌的磷脂酰肌醇甘露醇轉(zhuǎn)移酶PimA結(jié)構(gòu)具有相似性，具有糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferase，GT）結(jié)構(gòu)域，屬于CAZyGT-4家族的酶，采用GT-B折疊，通過保留機制轉(zhuǎn)移糖基殘基，可能負責將活化的糖亞基加入到Psl多糖的重復結(jié)構(gòu)中。PslC與小鼠多肽α-N乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶T1結(jié)構(gòu)相似，屬于CAZyGT-2家族，采用GT-A折疊，可以負責葡萄糖、鼠李糖和甘露糖等多種核苷酸激活糖的轉(zhuǎn)移。根據(jù)PslF、PslH、PslI和PslC的預測結(jié)構(gòu)，這些酶可能負責轉(zhuǎn)移糖-核苷酸前體的糖基，從而形成Psl多糖重復單元［4］。

2.2 內(nèi)膜蛋白PslA、PslE、PslJ、PslK、PslL和PslG

PslA、PslE、PslJ、PslK、PslL和PslG這6種內(nèi)膜蛋白都具有跨膜結(jié)構(gòu)域，可能在細胞內(nèi)膜上組成復合物。目前，除了PslG的可溶域結(jié)構(gòu)之外，其余5種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)尚不明確。PslA與細菌的WbaP蛋白結(jié)構(gòu)相似，具有聚異戊二烯糖基磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，可能為Psl低聚糖重復單元提供1個位點，將其組裝到內(nèi)膜細胞質(zhì)側(cè)的類異戊二烯脂質(zhì)上［4］。PslE的周質(zhì)域與大腸桿菌內(nèi)膜蛋白Wzz存在結(jié)構(gòu)相似性，是一種卷曲的線圈結(jié)構(gòu)，單體可組裝成具有中心孔的六聚體或八聚體［40］。Wu等［41］研究表明，PslE可能作為支架，與PslA、PslD相互作用形成內(nèi)膜復合物，促進Psl多糖向周質(zhì)空間轉(zhuǎn)運。PslJ沒有明顯的結(jié)構(gòu)同系物，PslK蛋白與霍亂弧菌NorM蛋白結(jié)構(gòu)相似，能夠通過擠壓的方式將多糖分子轉(zhuǎn)運至周質(zhì)空間［42］。PslL具有?；D(zhuǎn)移酶3結(jié)構(gòu)域，但Psl多糖不被小官能團修飾，因此很難推測PslL的具體作用［4］。

Fig.2 Psl extracellular polysaccharide biosynthetic system圖2 Psl胞外多糖生物合成系統(tǒng)

Baker等［13］解析了PslG蛋白第31～442位氨基酸的周質(zhì)域結(jié)構(gòu)，PslG（31～442）具有糖苷水解酶活性，包含2個結(jié)構(gòu)域：N端的（β/α）8桶狀結(jié)構(gòu)中有6個大環(huán)（L1～L6），這些大環(huán)包含小的二級結(jié)構(gòu)元件，能夠連接（β/α）8折疊中的α螺旋和β折疊，形成1個長約32?的鐮刀形深槽。C端的β三明治結(jié)構(gòu)由1個小β折疊和在（β/α）8催化結(jié)構(gòu)域之后的6個β折疊組成。Wu等［41］研究表明，在PslG蛋白中，與內(nèi)膜結(jié)合部分有助于Psl的合成，周質(zhì)部分表現(xiàn)出水解活性，與Psl胞外多糖的產(chǎn)生和初始黏附有關(guān)。

2.3 外膜蛋白PslD

PslD位于細胞外膜上，與大腸桿菌莢膜轉(zhuǎn)位酶Wza結(jié)構(gòu)相似，具有八聚體結(jié)構(gòu)，存在1個大的中心腔，推測其與Wza具有相同的多糖跨膜轉(zhuǎn)運功能，可幫助Psl多糖從周質(zhì)空間轉(zhuǎn)移到細胞膜外［43］。不同之處在于，PslD具有2個周質(zhì)離散環(huán)，而Wza比它多1個，并且PslD似乎缺乏外膜的α螺旋桶狀結(jié)構(gòu)，因此在PslD具體的三維結(jié)構(gòu)被解析出來之前，對于其轉(zhuǎn)運Psl多糖通過外膜的轉(zhuǎn)運機制研究尚屬空白。此外，Wu等［41］研究表明，PslD與PslE具有很強的相互作用，這種相互作用有助于PslD在外膜上的定位。

3 Pel胞外多糖生物合成系統(tǒng)

Pel是一種由部分乙?；腘-乙酰半乳糖胺和N-乙酰葡糖胺組成的陽離子胞外多糖［44］，能夠使假單胞菌在氣-水界面形成一層薄膜，可以幫助細菌抵抗氨基糖苷類抗生素，在生物被膜基質(zhì)中發(fā)揮結(jié)構(gòu)和保護作用。參與Pel胞外多糖生物合成系統(tǒng)的7個蛋白質(zhì)由7個基因操縱子pelA、B、C、D、E、F、G編碼，其合成轉(zhuǎn)運過程如圖3所示：PelF蛋白以UDP-葡萄糖為底物將糖基轉(zhuǎn)移到Pel多糖上，PelD蛋白與c-di-GMP結(jié)合調(diào)控Pel多糖的轉(zhuǎn)運，位于內(nèi)膜的PelE和PelG幫助Pel多糖穿過內(nèi)膜，周質(zhì)中的伴侶蛋白PelA將Pel多糖修飾為成熟的陽離子多糖后，成熟的Pel多糖被PelC吸引穿過外膜的PelB桶孔最終到達細胞外。

Fig.3 Pel extracellular polysaccharide biosynthetic system圖3 Pel胞外多糖生物合成系統(tǒng)

3.1 胞內(nèi)蛋白PelF

PelF是一種糖基轉(zhuǎn)移酶，位于細胞質(zhì)中，不含跨膜螺旋，以UDP-葡萄糖為底物合成Pel多糖［45］。在CAZy數(shù)據(jù)庫中，該蛋白質(zhì)屬于GT-4家族，呈現(xiàn)GT-B折疊，并且C端含有EX7E基序［46］。E405和E413是EX7E基序中的2個保守殘基，但E413對PelF蛋白的酶活性并沒有影響。PelF還包含2個保守DXD基序，但與其他糖基轉(zhuǎn)移酶不同，這4個天冬氨酸對PelF蛋白的酶活性沒有影響。此外，K330和R325氨基酸殘基對PelF的酶活性有重要作用，可與UDP-葡萄糖磷酸根的氧原子作用形成氫鍵。

3.2 內(nèi)膜聚合物PelDEG

內(nèi)膜上的PelD、PelE和PelG蛋白組成一個三聯(lián)體復合物，參與Pel胞外多糖的跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運。Whitfield等［47］研究證明PelDEG復合物與PelF相互作用并幫助PelF定位于內(nèi)膜，但PelDEG復合物的結(jié)構(gòu)仍未知，僅有PelD胞質(zhì)域的結(jié)構(gòu)被解析。

Whitney等［14］對PelD蛋白第156～455位氨基酸的胞質(zhì)域結(jié)構(gòu)進行了研究，PelD（156～455）含4個跨膜螺旋，第4個跨膜螺旋延伸到細胞質(zhì)中，連接跨膜結(jié)構(gòu)域與可溶性細胞質(zhì)區(qū)域。N端含有1個GAF結(jié)構(gòu)域，其拓撲結(jié)構(gòu)為ααββαββα，C端為GGDEF結(jié)構(gòu)域，其拓撲結(jié)構(gòu)為αβαββαβα，二者經(jīng)一段無序的短鏈連接，形成了1個653?2的界面。在GGDEF結(jié)構(gòu)域中存在保守的RXXD基序，可作為與c-di-GMP結(jié)合的I位點。當c-di-GMP與該位點結(jié)合時，N端的GAF結(jié)構(gòu)域會發(fā)生14°旋轉(zhuǎn)，使得界面的面積從653?2減小為609?2，以調(diào)控Pel多糖的生物合成。PelE包含1個I型輸出信號單元和2個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域，這種排列使得PelE的大部分C端位于周質(zhì)空間中［48］。預測C端區(qū)域都是α螺旋，含有至少有4～5個TPR基序，可作為支架蛋白，通過與PelA和PelB相互作用，促進Pel多糖的轉(zhuǎn)運。PelG與霍亂弧菌的NorM結(jié)構(gòu)相似，預測含有12個TM結(jié)構(gòu)域，可能與MATE蛋白家族成員具有相似的功能，在Pel多糖通過內(nèi)膜的過程中發(fā)揮作用［42］。

3.3 周質(zhì)伴侶蛋白PelA

PelA是Pel多糖的伴侶蛋白，主要位于周質(zhì)空間中［49］。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，PelA含兩個主要的結(jié)構(gòu)域，N端為糖苷水解酶域（glycoside hydrolase，GH），屬于GH114家族，該區(qū)域的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析（PDB ID：5TCB），呈現(xiàn)β8/α7TIM桶狀結(jié)構(gòu)，其中有1個高度電負性的裂縫，內(nèi)表面為保守的酸性殘基，在陽離子多糖的結(jié)合中起到關(guān)鍵作用［3］。C端結(jié)構(gòu)域為碳水化合物酯酶域，表現(xiàn)出金屬依賴的脫乙酰酶活性，被證明與Pel多糖的合成直接相關(guān)。Pel多糖在周質(zhì)空間中能夠通過PelA進行脫乙?；揎棧纬沙墒斓腜el多糖。

3.4 外膜上的復合物PelBC

PelB的N端含19個連續(xù)的TPR結(jié)構(gòu)基序，可作為該系統(tǒng)中其余蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)支架［4］。Marmont等［16］研究表明，該TPR結(jié)構(gòu)域的離散區(qū)域能夠與PelA相互作用，但每個TPR基序的作用又有所不同，其中R9～R14能夠促進PelA在周質(zhì)空間中的定位，R15～R19可以作為重復的“間隔區(qū)”，引起PelA和PelC之間的空間碰撞。PelB能夠?qū)elA“招募”到外膜，并與PelA直接相互作用，誘導PelA發(fā)生構(gòu)象改變，使其脫乙酰酶活性增加，水解酶活性降低，使得Pel多糖更有效的脫乙酰化。Marmont等［17］經(jīng)實驗證明，PelB的C端為跨膜β桶狀結(jié)構(gòu)，預測由16個β鏈組成，負責將Pel多糖轉(zhuǎn)運到膜外。C端β桶結(jié)構(gòu)域和N端TPR結(jié)構(gòu)域之間是一段約120個殘基的連接區(qū)域，其具體的結(jié)構(gòu)還無法預測，推測這段結(jié)構(gòu)穿過PelC的中間孔，并與其相互作用。

PelC為外膜脂蛋白，位于外膜的內(nèi)側(cè)。Marmont等［17］解析了PelC的結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明PelC單體為混合的α/β折疊，在體內(nèi)形成中心約30?孔隙的十二環(huán)狀聚合物。該聚合物類似于1個沒有柄的“漏斗”，凸面靠近細胞外膜，與磷脂的電負性基團相互作用。N端的149位色氨酸保守殘基在孔內(nèi)聚合形成1個芳香帶，負責將PelC聚合物錨定在外膜上。而PelC的凹面呈高度電負性，負責將帶正電荷的Pel多糖吸附到“漏斗”內(nèi)部，將其引導進入PelB的β桶中，并將其轉(zhuǎn)運到細胞膜外，參與假單胞菌生物被膜的構(gòu)筑。

4 總結(jié)與展望

假單胞菌被視為研究生物被膜的模式菌株，褐藻膠、Psl和Pel胞外多糖是假單胞菌生物被膜的重要組成部分，能夠幫助細菌細胞抵抗外界的不利條件，其合成和轉(zhuǎn)運依賴于對應(yīng)的褐藻膠、Psl和Pel胞外多糖生物合成系統(tǒng)。本文系統(tǒng)地總結(jié)了這3種系統(tǒng)相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學的研究進展，在微觀層面闡述了這些系統(tǒng)的相關(guān)功能，可為假單胞菌胞外多糖合成、轉(zhuǎn)運和分泌的進一步研究奠定扎實的理論基礎(chǔ)，并為進一步揭示細菌生物被膜的形成機制提供新的視野及思路?；谝陨霞賳伟舛嗵巧锖铣上到y(tǒng)的研究現(xiàn)狀，本文對其未來的研究方向提出以下兩點展望。

4.1 解析相關(guān)膜蛋白及復合物的未知結(jié)構(gòu)和功能

在目前已經(jīng)解析的假單胞菌胞外多糖生物合成系統(tǒng)的三維結(jié)構(gòu)中，除了AlgE之外，大多數(shù)研究均集中于可溶性蛋白、或者膜蛋白的可溶部分，對于這3種系統(tǒng)相關(guān)膜蛋白的研究還相對較少，尤其缺乏膜蛋白復合物的研究，極大限制了人們對于這些生物合成系統(tǒng)作用機制的理解。因此，未來研究應(yīng)著重針對膜蛋白及膜蛋白復合物的未知結(jié)構(gòu)和功能展開，以明晰此類系統(tǒng)的分子機理及生命調(diào)控過程，揭示胞外多糖的生物合成與假單胞菌生物被膜形成之間復雜的相互作用關(guān)系，為假單胞菌生物被膜形成機制的研究奠定理論基礎(chǔ)。

4.2 研發(fā)靶向于胞外多糖生物合成系統(tǒng)的新型抗生物被膜制劑

生物被膜是假單胞菌抵抗外界不利條件的保護屏障，胞外多糖在該保護屏障中起著結(jié)構(gòu)支撐作用，其合成轉(zhuǎn)運依賴胞外多糖生物合成系統(tǒng)。若針對性地破壞這些蛋白質(zhì)的活性，能夠有效阻斷胞外多糖合成轉(zhuǎn)運過程，從根本上控制細菌生物被膜的形成。雖然目前已有多種抗生物被膜制劑被陸續(xù)研發(fā)，但僅停留于破壞胞外多糖、胞外蛋白和胞外DNA的層面［50］。胞外多糖生物合成系統(tǒng)的存在，將不斷地為細菌輸送新合成的胞外多糖，導致細菌生物被膜的再次形成。因此，未來新型抗生物被膜制劑的研究，可基于胞外多糖生物合成系統(tǒng)設(shè)計靶向控制策略，從源頭上徹底清除細菌生物被膜。