戴和森，周大勇，劉穎

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 安徽合肥 230038

2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230038

重癥肺炎是一類由社區(qū)獲得性肺炎或醫(yī)院獲得性肺炎進行性發(fā)展而來，最終導(dǎo)致以肺部損害為主的多臟器功能衰竭的呼吸系統(tǒng)危重疾病[1-2]，患者一般表現(xiàn)為高熱、意識模糊、低血壓等，病情嚴重時常伴有膿毒癥休克、呼吸衰竭、多器官功能障礙等危重癥狀。作為ICU常見的危重疾病，對重癥肺炎主要現(xiàn)代醫(yī)學(xué)以抗感染、營養(yǎng)支持、機械通氣等對癥治療為主[3]，但也產(chǎn)生了抗生素耐藥、菌群失調(diào)、免疫功能低下等副作用，且病死率仍居高不下。重癥肺炎屬于中醫(yī)學(xué)“風(fēng)溫肺熱病”“喘證”，中西醫(yī)結(jié)合治療對于緩解重癥肺炎并發(fā)癥、提高患者生存質(zhì)量、減少患者治療肺炎等方面存在巨大優(yōu)勢[4]。黃芩味苦， 性寒，有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎的功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芩中含有的黃酮類成分具有很好的解熱、抗炎、抗菌抗病毒、免疫調(diào)節(jié)功效[5-8]。連翹味苦，性微寒，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱等功效，現(xiàn)代藥理研究表明，連翹中主要成分具有很好的抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化等功效[9-11]。黃芩-連翹配伍在中藥及中成藥處方中都有體現(xiàn)，如葛根芩連湯、雙黃連口服液、牛黃上清丸等，也是治療重癥肺炎的常用藥物組合。

與西藥單成分、單靶點不同，中藥作用往往是多成分、多靶點、調(diào)節(jié)方式多樣，所以采用西藥研究思維很難科學(xué)地解釋中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和組方規(guī)律[12]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)旨在從相互關(guān)聯(lián)及關(guān)聯(lián)強度的角度研究問題[13]，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對中藥處方治療疾病的研究有獨特的優(yōu)勢和巨大潛力。為更全面地探討黃芩-連翹藥對治療重癥肺炎的作用機制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建、分析藥物-基因-疾病網(wǎng)絡(luò)和靶點蛋白交互作用（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)。利用分子對接方法驗證藥物活性成分與重癥肺炎相關(guān)靶點的結(jié)合活性，驗證治療重癥肺炎的可能性，為后續(xù)深入研究提供參考依據(jù)。

材料與方法

1 黃芩-連翹成分及作用靶點篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺[14]（TCMSP，https：//tcmspw.com）對黃芩、連翹的主要化學(xué)成分及其藥物動力學(xué)性質(zhì)進行評估。 “Herb Name”以“黃芩”“連翹”作為關(guān)鍵詞，選取口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30% 和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18的化學(xué)成分作為候選活性成分。再通過TCMSP數(shù)據(jù)庫得到藥物的潛在靶點，借助蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Uniprot，https：//www.uniprot.org/），限定物種為“Homo sapiens”，將所得的靶點信息標(biāo)準化，獲取靶點的基因名。

2 疾病靶點和藥物作用靶點

利 用 GeneCards數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.genecards.org/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）檢索關(guān)鍵詞為“Severe pneumonia”，刪除重復(fù)靶點后獲得重癥肺炎相關(guān)靶點。運用Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線作圖工具繪制藥物-疾病靶點的韋恩圖，取交集作為潛在治療靶點。

3 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將黃芩-連翹藥對篩選出的候選化合物及藥物與疾病共同靶點上傳至Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建復(fù)藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，并對網(wǎng)絡(luò)的拓撲屬性進行分析，預(yù)測中藥主要活性成分。

4 靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

篩選得到共同靶點導(dǎo)入到String數(shù)據(jù)庫（https：//www.string-db.org/）中，設(shè)定物種為“homosapiens”，最低相互作用得分＞0.4，獲取蛋白相互作用TSV文件，將文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，并通過網(wǎng)絡(luò)拓撲值選出核心靶點。

5 基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析

利用R軟件Bioconductor軟件包中“org.Hs.eg.db”功能，將交集靶點轉(zhuǎn)換成enterzID。然后利用“cluster Profiler”包，導(dǎo)入轉(zhuǎn)換的 enterzID，以P-value＜0.05為條件對交集基因進行基因本體（geneontology， GO）功能和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，分析黃芩-連翹治療重癥肺炎的生物學(xué)過程（BP，Biological Process）、組成（CC， Cellular Component）、分子功能（MF， Molecular Function）和信號通路，并將富集結(jié)果前15位以氣泡圖形式可視化呈現(xiàn)。

6 成分-靶點分子對接驗證

通過化合物商業(yè)數(shù)據(jù)庫（ZINC，http：//zinc.docking.org/）檢索核心活性成分pdb格式作為受體，通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB，https：//www.rcsb.org/）獲取關(guān)鍵靶點的pdb格式文件作為配體，使用Autodock 1.5.6軟件對受體和配體分子進行去水、加氫處理，計算受體與配體結(jié)合能，使用R軟件“pheatmap”包對結(jié)合能以可視化呈現(xiàn)，使用Pymol軟件對配體和受體結(jié)合可視化呈現(xiàn)。

結(jié) 果

1 中藥的活性成分和潛在靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選共得到黃芩中的活性成分39個，潛在靶點118個；連翹活性成分23個，潛在靶點213個。

2 疾病靶點和中藥作用靶點

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫，獲取重癥肺炎相關(guān)靶點2477個。將中藥靶點和重癥肺炎相關(guān)靶點導(dǎo)入Venny2.1在線作圖工具，獲得中藥-疾病靶點的韋恩圖，見圖1，由圖可知，黃芩、連翹之間相同靶點為90個，黃芩與重癥肺炎有78個交集靶點，連翹與重癥肺炎有149個交集靶點。

圖1 中藥-疾病靶點韋恩圖

3 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

建立中藥活性成分及靶點信息的Network文件和Type文件，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖2，可得到一張Nodes為212（其中中藥成分節(jié)點51個）、Edges為1701的網(wǎng)絡(luò)。通過網(wǎng)絡(luò)拓撲屬性分析，見表1，中藥成分網(wǎng)絡(luò)度值（Degree）前10位成分分別為：槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）、漢黃芩素（wogonin）、黃岑黃素（baicalein）、beta- 谷甾醇（beta-sitosterol）、金合歡素（acacetin）、蘇薺苧黃酮（Moslosooflavone）、千層紙素 A（oroxylin a）、黃芩黃酮（rivularin），這些成分與重癥肺炎的交集靶點較多，推測這些成分可能為重癥肺炎治療的關(guān)鍵成分。

表1 中藥成分度值前15

圖2 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

4 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

將160個共同靶點錄入String數(shù)據(jù)庫，獲取蛋白之間相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)TSV文件，將文件導(dǎo)入cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)通過拓撲屬性分析網(wǎng)絡(luò)度值（Degree）、介度中心性（Betweenness Centrality，BC）和緊密中心性（Closeness Centrality，CC），進而篩選出核心靶點，見圖3。節(jié)點網(wǎng)絡(luò)度值前15如表2所示，其中AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF節(jié)點度值較高，推測這些靶點可能是黃芩-連翹治療重癥肺炎的關(guān)鍵靶點。

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)度值前15

圖3 黃芩-連翹治療重癥肺炎PPI網(wǎng)絡(luò)圖

5 潛在靶點富集分析

將160個潛在靶點經(jīng)R語言運行后共獲得2702條GO富集功能，其中2473個生物過程，見圖4-A，主要與對氧化應(yīng)激反應(yīng)、對脂多糖反應(yīng)、對細菌來源反應(yīng)、對藥物反應(yīng)等相關(guān)。302個細胞組分，見圖4-B，主要包括膜筏、膜微孔、膜區(qū)、囊泡腔等。57個分子功能，見圖4-C，主要涉及信號受體激活劑、受體配體活性、細胞因子受體結(jié)合等。KEGG分析共富集于244條信號通路，見圖4-D，主要與白細胞介素-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、C型凝集素受體信號通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、病毒感染、癌癥通路等途徑相關(guān)。

圖4 GO生物學(xué)過程（A）、細胞組分（B）、分子功能（C）和KEGG富集分析（D）

6 分子對接結(jié)果

選取黃芩-連翹治療重癥肺炎網(wǎng)絡(luò)度值前10位中藥成分：槲皮素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素、黃岑黃素、beta-谷甾醇、金合歡素、蘇薺苧黃酮、千層紙素A、黃芩黃酮，與PPI網(wǎng)絡(luò)圖度值前5的靶點進行對接，分子對接靶點為： AKT1（PDB ID：1UNQ）、IL6（PDB ID：4O9H）、TP53（PDB ID：1AIE）、VEGFA（PDB ID：1MKK）、TNF（PDB ID：5UUI），對接結(jié)果見圖 5。

一般認為結(jié)合能＜-4.25 kcal·mol-1提示配體與受體有一定的結(jié)合活性，＜-5.0 kcal·mol-1有較好的結(jié)合活性，＜-7.0 kcal·mol-1有強烈的結(jié)合活性[15]。結(jié)合圖5可知，所有成分與靶點結(jié)合能均＜-5.0 kcal·mol-1，其中beta-谷甾醇除IL-6外與靶點結(jié)合能 ＜-7.0 kcal·mol-1，結(jié)合能強烈。用 PyMOL 軟件以熊果酸為例對成分與靶點對接結(jié)果進行可視化展示，見圖6。

圖5 黃芩-連翹治療重癥肺炎的主要活性成分與主要靶點結(jié)合能熱圖

圖6 beta-谷甾醇成分與靶點對接結(jié)果

討 論

本次研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接研究方法，利用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)找出黃芩-連翹活性化學(xué)成分60個，潛在靶點241個，其中與重癥肺炎交集靶點160個，發(fā)揮作用的中藥活性成分50種，GO富集分析共2702條，KEGG分析共244條，分子對接表明主要活性成分與重癥相關(guān)靶點具有穩(wěn)定的結(jié)合活性。

通過對黃芩-連翹治療重癥肺炎的藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)網(wǎng)絡(luò)分析，活性較高的成分為：槲皮素、木犀草素、山奈酚等，相關(guān)研究表明槲皮素通過抑制寡聚物的形成，顯著降低了肺炎球菌溶血素（Pneumolysin，PLY）誘導(dǎo)的溶血活性和細胞毒性，減少PLY介導(dǎo)的細胞損傷，提高感染致命劑量肺炎雙球菌的小鼠的存活率，減輕肺組織的病理損傷，抑制支氣管肺泡灌洗液中細胞因子（IL-1β和TNF-α）的釋放[16]。此外，槲皮素通過促進細胞氧化應(yīng)激，以及通過激活犬尿氨酸途徑減少局部L-色氨酸的可用性來限制細菌生張[17]。木犀草素可以通過抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的BEAS-2B細胞中miR-132的表達從而減少細胞凋亡和炎癥細胞因子的表達，從而減少LPS誘導(dǎo)的炎癥性損傷[18]。山奈酚可有抑制炎癥細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和PGE2的表達，改善肺部水腫，同時還可抑制NFκB和MAP激酶的磷酸化，在體外和體內(nèi)發(fā)揮抗炎作用[19]。

PPI網(wǎng)絡(luò)顯示，黃芩-連翹藥對的活性成分主要通過作用于 AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF等靶點發(fā)揮治療重癥肺炎的作用。Akt1與細胞代謝、生存遷移和基因表達有關(guān)，當(dāng)機體發(fā)生急性炎癥時，Akt1可以通過調(diào)節(jié)血管通透性，導(dǎo)致水腫和白細胞外滲[20]。IL-6作為多功能炎性細胞因子，是炎性介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成份，IL-6過度合成則會導(dǎo)致“細胞因子風(fēng)暴”[21]。TP53 是重要的抑癌基因，在調(diào)節(jié)細胞生長、細胞凋亡和 DNA 修復(fù)中發(fā)揮重要作用[22]。VEGFA是一種強效的血管生成和血管通透性因子，其水平與炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)皮通透性呈正相關(guān)[23]。TNF-α能夠通過促進caspase-3活化發(fā)揮肺泡上皮細胞凋亡促進作用，從而造成肺泡上皮細胞損傷[24]。

通過分析預(yù)測黃芩-連翹藥治療重癥肺炎的通路發(fā)現(xiàn)，該藥對主要是通過影響IL-17通路、TNF通路等發(fā)揮作用。相關(guān)研究表明，IL-17的過度表達可以使中性粒細胞大量匯聚及炎癥因子分泌，激活炎癥反應(yīng)，造成肺泡內(nèi)皮損傷及組織通透性增加[25]。此外，IL-17的血清含量與急性肺損傷患者的病情嚴重程度及疾病預(yù)后都呈正相關(guān)[26]。TNF-α是由巨噬細胞分泌的炎性因子[27]，與各類炎癥反應(yīng)及血管內(nèi)皮通透性有關(guān)，臨床上使用阻斷TNF-α作用的藥物治療干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和克羅恩病等炎癥相關(guān)疾病，說明了TNF在炎癥中的核心作用[28]。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法，初步對黃芩-連翹藥對的活性化合物、潛在的治療靶點及治療重癥肺炎的分子機制進行探討，為下一步研究提供參考。