呂彩蘭，楊楠，陳靜，李玉霞

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 甘肅蘭州 730020

小兒厭食癥[1]（Infantile anorexia，IA）是好發(fā)于兒童各個年齡階段的一種慢性食欲障礙性疾病，1～6歲兒童多見。研究報道[2]12%～34%兒童具有不同程度的厭食狀態(tài)。IA的機(jī)制復(fù)雜多樣，目前相關(guān)研究[3]發(fā)現(xiàn)其發(fā)生機(jī)制與消化酶活性、食欲調(diào)節(jié)中樞、攝食調(diào)節(jié)關(guān)鍵區(qū)域功能、食欲調(diào)節(jié)因子分泌異常具有相關(guān)性。西醫(yī)主要[4]以補(bǔ)充微量元素、調(diào)節(jié)腸道菌群、心理疏導(dǎo)及促進(jìn)腸道治療為主。中醫(yī)認(rèn)為小兒脾常不足，IA多是由喂養(yǎng)不當(dāng)致脾胃功能失職失調(diào)所致，其根本病機(jī)為脾運失健、胃納失常。全國名中醫(yī)張士卿教授認(rèn)為，IA病位在中焦，脾胃虛弱之時兼有食積、中焦氣滯、濕困熱郁等。蒼術(shù)歸脾胃、肝經(jīng)，具有燥濕健脾之功，尤適宜濕阻中焦之證；白術(shù)歸脾胃經(jīng)，有益氣健脾、燥濕利水之效，尤適脾虛濕滯之證。《玉楸藥解》曰：“白術(shù)守而不走，蒼術(shù)走而不守，故白術(shù)善補(bǔ)，蒼術(shù)善行”。故，張教授[5]常用蒼術(shù)-白術(shù)相配一散一補(bǔ)、一胃一脾，使中焦健運、脾胃受納，從而使水谷精微代謝正常，以消疾患。因此，為進(jìn)一步探討蒼術(shù)-白術(shù)藥對防治IA的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討其潛在作用機(jī)制。

材料與方法

1 數(shù)據(jù)庫及軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）；通用蛋白質(zhì)（UniProt）數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）；人類基因（GeneCards）數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.genecards.org/）；R 語 言 軟 件（https：//www.r-project.org/）；Perl軟 件（https：//www.perl.org/）；蛋白質(zhì)互作平臺 （STRING 11.0）（https：//string-db.org/）；網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治鲕浖–ytoscape 3.8.0）（https：//cytoscape.org/）；Bioconductor （https：//www.bioconductor.org/）。

2 藥物活性成分及作用靶點檢索

以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件在TCMSP篩選蒼術(shù)、白術(shù)的化學(xué)成分，并在TCMSP數(shù)據(jù)庫預(yù)測中藥活性成分作用的潛在靶點。在UniProt數(shù)據(jù)庫對預(yù)測獲得的活性成分作用靶點進(jìn)行校正。

3 疾病靶點的檢索

在GeneCards數(shù)據(jù)庫以“infantile anorexia”為關(guān)鍵詞檢索獲取已被研究證實的小兒厭食癥疾病靶點。

4 藥物與疾病共同靶點篩選

采用R語言軟件篩選藥物與疾病共同靶點，并以韋恩圖可視化展示。

5 藥物成分與疾病靶點互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape 3.8.3軟件構(gòu)建蒼術(shù)-白術(shù)藥對活性成分與疾病靶點互作網(wǎng)絡(luò)。

6 共同靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

共同靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的建立采用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫完成，并利用R語言軟件對PPI進(jìn)行可視化分析。

7 基因本體（Gene Ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析

采用R語言軟件對共同靶點進(jìn)行GO與KEGG富集分析。通過GO分析獲得共同靶點的生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF），并以氣泡圖形式展示；通過KEGG富集分析獲得共同靶點富集的通路，并以氣泡圖形式展示。

結(jié) 果

1 藥物活性成分及作用靶點獲取

以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選條件在TCMSP數(shù)據(jù)庫共檢索蒼術(shù)-白術(shù)藥物活性成分5種見表1；藥物活性成分靶點86個，經(jīng)UniProt矯正后獲取藥物靶點37個，見表2。

表1 藥物活性成分

表2 藥物靶點

2 疾病靶點檢索及藥物與疾病共同靶點篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索疾病靶點共920個，采用R語言軟件篩選藥物與疾病共同靶點15個，見表3；并繪制韋恩可視化展示，見圖1。

圖1 疾病與藥物共同靶點韋恩可視化

表3 藥物與疾病共同靶點

3 構(gòu)建藥物活性成分與共同靶點互作網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 3.8.3構(gòu)建藥物成分與共同靶點互作網(wǎng)絡(luò)，并依據(jù)degree值對靶點的重要性可視化展示，見圖2。

圖2 藥物成分-共同靶點互作網(wǎng)絡(luò)

4 PPI構(gòu)建及可視化分析

PPI構(gòu)建見圖3，并用R語言軟件對其可視化展示發(fā)現(xiàn)degree值較高（≥6）的蛋白包括周期蛋白1（CyclinD1，CCND1）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3（ Cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）、白介素 -6（Interleukin 6，IL-6）、糖原合酶激酶 3β（glycogen synthase kinase 3β，MAPK1）、骨髓細(xì)胞白血病 1（myeloid cell leukemia-1， MCL1）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-9（ Cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase-9）等，見圖 4。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI可視化分析

5 GO分析及KEGG富集分析

通過 GO 分析最終獲得共同靶點參與qvalue＜0.05的生物學(xué)過程（biological process，BP）包括對類固醇激素的反應(yīng)（response to steroid hormone）、缺乏配體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction in absence of ligand）、在沒有配體的情況下的外在凋亡信號通路（extrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand）、外在凋亡信號通路（extrinsic apoptotic signal-ing pathway）、對糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)（response to glucocorticoid）、對皮質(zhì)類固醇的反應(yīng)（response to corticosteroid）、神經(jīng)元死亡（neuron death）等 834個，參與qvalue＜0.05的細(xì)胞組分（cellular component，CC）包括線粒體外膜（mitochondrial outer membrane）、細(xì)胞器外膜（organelle outer membrane）、外膜（outer membrane）等3個、參與qvalue＜0.05的分子功能（molecular function， MF）包括核受體活性（nuclear receptor activity）、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接由配體調(diào)控的序列特異性DNA 結(jié) 合（transcription factor activity， direct ligand regulated sequence-specific DNA binding）、類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）、p53結(jié)合（p53 binding）、死亡域結(jié)合（death domain binding）、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程（cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process）、蛋白酶結(jié)合（protease binding）、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（RNA polymerase II transcription factor binding）、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶調(diào)節(jié)劑活性（cyclin-dependent protein serine/threonine kinase regulator activity）等77個，以qvalue大小為依據(jù)，取前10個BP、CC、MF結(jié)果用氣泡圖形式展示，見圖5；通過KEGG 富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)共同靶點富集參與的通路包括麻疹（Measles）、p53信號通路（p53 signaling pathway）、大腸癌（Colorectal cancer）、前列腺癌（Prostate cancer）、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、小 細(xì) 胞 肺 癌（Small cell lung cancer）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、EB病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、凋亡-多種（Apoptosis- multiple species）等71條通路，以qvalue大小為依據(jù)，取前30條通路以氣泡圖形式展示，見圖6。通過GO分析與KEGG富集分析可見蒼術(shù)-白術(shù)有效活性成分與疾病靶點有潛在的結(jié)合活性，可進(jìn)一步推測蒼術(shù)-白術(shù)藥對防治小兒多動癥的機(jī)制。

圖5 GO分析

圖6 KEGG富集分析

討 論

《靈樞·脈度》記載“脾氣通于口，脾和則口能知五谷矣”，《諸病源候論·脾胃病諸侯》曰：“脾者臟也，胃者腑也，脾胃二氣，相為表里，胃為水谷之海，主受盛飲食者也；脾氣磨而消之，則能食。今脾胃二氣俱虛弱，故不能飲食也”，可見脾氣健則食欲強(qiáng)，脾氣虛則水谷不化，不知五味。中醫(yī)學(xué)[6]認(rèn)為，治療IA重在辨證論治，強(qiáng)調(diào)調(diào)和脾胃。蒼術(shù)雖是燥濕健脾，但重在行氣；白術(shù)則益氣健脾，重在補(bǔ)氣。二者相配，一行一補(bǔ)，則補(bǔ)而不滯。全國名中醫(yī)張士卿教授在臨床應(yīng)用蒼術(shù)-白術(shù)藥對治療IA效果顯著。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蒼術(shù)-白術(shù)藥對治療IA的主要靶點為CCND1、Caspase-3、IL-6、MAPK1、MCL1、Caspase-9、BCL2 等。Caspase 是一類存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵的作用，活化的caspase-3、Caspase-9蛋白是細(xì)胞凋亡標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)[7-8]新生大鼠腸道損傷后BCL2蛋白表達(dá)水平下調(diào)，而活化的Caspase-3、Caspase-9表達(dá)水平升高；研究發(fā)現(xiàn)[9]通過改善血清IL-6水平可調(diào)節(jié)腸道屏障功能，從而有效改善患兒腹瀉、腹痛等，亦有發(fā)現(xiàn)表明[10]血清IL-6、TNF-α的表達(dá)水平與腸道菌群平衡具有相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)-白術(shù)藥對干預(yù)的潛在信號通路可能是麻疹、p53信號通路、大腸癌、前列腺癌、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、小細(xì)胞肺癌（Small cell lung cancer）、PI3K-Akt信號通路、EB病毒感染、凋亡-多種等信號通路。研究發(fā)現(xiàn)[11-12]PI3K/AKT/e NOs信號通路可能大鼠慢傳輸型便秘的發(fā)病中扮演重要作用，在慢傳輸型便秘模型大鼠結(jié)腸中PI3K、AKT mRNA及蛋白表達(dá)水平較高，通過調(diào)控PI3K、AKT mRNA及蛋白表達(dá)水平可顯著改善腸道蠕動功能、改善便秘。因此本研究推測PI3K-AKT信號通路可能在IA中扮演重要作用。研究發(fā)現(xiàn)[13]蒼術(shù)提取物對脾虛證大鼠胃粘膜損害及免疫功能具有改善作用；亦有研究發(fā)現(xiàn)[14]復(fù)方蒼術(shù)方可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)對腸道微環(huán)境具有改善作用。研究發(fā)現(xiàn)[15-16]，白術(shù)通過調(diào)節(jié)胃腸道的腸神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸激素及神經(jīng)遞質(zhì)的機(jī)制具有促進(jìn)胃排空及小腸推進(jìn)、抑制胃腸道運動等作用；除此之外，白術(shù)亦具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、修復(fù)胃腸道黏膜損傷及抗炎的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)-白術(shù)藥對可能是通過作用于相關(guān)通路與關(guān)鍵靶點蛋白，通過調(diào)節(jié)腸道菌群、改善腸道動力、修復(fù)胃腸道黏膜損及抗炎等機(jī)制防治IA。