洪晨忱，姚峰

0 引言

據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)統(tǒng)計，2020年女性乳腺癌已超越肺癌成為全球最常見的癌癥，約有230萬新發(fā)病例，占所有癌癥新發(fā)病例的11.7%。在2020年度的癌癥死亡主要原因中女性乳腺癌僅次于肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌排名第五位[1]。腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes,TILs）是一種浸潤腫瘤組織的淋巴細胞群體，乳腺癌中的TILs主要包含T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞（natural killer cell,NK）等免疫型細胞，TILs按分布位置可以分為腫瘤內(nèi)TILs（intratumoral tumor infiltrating lymphocytes,iTILs）和間質(zhì)TILs（stromal tumor infiltrating lymphocytes,sTILs）。多項研究表明，相比iTILs，sTILs數(shù)量更多，更易于觀察測量，且重復性和穩(wěn)定性更好，更有研究意義，因此國際免疫生物標志物協(xié)作組推薦以 sTILs作為試驗研究和臨床應(yīng)用的主要指標[2]。體外研究證實了從乳腺癌組織中分離出的TILs對腫瘤具有殺傷作用[3-5]，CD8（+）和CD4（+）T細胞在識別獨特的腫瘤抗原中也發(fā)揮著作用[2-5]。目前需要進一步明確TILs與乳腺癌的預(yù)后及免疫治療的關(guān)系。

研究表明，TILs 更常見于三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）和HER2+乳腺癌[6]，且高水平TILs與TNBC和HER-2過表達型乳腺癌的良好預(yù)后相關(guān)[7]，但TILs與Luminal型乳腺癌之間的預(yù)后關(guān)系尚存在爭議[3,6,8]。因此，本文擬綜述TILs在不同分子分型乳腺癌中的基礎(chǔ)研究進展和臨床應(yīng)用現(xiàn)狀，評估TILs對乳腺癌預(yù)后判斷及臨床免疫治療的價值。

1 乳腺癌中TILs的特征及檢測進展

T淋巴細胞是TILs中占比最高的淋巴細胞，高達75%。目前研究表明，TILs是影響乳腺癌預(yù)后的關(guān)鍵因素之一，而CD8（+）T細胞是TILs影響乳腺癌預(yù)后的關(guān)鍵因素[2]。主要原因在于CD8（+）TILs包含組織駐留記憶T細胞（tissue-resident memory T,TRM）亞群，TRM細胞在外周免疫監(jiān)測和病毒免疫中發(fā)揮重要作用[9]，且TRM細胞水平較高的晚期乳腺癌患者對免疫治療的反應(yīng)率也更高[4]。另有研究表明，TILs中的B細胞也對乳腺癌的臨床結(jié)局有一定影響[10]，這很可能與TILs中的B細胞水平及其空間分布有關(guān)，TILs中的B細胞分布越分散，則預(yù)后越好；分布越局限，則預(yù)后越差[11]。NK細胞由于數(shù)量極少，對預(yù)后的影響幾乎可以忽略不計[5]。

檢測TILs通常采用的方法是將組織切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色，再通過不同淋巴細胞的典型特征或免疫組織化學（immunohistochemistry,IHC）進一步區(qū)分[12]?，F(xiàn)階段多重免疫組織化學（multiplex immunohistochemistry,mIHC）也被應(yīng)用于TILs檢測，實現(xiàn)在單一組織切片上同時檢測多個抗體，進而對不同TILs亞群進行識別與定位[13]。此外，組織芯片或組織微陣列技術(shù)（tissue microarray,TMA）、基于多光子顯微技術(shù)（multiphoton microscopy,MPM）的腫瘤浸潤淋巴細胞評分法（tumor-infiltration lymphocyte score,TILs-score）等新技術(shù)也在逐步發(fā)展、成熟過程中，新技術(shù)借助計算機輔助完成對TILs的檢測，可以有效減少染色和其他人為操作對結(jié)果的影響[14]。

2 TILs對于不同分子分型乳腺癌預(yù)后的影響

根據(jù)雌激素受體（estrogen receptor,ER）、孕激素受體（progesterone receptor,PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor,HER-2）的表達情況，可將乳腺癌分為四種分子亞型：Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達型和Basal-like型，其中Luminal B型又可依據(jù)HER-2狀態(tài)分為Luminal B（HER2+）型和Luminal B（HER2-）型[15]。其中TNBC和HER2+乳腺癌中TILs浸潤水平更高[6]。

Kolberg-Liedtke等[16]在前瞻性WSG PLANB試驗中比較了2 517例HER2-的中等風險早期乳腺癌（early breast cancer,EBC）患者TILs水平與無病生存期（disease-free survival，DFS）的關(guān)系，結(jié)果顯示在TNBC中高TILs水平患者的DFS顯著高于中等TILs水平的患者，雖然低TILs水平的患者DFS也高于中等TILs患者，但僅有臨界意義；Luminal-HER2-的患者TILs水平與DFS無關(guān)聯(lián)。Denkert等[7]研究了3 771例接受新輔助化療的原發(fā)性乳腺癌患者TILs水平與DFS和總生存期（overall survival,OS）之間的關(guān)系，結(jié)果提示TILs水平與TNBC患者的DFS和OS、HER2+患者的DFS正相關(guān)，與HER2+患者的OS以及Luminal-HER2-乳腺癌的DFS無關(guān)聯(lián)，但與Luminal-HER2-乳腺癌的OS負相關(guān)，即低TILs水平與Luminal-HER2-乳腺癌預(yù)后改善有關(guān)。Criscitiello等[17]對987例早期ER+且HER2-乳腺癌的單機構(gòu)病例隊列進行了回顧性分析，TILs設(shè)為連續(xù)變量，主要結(jié)果是遠端無病生存期（distant disease-free survival,DDFS），在單因素Cox回歸分析中，TILs表達與DDFS無關(guān)；在接受輔助化療（adjuvant chemotherapy）的患者中，高TILs與更好的DDFS相關(guān)。

以上研究顯示，TILs水平對不同分子亞型乳腺癌預(yù)后的影響不同。對于TNBC及HER-2過表達型乳腺癌，高TILs預(yù)示著良好預(yù)后。對于Luminal型乳腺癌，TILs水平與Luminal-HER2+的預(yù)后正相關(guān)，與Luminal-HER2-的DFS無關(guān)但與OS負相關(guān)，即低TILs水平與Luminal-HER2-乳腺癌良好預(yù)后相關(guān)。

此外，Denkert等[7]對6個新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy,NAC）隨機試驗中接受治療的乳腺癌患者的TILs綜合評估顯示：在所有乳腺癌亞型中TILs水平與病理完全緩解率（pathologic complete response,pCR）都顯著正相關(guān)，即NAC前穿刺活檢標本中TILs水平越高，化療后pCR率越高，這說明TILs可增加乳腺癌NAC的反應(yīng)。Wang等[18]對13 100例患者的TILs與化療pCR率及生存結(jié)局的關(guān)系進行Meta分析表明，高TILs水平與較長的DFS和OS顯著相關(guān)，TILs水平的增加預(yù)示著化療的pCR率和生存率的提高。在TNBC中，高水平TILs對pCR率的改善更為明顯[19]。基于TILs對于乳腺癌預(yù)后判斷的重要價值，中國臨床腫瘤學會（CSCO）2022年乳腺癌診療指南建議，對于未經(jīng)新輔助治療的乳腺浸潤性癌患者，病理學報告應(yīng)新增對TILs的評估。推薦報告腫瘤區(qū)域間質(zhì)部分TILs（%），即單個核細胞浸潤的面積占間質(zhì)面積的百分比，且僅評估單核細胞（淋巴細胞和漿細胞），暫不建議對粒細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞進行定量評估[20]。

3 TILs用于乳腺癌的免疫治療

癌癥的免疫治療是指通過激活人體本身的免疫系統(tǒng)，使機體依靠自身免疫機制殺滅癌細胞。程序性死亡配體1（programmed cell death-ligand 1,PD-L1）是一種腫瘤細胞表面的跨膜蛋白，程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1,PD-1）是一種由活化的T淋巴細胞表達的抑制性蛋白，PD-L1通過與PD-1結(jié)合來下調(diào)抗癌免疫反應(yīng)，從而減少癌細胞凋亡并增加免疫逃逸。靶向PD-1/PD-L1的免疫療法，即免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors,ICIs），主要通過阻斷 PD-1與PD-L1的結(jié)合，誘導癌細胞凋亡并破壞免疫逃逸系統(tǒng)，達到殺傷腫瘤的目的[21]。TONIC試驗[22]和KEYNOTE-355試驗[23]驗證了抗PD-1或抗PD-L1的單抗對于TNBC治療的有效性，3期IMPassion130試驗[24]則表明，在轉(zhuǎn)移或局部晚期TNBC患者的一線治療中加入抗PD-L1的阿替利珠單抗（atezolizumab）和標準化療（白蛋白紫杉醇），可使PD-L1陽性腫瘤患者的總生存期延長7個月。這些研究顯示了ICIs在TNBC治療領(lǐng)域的巨大前景。隨著抗PD-1的帕博利珠單抗（pembrolizumab）、抗PD-Ll的阿替利珠單抗等ICIs陸續(xù)出現(xiàn)，免疫治療正在改變TNBC的治療格局，迄今為止在許多國家阿替利珠單抗已被批準用于晚期TNBC的治療，2021年帕博利珠單抗也在美國獲批用于TNBC的治療[25]。

TILs與PD-L1的檢測及ICIs療效的評估密切相關(guān)，IMPassion130試驗證明TILs水平可以預(yù)測PD-L1陽性腫瘤患者的ICIs療效[24]。在2021年美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò) (National Comprehensive Cancer Network,NCCN）第4版乳腺癌指南中建議，對擬使用阿特珠單抗聯(lián)合白蛋白紫杉醇的TNBC患者進行TILs上PD-L1表達的檢測，并將PD-L1陽性表達的閾值界定為≥1%[26]。近期研究表明許多腫瘤對ICIs無反應(yīng)與缺乏TILs浸潤有關(guān)。通過刺激TILs浸潤將這些免疫“冷”腫瘤轉(zhuǎn)化為“熱”腫瘤，可以使癌細胞對ICIs產(chǎn)生反應(yīng)的概率增加。而通過誘導炎性反應(yīng)細胞凋亡來增加自身抗原的釋放和局部免疫反應(yīng)可以有效增加TILs浸潤，是一種尚在被探索的方式[27]。

TILs應(yīng)用于乳腺癌的免疫治療還存在另外一條途徑，即細胞免疫療法（cellular immunotherapy,CI），是一種基于將免疫細胞提取、修飾和再注入患者體內(nèi)的全新治療方式，有望揭開癌癥治療的新篇章[28]。目前尚在研究階段，還未應(yīng)用于臨床。過繼細胞療法（adoptive cell therapy,ACT）和樹突狀細胞（dendritic cell,DC）免疫療法是乳腺癌的兩種主要CI類型，TILs是ACT的主要工程細胞之一[29]。實驗證明從乳腺癌樣本中提取并擴增的TILs在體外對自體腫瘤細胞有顯著殺傷效果[30]。目前乳腺癌CI的重點在于尋找和驗證可靠的腫瘤特異性靶點，需綜合考慮靶點的抗原性、有效性和安全性，規(guī)避脫靶效應(yīng)和細胞因子風暴可能帶來的嚴重不良反應(yīng)，以實現(xiàn)精準殺傷癌細胞[29]。

4 總結(jié)與展望

對于TNBC及HER-2過表達型乳腺癌，高TILs預(yù)示著良好預(yù)后；對于Luminal型乳腺癌，高TILs水平與Luminal-HER2+的良好預(yù)后相關(guān)，低TILs水平與Luminal-HER2-乳腺癌良好預(yù)后相關(guān)，目前還沒有明確的生物學解釋來闡明產(chǎn)生這種差別的原因。TILs可增加乳腺癌細胞對NAC的反應(yīng)，值得強調(diào)的是，在所有乳腺癌亞型中TILs水平與pCR率都顯著正相關(guān)?；赥ILs對于乳腺癌預(yù)后判斷的重要價值，中國臨床腫瘤學會（CSCO）2022年乳腺癌診療指南建議，對于未經(jīng)新輔助治療的乳腺浸潤性癌患者，病理學報告應(yīng)新增對于TILs的評估。而通過調(diào)整乳腺癌的TILs浸潤水平從而改善預(yù)后，加強癌細胞對NAC的反應(yīng)，可以成為一種新的研究思路。此外，TILs在內(nèi)分泌治療隊列中的預(yù)后價值也是相當值得探索的。

TILs最常見的檢測方式為H&E染色，再通過不同淋巴細胞的典型特征或IHC、mIHC來進一步區(qū)分，mIHC作為基于IHC發(fā)展的新技術(shù)，可以實現(xiàn)單一組織切片上同時檢測多個抗體，進而實現(xiàn)不同TILs亞群的識別與定位。TMA、基于MPM的TILs評分法等新技術(shù)也在逐步發(fā)展、成熟過程中，借助計算機輔助完成對TILs的檢測可以有效減少染色和其他人為操作對結(jié)果的影響。

阿替利珠單抗的應(yīng)用是TNBC精準治療的重要里程碑，TILs與PD-L1的檢測及ICIs療效的評估密切相關(guān)。通過增加TILs浸潤從而增加ICIs療效尚在實驗室驗證階段，患者對治療的耐受性和并發(fā)的自身免疫性疾病是主要考慮的問題。細胞免疫療法是免疫治療的新途徑，TILs是ACT的主要工程細胞之一，尋找和驗證可靠的腫瘤特異性靶點是目前ACT的重點所在，以期精準殺傷癌細胞的同時最大程度降低對正常細胞的傷害，給患者帶來更大受益。