張玥，李芳，李菊梅，徐昕，孔令明*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830021）

苦杏仁是一種優(yōu)良的藥食兩用資源，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值豐富。我國(guó)苦杏仁產(chǎn)量豐富，年產(chǎn)量約為2萬噸～3萬噸，但是未充分發(fā)揮苦杏仁加工增值率優(yōu)勢(shì)。當(dāng)前，我國(guó)杏仁產(chǎn)業(yè)大都以原料形式賣出，部分產(chǎn)品處于初加工，苦杏仁制油過程中產(chǎn)生的約50%的副產(chǎn)物杏仁粕未得到充分利用，造成了一定程度的浪費(fèi)[1]?？嘈尤势芍泻?5%左右的蛋白質(zhì)，氨基酸種類齊全、易于人體消化吸收，可作為一種食用價(jià)值較高的植物蛋白資源[2]。目前，杏仁蛋白的研究主要集中在分離蛋白提取方法及功能特性的研究和杏仁蛋白酶解制備多肽工藝及酶解產(chǎn)物分離、純化、藥理藥效方面。李大文[2]考察了超聲波輔助鹽溶法、微波輔助鹽溶法和堿溶法對(duì)苦杏仁分離蛋白提取和功能特性的影響，結(jié)果表明，3種提取工藝各有優(yōu)劣，就提取率的大小而言，堿溶法＞超聲波輔助法＞微波輔助法，但物理輔助法提取時(shí)間短，提取效率高，且中性介質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)破壞小。解春艷等[3]對(duì)苦杏仁蛋白組成及蛋白的加工特性進(jìn)行了研究，并對(duì)可溶性蛋白的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到杏仁蛋白的最佳提取工藝條件下，蛋白提取量最高可達(dá)43.79 mg/g。薛蕾[4]釆用風(fēng)味蛋白酶與堿性蛋白酶對(duì)苦杏仁蛋白進(jìn)行雙酶組合水解，確定了最佳酶解工藝條件，并對(duì)酶解產(chǎn)物的體外抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定。勞斐[5]利用杏仁粕中的蛋白質(zhì)資源，采用酶解法制備出高活性的降血壓肽。

杏仁蛋白具有優(yōu)良的品質(zhì)和風(fēng)味，可廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。天然的苦杏仁蛋白由于自身結(jié)構(gòu)的局限，在某些功能性方面無法達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)要求，開發(fā)利用程度較低，采用蛋白質(zhì)修飾性改性技術(shù)對(duì)其功能特性的各個(gè)影響因素進(jìn)行調(diào)節(jié)，使其具有良好的加工特性，獲得功能性加強(qiáng)的產(chǎn)品，對(duì)擴(kuò)大苦杏仁蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域、增強(qiáng)利用效果具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。研究表明，苦杏仁蛋白在pH 4.0附近溶解度最小為12.79%；溫度達(dá)到55℃時(shí)溶解度最大為65.2%[4]。蛋白質(zhì)溶解性的大小在實(shí)際應(yīng)用中非常重要，蛋白質(zhì)的一些功能性質(zhì)，如乳化、起泡、增稠等特性均與之相關(guān)。糖基化反應(yīng)是將糖類物質(zhì)與蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵連接，使得改性后的蛋白具備蛋白分子及糖分子的特性。經(jīng)研究，對(duì)大豆蛋白[6-7]、花生蛋白[8]、肌原纖維蛋白[9]、玉米醇溶蛋白[10]、酪蛋白[11]等進(jìn)行糖基化改性可有效改善蛋白質(zhì)功能特性和營(yíng)養(yǎng)性。

本試驗(yàn)將榨油后的餅粕進(jìn)一步加以利用，以苦杏仁粕谷蛋白為原料，采用糖基化改性的方法對(duì)苦杏仁粕谷蛋白進(jìn)行一定的改性處理，針對(duì)蛋白在食品加工中溶解性的功能特性需要，考察反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、pH值、蛋白與糖質(zhì)量比等不同因素對(duì)葡萄糖改性蛋白溶解度的影響，確定高溶解性葡萄糖改性蛋白最優(yōu)制備條件，為后續(xù)苦杏仁粕谷蛋白-葡萄糖共價(jià)復(fù)合物的理化性質(zhì)提供基礎(chǔ)，以期提高苦杏仁蛋白的綜合開發(fā)利用率，為苦杏仁精深加工、資源的循環(huán)利用提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦杏仁粕谷蛋白（bitter apricot kernel meal gluten，AKG）：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與綜合利用研究室自制；大豆油：新疆友好集團(tuán)股份有限公司。

葡萄糖、NaOH、HCl（均為分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）（分析純）：上海高鳴化工有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250（分析純）、20%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sul fate，SDS）溶劑（生化試劑）：北京索來寶科技有限公司；2-巰基乙醇（生化試劑）：北京津同樂泰化工產(chǎn)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Testo205便攜式數(shù)顯pH計(jì)：德圖儀表（深圳）有限公司；DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；TDL-5-A低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；TU-1810PC紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ALPHA 1-2型真空冷凍干燥機(jī)：德國(guó)Marin Christ公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 苦杏仁粕谷蛋白-葡萄糖共價(jià)復(fù)合物的制備

準(zhǔn)確稱取一定量AKG置于去離子水中，配制蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，室溫25℃下攪拌1 h，用1 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)至不同pH值，加入一定量的葡萄糖，于不同反應(yīng)溫度下恒溫反應(yīng)一段時(shí)間，反應(yīng)過程中不斷攪拌，反應(yīng)結(jié)束后冰浴冷卻至室溫25℃，4 500 r/min離心15 min除去不溶物，上清液透析24 h，冷凍干燥后制得苦杏仁粕谷蛋白-葡萄糖共價(jià)復(fù)合物，即葡萄糖改性蛋白（glucose modified protein，GMP）[12]。

1.3.2 溶解度的測(cè)定

根據(jù)HORAX法[13]稍作改動(dòng)。配制1%的AKG、GMP，室溫 25℃下磁力攪拌 20 min～30 min，4500 r/min離心15 min，留取上清液；取空試管，加入上清液和考馬斯G-250，混勻；放置10 min，在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)量。對(duì)照組加入去離子水和考馬斯G-250。溶解度為上清液中蛋白質(zhì)含量（m1）與樣品中蛋白質(zhì)含量（m0）的比值，其計(jì)算公式如下。

式中：m0為樣品中蛋白質(zhì)含量，mg/g；m1為上清液中蛋白質(zhì)含量，mg/g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 不同反應(yīng)溫度對(duì)葡萄糖改性蛋白溶解度的影響

固定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，在反應(yīng)時(shí)間2 h、pH 9.0、蛋白與糖質(zhì)量比1∶2的條件下，選擇反應(yīng)溫度30、40、50、60、70、80、90、100 ℃，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察不同反應(yīng)溫度對(duì)GMP溶解度的影響。

1.3.3.2 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)葡萄糖改性蛋白溶解度的影響

固定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，在反應(yīng)溫度90℃、pH 9.0、蛋白與糖質(zhì)量比1∶2的條件下，選擇反應(yīng)時(shí)間0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)GMP溶解度的影響。

1.3.3.3 不同pH值對(duì)葡萄糖改性蛋白溶解度的影響

固定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，在反應(yīng)溫度90℃、反應(yīng)時(shí)間2 h、蛋白與糖質(zhì)量比1∶2的條件下，選擇pH值為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察 pH值對(duì)GMP溶解度的影響。

1.3.3.4 不同蛋白與糖質(zhì)量比對(duì)葡萄糖改性蛋白溶解度的影響

固定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，在反應(yīng)溫度90℃、反應(yīng)時(shí)間2 h、pH 9.0的條件下，選擇蛋白與糖質(zhì)量比為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察不同蛋白與糖質(zhì)量比對(duì)GMP溶解度的影響。

1.3.4 接枝度測(cè)定

參考管軍軍[14]OPA試劑改進(jìn)法測(cè)定接枝度（degree of grafting，DG）。接枝度計(jì)算公式如下。

式中：A0為接枝反應(yīng)前溶液吸光度；A1為接枝反應(yīng)后溶液吸光度。

1.3.5 褐變程度的測(cè)定

用0.1%SDS溶液作為溶劑，稀釋樣液，磁力攪拌20 min，在波長(zhǎng)420 nm下測(cè)定吸光度A420[15]；以0.1%SDS溶液做空白對(duì)照組。

1.4 響應(yīng)面分析試驗(yàn)的建立

響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro軟件進(jìn)行制圖及Design Expert軟件和Box-Behnken試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化分析。利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行顯著性分析。每個(gè)樣品處理均作3個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 不同反應(yīng)溫度對(duì)葡萄糖改性蛋白溶解度的影響

不同反應(yīng)溫度對(duì)葡萄糖改性蛋白溶解度的影響見圖1。

圖1 反應(yīng)溫度對(duì)葡萄糖改性蛋白溶解度的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on the solubility of GMP

如圖1所示，隨著溫度的升高，產(chǎn)物的溶解度呈先升高后降低的趨勢(shì)，GMP的溶解度在60℃時(shí)達(dá)到最大值為88.77%。這表明溶液中蛋白質(zhì)在熱處理作用下，蛋白分子發(fā)生伸展，構(gòu)象發(fā)生輕微改變，引入糖鏈，糖基化反應(yīng)速度加快，產(chǎn)物溶解性增大。有研究表明，適度的熱處理可提高蛋白的溶解度，有利于蛋白質(zhì)和水分子的相互作用，對(duì)苦杏仁粕谷蛋白的溶解性起到促進(jìn)作用[16]。溫度過高部分蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，粒子重新聚集，使得蛋白結(jié)合水的能力降低，導(dǎo)致溶解度下降[17]。因此，選擇溫度50、60、70℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2.1.2 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)葡萄糖改性蛋白溶解度的影響

不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)葡萄糖改性蛋白溶解度的影響結(jié)果見圖2。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)葡萄糖改性蛋白溶解度的影響Fig.2 Effect of reaction time on the solubility of GMP

由圖2可知，GMP的溶解度在糖基化反應(yīng)0.5 h時(shí)有最高值為91.15%。此后溶解度隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，使原本斷裂的肽鍵重新聚合，蛋白的疏水基團(tuán)增多，美拉德反應(yīng)逐漸進(jìn)入高級(jí)階段，形成了不溶于水的大分子聚合物，導(dǎo)致產(chǎn)物溶解度下降，這與王魯慧等[18]研究結(jié)果一致。另外，延長(zhǎng)時(shí)間并不能提高葡萄糖改性蛋白的溶解度，也表明糖基化中的化學(xué)反應(yīng)均處于變化初期。因此，選擇反應(yīng)時(shí)間為0、0.5、1.0 h進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2.1.3 不同pH值對(duì)葡萄糖改性蛋白溶解度的影響

不同pH值對(duì)葡萄糖改性蛋白溶解度的影響結(jié)果見圖3。

圖3 pH值對(duì)葡萄糖改性蛋白溶解度的影響Fig.3 Effect of pH on the solubility of GMP

由圖3可知，隨著pH值的增大，葡萄糖改性蛋白的溶解度呈現(xiàn)先上升趨勢(shì)，pH值為6.0～10.0時(shí)，溶解度顯著上升（P＜0.05），pH 值在 10.0～11.0 趨于平緩，差異不顯著（P＞0.05）。一方面與蛋白質(zhì)自身性相關(guān)[19]，蛋白質(zhì)偏離等電點(diǎn)的酸性或堿性條件下，體系中電荷的增加，有利于蛋白分子與水分子間作用，溶解性呈現(xiàn)逐漸增大趨勢(shì)[20]；另一方面這是由于pH值的增大，引入了更多的糖鏈，可溶性蛋白隨著反應(yīng)進(jìn)程更易與葡萄糖共價(jià)結(jié)合，從而使得親水性基團(tuán)不斷增加[6]。因此選擇pH值9.0、10.0、11.0進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2.1.4 不同蛋白與糖質(zhì)量比對(duì)葡萄糖改性蛋白溶解度的影響

不同蛋白與糖質(zhì)量比對(duì)葡萄糖改性蛋白溶解度的影響結(jié)果見圖4。

圖4 蛋白與糖質(zhì)量比對(duì)葡萄糖改性蛋白溶解度的影響Fig.4 Effect of protein-sugar mass ratio on solubility of GMP

由圖4可知，蛋白與糖質(zhì)量比為1∶2時(shí)，GMP的溶解度最高為89.79%，此后溶解度隨著糖添加比例的改變呈現(xiàn)出小幅度下降，這可能是因?yàn)榈鞍滋砑恿孔冃。腔瘎┨砑恿枯^多，使得溶液有一定黏度，具有稠厚感，不利于糖基化反應(yīng)的發(fā)生，從而導(dǎo)致溶解度的下降[21]。這與王祺[22]的研究結(jié)果一致。TANG等[23]對(duì)豌豆球蛋白改性研究也表明不同蛋白與糖質(zhì)量比及反應(yīng)時(shí)間會(huì)不同程度地影響改性后蛋白溶解性。因此選擇蛋白與糖質(zhì)量比為 1∶1、1∶2、1∶3 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒?/p>

響應(yīng)面結(jié)果見表2，回歸方程方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Design of response surface test scheme and results

表3 響應(yīng)面回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis of response surface regression equation

回歸方程為Y=94.33+8.22A+3.16B+9.41C+3.32D+2.76AB+3.47AC+5.11AD+2.49BC+3.19BD+0.2875CD-12.29A2-5.37B2-13.37C2-9.50D2。

由表 3 可知，該模型 P＜0.000 1，R2=0.971 5，說明該模型具有高度的顯著性，方程的可行性較好，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.1523），說明了回歸模型和實(shí)際試驗(yàn)擬合充分，具備可行性且精確度高，可以用該模型對(duì)葡萄糖改性蛋白的制備進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、pH值、蛋白與糖質(zhì)量比4個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響顯著性可用F值來評(píng)價(jià)，由表3可知，各因素對(duì)葡萄糖改性蛋白的溶解度影響順序?yàn)閜H值＞反應(yīng)溫度＞蛋白與糖質(zhì)量比＞反應(yīng)時(shí)間，pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、蛋白與糖質(zhì)量比對(duì)葡萄糖改性蛋白的溶解度影響為極顯著（P＜0.01）。

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

影響葡萄糖改性蛋白溶解度的各個(gè)因素之間的交互作用圖見圖5～圖8。

圖5 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)溶解度影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface and contour plots of the effect of reaction temperature and reaction time on solubility

圖6 反應(yīng)溫度和pH值對(duì)溶解度影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface and contour plots of the effect of reaction temperature and pH on solubility

圖7 反應(yīng)時(shí)間和pH值對(duì)溶解度影響的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Response surface and contour plots of the effect of reaction time and pH on solubility

圖8 反應(yīng)時(shí)間和蛋白與糖質(zhì)量比對(duì)溶解度影響的響應(yīng)面和等高線Fig.8 Response surface and contour plots of the effect of reaction time and protein-sugar mass ratio on solubility

結(jié)合表3和圖5可知，在響應(yīng)組合試驗(yàn)中，一次項(xiàng)A（反應(yīng)溫度）、B（反應(yīng)時(shí)間）和二次項(xiàng) A2、B2差異為極顯著（P＜0.01），對(duì)GMP的溶解度的影響大。A（反應(yīng)溫度）的曲面的彎曲程度較B（反應(yīng)時(shí)間）高。二維等高線的橢圓狀不明顯，交互項(xiàng)AB（反應(yīng)溫度-反應(yīng)時(shí)間）不顯著（P＞0.05）。

結(jié)合表3和圖6可知，一次項(xiàng)A（反應(yīng)溫度）和C（pH值）的響應(yīng)面坡度較陡，差異極顯著（P＜0.01）。AC（反應(yīng)溫度-pH值）影響因素差異顯著（P＜0.05），因素之間交互作用顯著，交互作用對(duì)溶解度影響較大。

結(jié)合表3和圖7分析可知，一次項(xiàng)C（pH值）和二次項(xiàng)C2曲面效應(yīng)極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)BC（反應(yīng)時(shí)間-pH值）不顯著（P＞0.05），且等高線的形狀趨近圓形，對(duì)糖基化改性蛋白溶解度影響不大。

結(jié)合表3和圖8分析可知，一次項(xiàng)D（蛋白與糖質(zhì)量比）和二次項(xiàng)D2因素差異為極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)BD（反應(yīng)時(shí)間-蛋白與糖質(zhì)量比）不顯著（P＞0.05）。各因素對(duì)GMP溶解度的影響不是一個(gè)簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。響應(yīng)面坡度越陡，響應(yīng)值對(duì)各因素變化越強(qiáng)。反之坡度越平緩，影響越小。

2.2.3 最佳條件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

該模型得到最優(yōu)工藝為反應(yīng)溫度63.21℃、反應(yīng)時(shí)間0.61 h、pH 9.39、蛋白與糖質(zhì)量比1∶2。在此條件下葡萄糖修飾苦杏仁粕谷蛋白制備葡萄糖改性蛋白的溶解度為98.69%。考慮到實(shí)際操作，將實(shí)際試驗(yàn)條件調(diào)整為反應(yīng)溫度63℃、反應(yīng)時(shí)間0.6 h、pH 9.40，蛋白與糖質(zhì)量比1∶2、進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，取平均值得到溶解度為96.24%，與模型相符，則模型可以較好地預(yù)測(cè)葡萄糖改性蛋白的制備。

2.3 接枝度與褐變度的測(cè)定

接枝度與褐變度的測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 葡萄糖改性蛋白的接枝度與褐變度Table 4 Grafting degree and browning degree of GMP

糖基化反應(yīng)是碳水化合物以共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)分子上的游離氨基連接而形成糖蛋白的化學(xué)反應(yīng)，又稱美拉德反應(yīng)。接枝度是通過自由氨基的含量來表現(xiàn)美拉德反應(yīng)程度。由表4可知，在最優(yōu)工藝下GMP的接枝度為33.03%。美拉德反應(yīng)會(huì)有褐色產(chǎn)物產(chǎn)生，褐變度是通過呈色物質(zhì)吸光度的變化來表現(xiàn)美拉德反應(yīng)的高級(jí)產(chǎn)物的形成程度。GMP的褐變度為0.235。反應(yīng)結(jié)果與張玥等[24]研究結(jié)果相似，說明糖基化反應(yīng)較為充分。

3 結(jié)論

本研究以苦杏仁粕谷蛋白為原料，采用糖基化方法對(duì)影響蛋白質(zhì)溶解特性的各個(gè)因素進(jìn)行調(diào)節(jié)，以期提高其在溶液中的分散性，增強(qiáng)蛋白質(zhì)與水的相互作用，使其具有良好的加工特性，從而能夠廣泛應(yīng)用于食品體系。試驗(yàn)分析了不同因素對(duì)苦杏仁粕谷蛋白-葡萄糖共價(jià)復(fù)合物溶解度的影響。優(yōu)化后的最佳工藝參數(shù)為反應(yīng)溫度63℃、反應(yīng)時(shí)間0.6 h、pH 9.4、蛋白與糖質(zhì)量比1∶2。在此條件下，GMP溶解度為96.24%。最優(yōu)糖基化改性產(chǎn)物的制備條件為后續(xù)苦杏仁粕谷蛋白理化特性和功能活性的研究提供了基礎(chǔ)。