劉瑾春，李寧，鄭秀花，張瑞霞，楊曉紅

（1.河南護理職業(yè)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)系診斷教研室，河南 安陽 455000；2.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州 450003）

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是軟骨組織工程中重要的種子細胞之一［1］。通過微粒體培養(yǎng)體系，目前在體外應(yīng)用微粒體培養(yǎng)體系和含有轉(zhuǎn)化生長-β 的無血清培養(yǎng)液作為軟骨誘導(dǎo)液，已經(jīng)能成功誘導(dǎo)BMSCs向軟骨分化［2］。但由于現(xiàn)行誘導(dǎo)方法仍不夠成熟，以BMSCs 為種子細胞的組織工程化軟骨組織構(gòu)建距臨床應(yīng)用尚有很大差距［3］。所以尋找一種高效、經(jīng)濟的誘導(dǎo)方法，是實現(xiàn)以BMSCs 為種子細胞的軟骨組織工程走向臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。

甲狀腺激素是生長板中骨骼成熟的有效調(diào)節(jié)因子。生長板細胞對甲狀腺激素（T3）非常敏感［4］，在臨床上，甲狀腺毒癥和甲狀腺功能減退癥，分別代表甲狀腺激素的病理性增多和減少，對幼兒的生長發(fā)育具有重要的影響。在基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)，甲狀腺素低下的小鼠會出現(xiàn)骨骺板內(nèi)軟骨細胞增殖層和肥大層細胞減少，導(dǎo)致骺板厚度的降低［5］，而生理濃度的甲狀腺素能夠刺激胚胎軟骨組織的生長和體外成熟［6］。因此筆者通過本研究探討關(guān)于甲狀腺激素在體外BMSCs 成軟骨誘導(dǎo)方面的作用和對軟骨細胞肥大的影響。

1 材料和方法

1.1 豬BMSCs 的分離、培養(yǎng)和擴增

健康小型豬（日齡10～15 d）用常規(guī)方法抽骨髓5 mL，加入DMEM 培養(yǎng)液30 mL，混勻，1 500 rpm 離心10 min，棄上清，反復(fù)洗滌2 次。離心后加入10 mL 10%胎牛血清低糖DMEM 培養(yǎng)液，混勻；取少量細胞懸液，用4%乙酸1∶1 破壞紅細胞，常規(guī)計數(shù)；以DMEM 培養(yǎng)液稀釋至4×106個有核細胞/mL，于100 mm 培養(yǎng)皿內(nèi)按6×105個有核細胞/cm2的細胞密度接種。置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)至4～5 d 換液，此后每2～3 d 換液1 次，常規(guī)傳代培養(yǎng)。棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌1 次，加入2.0 mL 細胞消化液，常規(guī)在鏡下觀察，見大部分細胞離壁后，吸除消化液，中止消化，收集細胞至離心管，1 500 rpm 離心5 min，棄上清液，洗滌，離心。重復(fù)洗滌1 次，棄上清液，加入DMEM 培養(yǎng)液混勻，臺盼藍染色，計數(shù)，以1.5×104/cm2的密度接種，置于37℃、5%CO2、100% 飽和濕度的條件下培養(yǎng)，每2～3 d 換液1 次，達到融合狀態(tài)可繼續(xù)傳代培養(yǎng)，收集第3 代（P3）細胞，離心形成Pellets。

1.2 Pellet 培養(yǎng)及分組設(shè)計

P3 BMSCs 按上述方法獲得。將1 mL 小份細胞懸液（密度為5×105cells/mL）置于15 mL 聚丙烯管中，并以600×g 離心5 min 以形成Pellets 顆粒，然后將這些Pellets 顆粒分為兩組，在表1 所列的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

表1 軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液成分與分組設(shè)計

1.3 MTT 生長曲線測定

MTT 曲線測定時，平面培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)細胞被分為2 組，按照上述分組的培養(yǎng)基培養(yǎng)。MTT 的測定方法：第3 代骨髓間充質(zhì)細胞（P3）接種于96 孔板（美國Corning 公司）內(nèi)，每孔內(nèi)細胞數(shù)為2 000。在1 至7 天的同一個時間點，每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL，pH7.4，PBS 液溶解），培養(yǎng)4 h 棄去培養(yǎng)液，每孔加1 mL DMSO，在搖床上裂解10 min，于490 nm 波長處測定裂解液的光吸收值。以DMSO 溶液為空白對照。所有樣本讀取6 個平行樣本進行統(tǒng)計。

1.4 組織學(xué)檢測

取材，4%多聚甲醛中固定，時間為24 h，脫水，石蠟包埋，切片（5 μm），然后進行HE 染色和甲苯胺藍染色。

1.5 總RNA 的提取

取材剪碎，加入1 mL TRIzol 試劑，室溫靜置（5 min），加入4℃氯仿400 μL，劇烈振蕩，時間為10 s，室溫靜置（15 min）；4℃，12 000 rpm 離心15 min，取上清0.5 mL，加500 μL 冷異丙醇混勻，靜置（10 min），4℃，12 000 rpm 離心10 min；棄上清，加1 mL 75%乙醇［稀釋0.01%焦碳酸二乙酯（DEPC）］，振蕩；離心，4℃，7 500 rpm 離心10 min；棄上清；50 μL 0.01%DEPC 水溶解，混勻，測光密度（OD）值，調(diào)整RNA 濃度至1 μg/μL，瞬時離心，-80℃保存。

1.6 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

定量PCR 分析采用生物Rad-CFX96TM-PCR機進行PCR 循環(huán)。表2 列出了豬甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）、Ⅱ型膠原（Col-Ⅱ）、Ⅹ型膠原（Col-Ⅹ）、性別決定基因9（SOX9）、聚集蛋白聚糖（aggrecan）、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）和基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13）的引物序列。反應(yīng)曲線：94℃下預(yù)變性2 min；PCR 擴增40 個循環(huán)，94℃下15 s，60℃下30 s，隨后進行一系列循環(huán)，然后進行熔體曲線分析，以確保反應(yīng)特異性。將各基因的表達水平用GAPDH 標準化。將對照組靶基因表達量設(shè)為1，用2（-△△CT）法顯示實驗組與對照組的基因表達。

表2 定量RT-PCR 引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

所有測量數(shù)據(jù)用SPSS 11.0 軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺素促進了BMSCs 增殖

在兩種條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的BMSCs（P3）表現(xiàn)出不同的生長速率（圖1）。前4 d 兩組細胞生長速度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（第1 天：t=0.000，P=1.000；第2 天：t=1.113，P=0.292；第3 天：t=0.924，P=0.377；第4 天：t=1.951，P=0.080）。從第5 天到第8 天，T3 組的生長速度明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（第5 天：t=4.652，P=0.001；第6 天：t=4.277，P=0.002；第7 天：t=4.814，P=0.001；第8 天：t=5.636，P＜0.001）。

2.2 組織化學(xué)檢查

對照組軟骨細胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)的BMSCs 顆粒形成了具有腔隙樣結(jié)構(gòu)的軟骨樣組織，周圍區(qū)域甲苯胺藍染色陽性（圖2A、圖2C），表明各組細胞周圍基質(zhì)中有大量軟骨GAG 基質(zhì)積聚。T3 組的BMSCs 顆粒顯示更明顯的陷窩樣結(jié)構(gòu)形成（圖2B），甲苯胺藍染色強于對照組，纖維和軟骨陷窩較多（圖2D）。

圖1 T3 組和對照組BMSCs 的MTT 法測定比較

圖2 兩組BMSCs 顆粒染色

2.3 BMSCs 顆粒在不同條件軟骨細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的實時定量PCR 表達

甲狀腺素實時定量PCR 顯示在不同的條件誘導(dǎo)液下BMSCs 的軟骨特異基因在體外培養(yǎng)4 周的表達情況（圖3）。甲狀腺素明顯的促進了SOX9，Col-Ⅱ和aggrecan 的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（SOX9：t=5.741，P=0.001；Col-Ⅱ：t=3.393，P=0.015；aggrecan：t=10.764，P=0.001），但是甲狀腺素也促進了軟骨細胞肥大相關(guān)基因Col-Ⅹ和MMP13 的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（Col-Ⅹ：t=14.632，P=0.001；MMP13：t=3.417，P=0.014），成骨方向的相關(guān)基因RUNX2 和Col-Ⅰ的表達未有明顯的增強，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Col-Ⅰ：t=1.739，P=1.133；RUNX2：t=1.924，P=0.103）。

圖3 BMSCs 顆粒在不同條件軟骨細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基

3 討論

BMSCs 是軟骨組織工程中重要的種子細胞，調(diào)控BMSCs 高效向軟骨方向分化，分泌軟骨特異的細胞外基質(zhì)，形成外觀、化學(xué)成分、機械功能與正常軟骨相似的組織是目前科研工作的重要課題。TGF-β 超家族是BMSCs 成軟骨誘導(dǎo)中最常用的生長因子，包括TGF-β、BMP 等［9］，但是這種誘導(dǎo)方法在以BMSCs 為種子細胞形成的組織工程軟骨在功能上尚達不到機體軟骨的程度［10］。探索更優(yōu)化的軟骨誘導(dǎo)方案勢在必行。甲狀腺素是機體內(nèi)調(diào)節(jié)生長板軟骨生長和骨骼成熟的重要系統(tǒng)內(nèi)分泌因子，刺激生長板軟骨細胞的生長和成熟［11］。本研究在體外以BMSCs 為種子細胞的軟骨組織工程中應(yīng)用甲狀腺激素，發(fā)現(xiàn)甲狀腺素可促進骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖和軟骨形成，同時也誘導(dǎo)的軟骨細胞肥大相關(guān)基因表達。

研究中應(yīng)用甲狀腺素誘導(dǎo)BMSC 細胞向軟骨細胞分化的思路來自于臨床疾病學(xué)和實驗動物學(xué)的研究：臨床上幼兒甲狀腺素低下會導(dǎo)致骨軟骨發(fā)育不全和呆小癥狀；甲狀腺素低下的小鼠會出現(xiàn)骨骺板內(nèi)軟骨細胞增殖層和肥大層細胞減少，導(dǎo)致骺板厚度的降低，補充甲狀腺素可以逆轉(zhuǎn)這種生長板的紊亂，而補充生長激素則不能逆轉(zhuǎn)這種紊亂，提示甲狀腺素有促進軟骨細胞增殖和成熟的作用。生理濃度甲狀腺素與核受體結(jié)合，進而調(diào)控軟骨細胞增值和軟骨相關(guān)基因的表達［12］。甲狀腺激素調(diào)控BMSC 軟骨發(fā)生的機制目前仍不清楚，研究發(fā)現(xiàn)用甲狀腺激素處理的生長板軟骨細胞上調(diào)了Wnt-4 mRNA 和蛋白的表達，增加了穩(wěn)定的β-catenin 在細胞內(nèi)的積累，增加了TCF/LEF 轉(zhuǎn)錄活性，并刺激了RUNX2/cbfa1 基因的表達［13］。另有研究顯示，聯(lián)合應(yīng)用甲狀腺素、胰島素和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2，結(jié)果獲得更多的軟骨細胞。因此推測甲狀腺素是通過與胰島素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）的信號通路相互作用而發(fā)揮誘導(dǎo)作用的，另外一個可能的重要蛋白是BMP6，在應(yīng)用TGF-β 和地塞米松基礎(chǔ)上，聯(lián)合應(yīng)用BMP-6可以顯著促進hBMSCs 成軟骨分化，可使hBMSCs聚集的重量增加10 倍，GAGs 染色更加致密［14］。

在軟骨組織工程中，應(yīng)用BMSC 細胞為種子細胞，向軟骨細胞誘導(dǎo)過程中一個關(guān)鍵的問題是軟骨細胞的肥大。肥大的軟骨細胞的特征是細胞體積增加，細胞外基質(zhì)鈣化，肥大的軟骨細胞發(fā)生凋亡。肥大型軟骨細胞被認為是終末分化的軟骨細胞，通過偶聯(lián)軟骨形成和骨形成過程而在骨骼發(fā)育中起到過渡的作用［15］。一般情況下認為肥大軟骨細胞不可避免的趨向于凋亡，因此軟骨組織工程中并希望避免肥大表型在細胞出現(xiàn)。本研究顯示，在甲狀腺激素誘導(dǎo)BMSC 軟骨發(fā)生的過程中，雖然軟骨特異基因的表達增強了，但是軟骨肥大相關(guān)基因Col-Ⅹ和MMP13 同時也被誘導(dǎo)增強了。已經(jīng)知道，以軟骨細胞為種子細胞，生理濃度甲狀腺素素（0.1～1.0 nmol/L）能夠促進軟骨細胞肥大分化；但是高濃度的甲狀腺素（100 nmol/L）反而抑制了軟骨細胞的肥大分化：高于100 nmol/L 的T3 可以明顯地抑制軟骨細胞體外培養(yǎng)時的去分化和肥大分化，軟骨肥大相關(guān)基因（Col-Ⅹ，MMP13）的表達均低于常規(guī)培養(yǎng)組［16］。以BMSC 為種子細胞，誘導(dǎo)其軟骨發(fā)生的傳統(tǒng)的誘導(dǎo)液包含TGF-β 和地塞米松，這種誘導(dǎo)液可以引起軟骨細胞肥大；如果在軟骨誘導(dǎo)液中添加生理濃度（1 nmol/L）甲狀腺素，則可以進一步明顯的誘導(dǎo)軟骨細胞肥大，而這種誘導(dǎo)又是通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白4 發(fā)揮作用的，BMP 拮抗劑Noggin 可阻斷甲狀腺素的BMSC 軟骨發(fā)生的軟骨肥大表型增強作用［17］。高濃度的甲狀腺素在誘導(dǎo)BMSC 軟骨發(fā)生的過程中是否能避免軟骨細胞肥大表型方面的研究較少。在本研究中，在BMSC 細胞軟骨誘導(dǎo)分化中應(yīng)用高濃度甲狀腺素（100 nmol/L），結(jié)果顯示軟骨細胞肥大相關(guān)基因的表達增強。種子細胞的不同可能是造成高濃度甲狀腺素的作用不同的主要原因，具體機制仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)bFGF 和甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrP）可抑制TGF-β 引起的早期肥大分化［18］；混合共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)人軟骨細胞分泌的可溶性因子能抑制TGF-β 誘導(dǎo)后的BMSCs 早期肥大分化，其中軟骨細胞分泌的胰島素樣生長因子5，胰島素樣生長因子5 可能發(fā)揮重要的作用［19］。理想的誘導(dǎo)方案能夠同時促進軟骨特異基因和蛋白表達，同時不增加軟骨細胞肥大表型的表達，更優(yōu)化的聯(lián)合誘導(dǎo)方案仍需進一步探索。

綜上所述，本研究在誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞軟骨形成的過程，觀察和探索了軟骨誘導(dǎo)液中添加甲狀腺素對軟骨特異基因表達和軟骨肥大表型的影響，發(fā)現(xiàn)甲狀腺素可促進間充質(zhì)干細胞的增殖和軟骨形成，同時也誘導(dǎo)了軟骨細胞肥大相關(guān)基因的表達增強，這些結(jié)果為研究軟骨組織工程的誘導(dǎo)方案提供了有益的線索。