李可心，張 玉，2，3，4，周冉冉，陳茂彬，2

(1 湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院, 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068；2 湖北工業(yè)大學(xué)麻城產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，湖北 麻城 438300；3 湖北省菊花產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，湖北 麻城 438300；4 麻城市公共檢驗(yàn)檢測中心，湖北 麻城 438300)

菊花作為一種食用和藥用同源植物，在中國已有2000多年的歷史。其富含黃酮類、多酚類等生物活性物質(zhì)，不僅可以改善視力，還具有保護(hù)心血管、保護(hù)神經(jīng)、保護(hù)肝臟、保護(hù)眼睛、抗氧化、抗炎、抗癌等多種生物學(xué)活性[1-3]。湖北麻城地區(qū)盛產(chǎn)菊花，麻城黃金菊因其顏色金黃燦爛、味道清新淡雅、富含生物活性物質(zhì)以及較高的抗氧化活性而備受人們青睞[4-5]。目前對于黃金菊的研究大多為香氣成分、抗寒性等生理指標(biāo)以及分子克隆方面[6]，而對于黃金菊中功效性成分的研究，特別是藥食同源菊花新種質(zhì)“黃金菊”的總黃酮提取及其主要成分分析研究不足。總黃酮的提取方法主要有微波提取法、酶解法、亞臨界水法及熱水回流法等，如崔建強(qiáng)等[7]利用微波法提取野菊花總黃酮，提取率較低，僅為0.47%；李金鳳等[8]使用亞臨界水提取懷菊總黃酮，但在提取過程中條件溫度較高，可能會(huì)對黃酮物質(zhì)造成影響；師艷秋等[9]利用酶法提取荷葉總黃酮，提取時(shí)間短，提取純度高，但提取成本也相對較高。前期也有報(bào)道利用熱水回流法提取黃金菊中總黃酮[10]，但該法存在水提時(shí)間過長、提取率較低等問題[11]。而超聲波提取法耗時(shí)短、能耗少，提取率高[12]，因此，本實(shí)驗(yàn)采用超聲波提取法展開進(jìn)一步探索。

圖 1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

據(jù)報(bào)道，菊花中的黃酮化合物有89種，主要為芹菜素、金合歡素、木犀草素和香葉木素以其與葡萄糖、葡萄糖醛酸、蕓香糖、木犀草苷、紫云英苷、蘆丁、槲皮素、丙二?；肴樘呛捅；咸烟切纬傻奶擒誟13]。這些化合物都具有一定的生理活性。木犀草素及其苷類木犀草苷對腫瘤壞死因子有顯著的抑制作用(p<0.01)[14]，紫云英苷可以抑制缺氧誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲[15]，以及增加大鼠胰島細(xì)胞的胰島素分泌[16]。蘆丁和槲皮素在菊花中的含量也相對較高[17-18]。為充分了解黃金菊中黃酮類化合物的種類和含量，本文使用響應(yīng)面優(yōu)化法提取黃金菊總黃酮，并使用高效液相色譜(HPLC)對黃金菊的5種主要黃酮類化合物進(jìn)行定性定量分析，以期為麻城地區(qū)黃金菊的深度開發(fā)提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃金菊購于湖北省麻城市，粉碎粒度分別處理成40目、60目、140目以及超微粉碎(800目)，于密封袋中4℃保存，備用。

1.2 試驗(yàn)試劑

無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘆丁、木犀草苷、木犀草素、槲皮素、紫云英苷，色譜純，購于武漢泰晟生物科技有限公司；甲醇、磷酸，色譜純，購于美國Fisher有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材

TP310Z電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；BJ-400T拜杰多功能粉碎機(jī)(德清拜杰電器有限公司)；BW-6BL超微粉碎機(jī)(山東百順機(jī)械有限公司)；GB6003.1-1997標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩60目、40目(浙江上虞市五四紗篩廠)；X1R國家統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)篩140目(紹興海特儀器有限公司)；DTC-8超聲波清洗機(jī)(鼎泰(湖北)生化科技設(shè)備制造有限公司)；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)(島津企業(yè)管理(中國)有限公司)；ZXFD-B5250鼓風(fēng)干燥箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；ZWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)；R-404A臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技公司)；U3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技公司)。

1.4方法

1.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線稱量蘆丁20 mg，用甲醇溶液溶解，轉(zhuǎn)移至20 mL容量瓶中，定容，即為1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

吸取上述標(biāo)準(zhǔn)蘆丁溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0(mL)于10 mL容量瓶，依次加入5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.0(mL)甲醇溶液，取200 μL于試管中，再分別加入0.4 mL的5% NaNO2溶液，搖勻并靜置6 min，0.4 mL的8% Al(NO3)3溶液，搖勻后靜置6 min，4 mL的5% NaOH溶液，搖勻后靜置20 min，定容。在512 nm處測定吸光度，用第一管溶液作空白參照，繪制標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線。

1.4.2菊花總黃酮的提取及含量測定稱取1 g指定粉碎粒度的菊花粉于250 mL錐形瓶中，加入50 mL 60%的酒精提取(料液比1∶50，g/mL)，將超聲清洗儀設(shè)置為指定溫度、時(shí)間，提取后在室溫下靜置24 h，離心，3500 r/min，10 min，吸取上清液200 μL于10 mL的試管中。按照上述方法測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量，菊花總黃酮提取率

式中：X為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得總黃酮含量，mg/mL；N為料液比，g/mL。

1.4.3單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別以粉碎粒度(800目、140目、60目、40目)、提取溫度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)、提取時(shí)間(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)、料液比(1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70)(g/mL)為影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究各個(gè)因素對總黃酮提取率的影響。

1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素結(jié)果分別設(shè)定3個(gè)因素3個(gè)水平，并采用響應(yīng)面(Box-Behnken)分析響應(yīng)面結(jié)果。

1.6 黃酮類化合物分析

1.6.1色譜條件色譜柱為Hypersil GOLD C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)，分別嘗試甲醇和0.1%磷酸、甲醇和0.1%甲酸、乙腈和0.1%磷酸以及乙腈和0.1%甲酸為流動(dòng)相，最終確定甲醇為流動(dòng)相A，0.1%磷酸為流動(dòng)相B；波長275 nm，梯度洗脫流速1 mL/min，洗脫程序見表1。流量1 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL。

表1 洗脫程序

1.6.2標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液制備單標(biāo)的制備。分別稱取20 mg標(biāo)準(zhǔn)品，加入200 μL甲醇溶解，再將溶液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得質(zhì)量濃度均為2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再取100 μL溶于1 mL甲醇中，即得200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用一次性注射器將標(biāo)準(zhǔn)溶液轉(zhuǎn)移至液相進(jìn)樣瓶，用0.22 μm有機(jī)濾頭過濾。

混標(biāo)的制備。分別取木犀草素、木犀草苷、槲皮素、紫云英苷、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，得到混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3樣品制備及測定按照優(yōu)化后的方法提取總黃酮，并使用上述方法進(jìn)行HPLC分析測定。

1.6.4方法學(xué)考察6個(gè)濃度級(jí)別的混合標(biāo)準(zhǔn)液按1.6.1方法檢測。以樣品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到6個(gè)化合物的線性回歸方程。根據(jù)線性回歸方程的R2判斷樣品的線性關(guān)系。

精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性加標(biāo)回收率，按照周衡樸[19]的方法并稍作修改。

1.7 數(shù)據(jù)分析方法

本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

縱坐標(biāo)為吸光度(Y)，橫坐標(biāo)為蘆丁質(zhì)量濃度(X/mg·mL-1)，得到的線性回歸方程為：Y=4.3148X+0.0048，R2=0.9996，線性相關(guān)性良好。

2.1.1粉碎粒度對總黃酮提取率的影響該單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)為4個(gè)處理，分別為800目、140目、60目、40目。超聲提取溫度40 ℃、時(shí)間30 min、料液比1∶50(g/mL)。

根據(jù)圖2可以看出，黃金菊總黃酮含量隨粉碎粒度的增大而下降，即產(chǎn)品粉碎越細(xì)總黃酮提取率越高。800目組的總黃酮含量最高，40目組的總黃酮含量最低。這可能是由于菊花粉的粒度越小，其與提取液的接觸面積就越大，總黃酮的提取結(jié)果就越好。

圖 2 粉碎粒度對總黃酮提取率的影響

圖 3 提取溫度對總黃酮提取率的影響

2.1.2超聲提取溫度對總黃酮提取率的影響該單因素實(shí)驗(yàn)在菊花的粉碎粒度為超微粉碎、超聲提取的時(shí)長為30 min、料液比為1∶50(g/mL)的條件下，對比不同超聲提取溫度對菊花總黃酮提取的影響。

根據(jù)圖3的整體趨勢可以知道，黃金菊總黃酮含量隨著超聲提取溫度的升高而升高。在提取溫度達(dá)到60℃及以上時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最高并且趨于穩(wěn)定。由于溫度越高能耗越大，綜合考慮，選擇60℃較適宜。

圖 4 超聲處理時(shí)間對總黃酮提取率的影響

2.1.3超聲提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響該單因素實(shí)驗(yàn)在菊花粉碎粒度為超微粉碎、超聲提取溫度為40℃、料液比為1∶50(g/mL)的條件下，對比不同的超聲提取時(shí)長對菊花總黃酮的提取帶來的影響。

根據(jù)圖4的整體趨勢可知，黃金菊總黃酮含量隨著超聲提取時(shí)間的延長而升高。當(dāng)超聲提取時(shí)間達(dá)到30 min及以上時(shí)，菊花總黃酮含量基本達(dá)到最大且趨于穩(wěn)定?？紤]到能耗較大的問題，以超聲處理30 min為宜。

圖 5 料液比對總黃酮提取率的影響

2.1.4料液比對總黃酮提取率的影響該單因素實(shí)驗(yàn)在菊花粉碎粒度為超微粉碎、超聲提取溫度為40℃、超聲提取時(shí)間為30 min的條件下，對比不同料液比(g/mL)對菊花總黃酮的提取帶來的影響。

根據(jù)圖5的整體趨勢走向可知，隨著提取液比例的提高，總黃酮提取率也不斷升高。當(dāng)料液比達(dá)到1∶50(g/mL)時(shí)，總黃酮含量基本達(dá)到最大且趨于穩(wěn)定。可能由于在料液比為1∶30、1∶40時(shí)總黃酮已經(jīng)飽和，導(dǎo)致總黃酮無法繼續(xù)溶出，因此溶劑的增加不會(huì)進(jìn)一步提高提取率[21]。所以綜合成本和提取率因素的影響，料液比為1∶50(g/mL)時(shí)最好。

2.1.5響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析根據(jù)表2，第17組處理的總黃酮提取率最高，為9.02%；依次下來是處理16和處理12，分別為8.87%、8.81%；總黃酮數(shù)值最低的是處理4，為6.80%。響應(yīng)面模型F值為31.77，p值<0.0001，說明模型極顯著，失擬項(xiàng)p=0.166，表明該模型與實(shí)際的擬合度高，可以很好地反映出實(shí)驗(yàn)真實(shí)值；模型的一次項(xiàng)C具有極顯著性，交互項(xiàng)AB、AC、BC無顯著性，二次項(xiàng)A2、B2、C2具有顯著性，表明提取溫度、提取時(shí)間和料液比均對黃金菊總黃酮提取率有顯著影響，但各因素之間沒有影響。三者對總黃酮提取率的影響由高到低依次為料液比>提取時(shí)間>提取溫度。

表2 總黃酮提取工藝的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

對影響因素進(jìn)行回歸擬合得到回歸方程：

Y=9.04-0.37A-0.12B+2.15C-0.80AB+2.62AC+

5.62BC-0.255A2-0.62B2+2.62C2，R2=0.9973

表明此方程擬合度較高，與實(shí)際情況高度相符。

據(jù)圖6能看出三個(gè)因素之間交互作用的強(qiáng)度和對響應(yīng)值的影響。

(a)提取溫度與提取時(shí)間二因素響應(yīng)

由圖6a可知，提取時(shí)間和提取溫度的二因素交互作用響應(yīng)曲線最陡峭，說明兩者的二次項(xiàng)對菊花總黃酮提取率影響最明顯；同理可得，圖6b中，提取溫度和料液比對總黃酮得率影響較小，曲線較平緩。從圖6c可知，料液比曲面較陡峭，因此料液比二次項(xiàng)對總黃酮提取率影響較顯著。響應(yīng)圖整體呈現(xiàn)倒扣的“碗狀”，由此可得各因素之間交互作用不明顯。

根據(jù)回歸擬合方程可確定黃金菊總黃酮提取工藝條件：提取溫度為58.71℃、提取時(shí)長為27.25 min、料液比為1∶49.91(g/mL)。考慮到實(shí)際情況，優(yōu)化工藝條件為：提取溫度為60℃、提取時(shí)間為30 min、料液比為1∶50(g/mL)。按照此工藝條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最后得到黃金菊總黃酮提取率為9.01%，與理論值偏差0.33%，說明該方法可靠。

2.2 黃酮成分HPLC測定

2.2.1HPLC結(jié)果各色譜峰分離效果最佳。如圖7所示，色譜圖的基線平穩(wěn)，5種化合物的分離度良好，峰形比較規(guī)范。

圖 7 混合標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜

2.2.2方法學(xué)考察結(jié)果

1)線性關(guān)系 如表3所示，各個(gè)化合物在線性范圍內(nèi)的回歸方程線性關(guān)系良好。

表3 5種化合物的線性關(guān)系考察結(jié)果

2)精密度 低質(zhì)量濃度組、中質(zhì)量濃度組和高質(zhì)量濃度組中木犀草素、木犀草苷、槲皮素、紫云英苷、蘆丁峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.83%～4.05%之間，表明分析方法的精密度良好。

3)穩(wěn)定性 木犀草素、木犀草苷、槲皮素、紫云英苷、蘆丁峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.44%、1.25%、2.73%、3.01%、0.54%，說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

4)重復(fù)性 木犀草素、木犀草苷、槲皮素、紫云英苷、蘆丁峰面積RSD分別為0.51%、0.77%、1.42%、1.43%、0.96%，表明該方法重復(fù)性較好。

5)加標(biāo)回收率 按照1.6.4中加標(biāo)回收率的考察方法，計(jì)算木犀草素、木犀草苷、槲皮素、紫云英苷、蘆丁的加標(biāo)回收率與RSD，結(jié)果如表4所示，說明此方法可靠。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5)HPLC結(jié)果 黃金菊各化合物含量如表5所示。蘆丁和槲皮素的含量分別為2.2604 mg/g、1.8301 mg/g；木犀草苷的含量比木犀草素略高；紫云英苷含量為0.2809 mg/g，為5種化合物中含量最低的。

表5 黃金菊中主要黃酮化合物含量

3 結(jié)論

3.1 黃金菊總黃酮提取工藝研究

黃酮的提取會(huì)受到提取液類型、提取溫度、提取方法等多方面因素的影響。本文采用響應(yīng)面法優(yōu)化黃金菊總黃酮提取工藝，得到了最佳工藝參數(shù)：超聲提取溫度60℃，超聲提取時(shí)間30 min，料液比1∶50(g/mL)；提取率最高為9.01%，是回流法[9]的1.71倍，醇提法的3.2倍[21]。提取率較高的原因可能是超聲波的震蕩破壞了植物細(xì)胞和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)加速透過細(xì)胞膜，從而提高了樣品中總黃酮的提取率。

3.2 黃酮類化合物的組分分析

本研究采用高效液相色譜法(HPLC)測定黃金菊中木犀草素、木犀草苷、槲皮素、紫云英苷、蘆丁5種黃酮類化合物，建立了精密度高、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好的HPLC測定方法，可作為菊花中黃酮類成分的檢測方法；研究發(fā)現(xiàn)麻城黃金菊中蘆丁和槲皮素的含量較高，分別為0.13%、0.18%；紫云英苷為0.029%，木犀草素、木犀草苷的含量分別為0.042%、0.0614%，并且這些組分均具有良好的抗氧化性能，說明黃金菊具有非常高的研究和商用價(jià)值。