陳 思，李俐霜，王 毅，孫婭楠，糜志遠(yuǎn)

(1 湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068；2 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700)

皮膚是脊椎動(dòng)物全身最大的器官，是保護(hù)各種組織和器官免受物理、機(jī)械、化學(xué)和病原微生物侵害的第一道防線[1-2]。皮膚創(chuàng)傷愈合是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，涉及一系列復(fù)雜的生物過(guò)程[3]，包括防止炎癥的產(chǎn)生、細(xì)胞的增殖與分化、血管系統(tǒng)的重塑與恢復(fù)和結(jié)締組織的形成，對(duì)傷口愈合都具有重要意義[4-5]。皮膚由表皮層、真皮層、皮下組織構(gòu)成，真皮層位于表皮層下方，是構(gòu)成皮膚的主體。真皮層是致密的結(jié)締組織，有許多彈力纖維和膠原纖維，故具有彈性和韌性；有豐富的血管和神經(jīng)，故能感受外界刺激[6]。因此，創(chuàng)面愈合過(guò)程中膠原纖維的變化與血管及其他附屬器官的重建直接影響了創(chuàng)面愈合后的皮膚屏障功能，所以活體評(píng)估創(chuàng)面部位的病理變化，可為臨床用藥和治療提供指導(dǎo)。

鹿茸是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)具有完全再生能力的哺乳動(dòng)物附屬器官[7]，可在90～120 d內(nèi)完成血管、神經(jīng)、表皮等組織的分化、發(fā)育到成熟的全過(guò)程[8]。鹿茸中存在表皮生長(zhǎng)因子[9]，可以推測(cè)其含有一些有效活性成分，具有很強(qiáng)的促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合的能力。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用雙光子激發(fā)熒光(Two-Photon Excitation Fluorescence，TPEF)成像、二次諧波(Second Harmonic Generation，SHG)成像與毛細(xì)血管鏡系統(tǒng)活體評(píng)估鹿茸蛋白粗提物(Pilose Antler Extract，PAEs)給藥后創(chuàng)面組織表皮厚度、真皮層膠原纖維的含量情況及毛細(xì)血管的構(gòu)建情況，建立一種基于光學(xué)成像技術(shù)活體評(píng)價(jià)皮膚愈合過(guò)程的實(shí)驗(yàn)方法，為研究藥物促愈合過(guò)程提供新的研究思路與研究方法；并以PAEs為代表藥物應(yīng)用該方法評(píng)價(jià)其促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的藥效作用。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，15只，雄性，體重(150±10)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(京)2016-0006。將其飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗的環(huán)境中，自由攝食和飲水。

1.2 儀器與試劑

鹿茸來(lái)源為吉林云鹿集團(tuán)，為鹿茸上段。

氨基酸標(biāo)品(Aglient)；HPLC-MS/MS系統(tǒng)(Sciex)；BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒(Thermo，23227)；蛋白marker(Thermo，26619)；重組人表皮生長(zhǎng)因子(易孚，國(guó)藥準(zhǔn)字S20020112)；SDS-PAGE電泳預(yù)制膠試劑盒(索萊寶，P1200)；凝膠成像儀(BIO-RAD，733BR2310)；電泳儀(BIO-RAD，MP Tetra)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad, PR4100)；雙光子掃描顯微鏡(Olympus，F(xiàn)V1000MPE)；CapiScope毛細(xì)血管鏡系統(tǒng)(KK Technology，CAM1CVF)。

2 方法

2.1 鹿茸水溶性蛋白粗提取

2.1.1鹿茸水溶性蛋白粗提取按照本實(shí)驗(yàn)室前期提取工作進(jìn)行提取[9]，得到PAEs。

2.1.2PAEs蛋白成分分析按照Thermo公司BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒的要求測(cè)定蛋白含量。

PAEs采用10%的分離膠，5%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。利用SDS-PAGE進(jìn)行分離，電泳結(jié)束后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后，白光下觀察蛋白條帶，與蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)條帶的相對(duì)位置確定蛋白分子量分布范圍。

PAEs交由華大基因有限公司進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。

2.1.3PAEs游離氨基酸成分分析

1)色譜條件 PFP色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters)；流動(dòng)相為A(水，含0.1%甲酸)∶B(甲醇)，梯度洗脫程序：0～6.0 min，5%～95% B；6.0～8.0 min，95% B～95%B；8.0～8.01 min，95% B～5%B；8.01～10.0 min，5% B～5% B。流速為0.2 mL·min-1；柱溫為35℃；樣品室溫度為6 ℃；進(jìn)樣量為1 μL。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，氣簾氣(N2)為276 kPa，碰撞氣(N2)為9×6.895kPa，噴霧電壓為+5500.00 V，霧化溫度為550.00 °C，霧化氣(Ion Source Gas1, N2)和輔助氣(Ion Source Gas2, N2)均為55.00×6.895 kPa。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式正離子掃描。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1模型建立異氟烷氣麻大鼠，用脫毛膏脫去背部區(qū)域毛發(fā)，溫水擦干。手術(shù)區(qū)域局部消毒后，于大鼠背部脊柱兩側(cè)旁開1 cm處減去一塊直徑1.4 cm，創(chuàng)面面積1.54 cm2的圓形。全層切除皮膚，開放創(chuàng)面，深達(dá)肌層，充分止血，單籠飼養(yǎng)。做好標(biāo)記。

2.2.2分組給藥15只大鼠隨機(jī)分為陽(yáng)性藥(rh-EGF)組，鹿茸蛋白(PAEs-H/M/L)高、中、低劑量組，模型組(Konjac gum)等5組，每組3只。每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左側(cè)創(chuàng)口外敷生理鹽水；依據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果PAEs水溶后混合魔芋膠制成水凝膠外敷：低劑量組(2 mg/mL)PAEs,中劑量組(4 mg/mL)PAEs，高劑量組(8 mg/mL)外敷100 μL;陽(yáng)性藥組用生理鹽水配成濃度為 7IU/μL的溶液外敷100 μL。待吸收后,將大鼠置于清潔籠內(nèi)單籠飼養(yǎng)，自由食水，每天用藥。

2.2.3創(chuàng)面愈合情況測(cè)定造模首次敷藥10 d后用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量未愈合創(chuàng)面的縱徑和橫徑，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-殘余創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。

2.2.4創(chuàng)面TPEF成像掃描將用異氟烷氣麻后的大鼠固定于雙光子顯微鏡載物臺(tái)上，采用數(shù)值孔徑為1.05的25倍水浸顯微物鏡對(duì)表皮組織進(jìn)行Z軸掃描。采用激射波長(zhǎng)750 nm，步進(jìn)2 μm，圖像采集像素512×512 pixel，采集速度4 μm/pixel。

2.2.5創(chuàng)面皮膚病理染色給藥10 d后進(jìn)行大鼠皮膚活組織取材。取創(chuàng)面及皮膚周圍的全層及皮下組織，將皮膚組織置于4%多聚甲醛中固定48 h，常規(guī)組織修塊、脫水、透明、石蠟包埋后，制成4 μm組織切片后行常規(guī)HE染色，光鏡觀察創(chuàng)面組織結(jié)構(gòu)改變。

2.2.6創(chuàng)面SHG信號(hào)采集將用異氟烷氣麻后的大鼠固定于雙光子顯微鏡載物臺(tái)上，采用數(shù)值孔徑為1.05的25倍水浸顯微物鏡收集創(chuàng)面皮膚SHG信號(hào)，分色鏡690 nm，激射波長(zhǎng)950 nm，濾光片475 nm/10nm(中心波長(zhǎng)/帶寬)，對(duì)創(chuàng)面皮膚進(jìn)行縱向掃描，步進(jìn)2 μm，圖像采集像素512×512 pixel，采集速度4 μm/pixel。

2.2.7創(chuàng)面毛細(xì)血管數(shù)據(jù)采集將麻醉后的大鼠固定于毛細(xì)血管鏡系統(tǒng)下，記錄創(chuàng)面部位新生的毛細(xì)血管及毛囊的生長(zhǎng)情況。

圖 1 鹿茸蛋白電泳圖

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 PAEs總蛋白含量測(cè)定及蛋白成分測(cè)定

使用BCA法蛋白含量測(cè)定試劑盒測(cè)得的OD值均在標(biāo)準(zhǔn)曲線y= 0.9431x+ 0.198上(R2=0.9965)，計(jì)算得出蛋白含量為61.29%。由SDS-PAGE蛋白電泳圖(圖1)可以得出鹿茸蛋白廣泛分布于55～250 kD 之間，且多為大分子蛋白。通過(guò)PAEs蛋白質(zhì)鑒定分析共鑒定出135種蛋白。其中，Kelch-like protein 20促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合和高爾基體后轉(zhuǎn)運(yùn)，在血管生成過(guò)程中作為內(nèi)皮細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)劑。

表1 PAEs中主要蛋白質(zhì)

3.2 PAE成分分析

由圖2可知，確定了PAEs中的18種游離氨基酸。其中Glycine、Leucine、Alanine含量最高，為生物體內(nèi)組成蛋白質(zhì)的主要氨基酸。另外，還檢測(cè)出了Proline、Hydroxyproline等組成動(dòng)物膠原蛋白的重要成分。由表2可知，18種游離氨基酸大多在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝過(guò)程中處于重要地位，參與許多重要化學(xué)反應(yīng)，主要功能為促進(jìn)身體正常生長(zhǎng)，修復(fù)組織、肌肉，并給身體組織提供能量。

圖 2 PAEs中游離氨基酸含量

表2 主要氨基酸功能

3.3 創(chuàng)面愈合情況測(cè)定

給藥10 d后，對(duì)大鼠創(chuàng)傷部位進(jìn)行拍照，觀察創(chuàng)面愈合情況(圖3a)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在未給予PAEs時(shí)創(chuàng)面緩慢愈合，模型組左(N.S)、右(Konjac gum)無(wú)顯著性差異，表明藥物所用基質(zhì)魔芋膠及生理鹽水不具有促進(jìn)傷口愈合的作用，造模成功(圖3b)；由圖3c可見，造模后1 d各給藥組均具有促進(jìn)傷口愈合的作用，但創(chuàng)面愈合率無(wú)顯著性差異；給藥10 d，PAEs中高劑量組及rh-EGF組創(chuàng)面愈合率顯著高于空白對(duì)照組(p<0.05)。

圖 3 PAEs促創(chuàng)面愈合情況

3.4 創(chuàng)面TEPF成像

通過(guò)TPEF成像技術(shù)對(duì)大鼠新生皮膚邊緣表皮厚度進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，在10 d，與模型組比較，PAEs-H/M組大鼠表皮厚度明顯增加(p<0.05)(圖4c)。

(a)大鼠創(chuàng)面皮膚TEPE成像

圖 5 創(chuàng)面皮膚切片HE染色結(jié)果

3.5 創(chuàng)面皮膚病理染色

給藥10 d，除模型組外，各組創(chuàng)口邊緣出現(xiàn)大量處于生長(zhǎng)期的毛囊，外側(cè)可見少量毛發(fā)，創(chuàng)面面積有不同程度的縮小。模型組創(chuàng)口面積較大，區(qū)域內(nèi)完全缺乏附件生長(zhǎng)。其余各組創(chuàng)面收縮明顯,表皮層厚度增加，PAE-H/M組厚度較模型組顯著增加(p<0.05)。

3.6 創(chuàng)面SHG信號(hào)采集

為了研究創(chuàng)傷周圍膠原纖維的排列及含量變化，通過(guò)SHG成像技術(shù)檢測(cè)真皮層膠原纖維，并通過(guò)Image J軟件分析膠原纖維[11]含量變化情況圖6a顯示，網(wǎng)狀層、乳頭層均向創(chuàng)口方向延伸填充修復(fù)創(chuàng)口，膠原纖維呈隨機(jī)排列的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。如圖6b顯示，模型組左、右膠原纖維的排列及含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。給藥10 d后各組膠原纖維變粗增多，SHG信號(hào)增強(qiáng)。與模型組相比，PAEs-H、M組膠原纖維顯著增多(p<0.05)，SHG信號(hào)更強(qiáng)，表明PAEs組新生膠原含量較高。

圖 6 創(chuàng)面愈合過(guò)程中真皮層膠原纖維SHG成像

3.7 創(chuàng)面毛細(xì)血管數(shù)據(jù)采集

將麻醉后的大鼠固定于毛細(xì)血管鏡系統(tǒng)下，記錄創(chuàng)面部位的毛細(xì)血管的生長(zhǎng)情況。10 d，創(chuàng)口邊緣出現(xiàn)較多新生血管，交織成網(wǎng)狀(圖7a)。其中：模型組毛細(xì)血管未交織成網(wǎng)，新生游離毛細(xì)血管較多；給藥組毛細(xì)血管交織成網(wǎng)，毛細(xì)血管網(wǎng)數(shù)目增多，游離毛細(xì)血管較少。如圖7b所示，給藥10 d后，各給藥組較正常皮膚毛細(xì)血管網(wǎng)數(shù)目顯著降低(p<0.01)，與模型組相比略有增加但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。rh-EGF、PAEs-H/M/L組較正常皮膚游離毛細(xì)血管數(shù)目顯著降低(p<0.01)，與模型組相比PAEs-L組游離毛細(xì)血管數(shù)目顯著降低(p<0.05)。PAEs-H組較模型組血流量顯著下降(p<0.05)，提示毛細(xì)血管構(gòu)建良好，血流趨于穩(wěn)定(圖7d)。

藍(lán)色箭頭：游離毛細(xì)血管，綠色箭頭：毛細(xì)血管網(wǎng)

4 討論與結(jié)論

對(duì)鹿茸蛋白進(jìn)行成分分析，其蛋白含量為61.29%，主要為大分子蛋白，存在多種具有促進(jìn)身體組織修復(fù)、生長(zhǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì)和氨基酸。這很好地解釋了其具有促創(chuàng)傷愈合的作用，與“鹿茸具有加速創(chuàng)傷愈合的能力”的記載相一致。

既往研究創(chuàng)傷愈合過(guò)程的方法主要為切片染色。由于對(duì)切片的主觀選擇性導(dǎo)致只能對(duì)局部創(chuàng)面進(jìn)行檢測(cè)分析而無(wú)法評(píng)估整個(gè)創(chuàng)面在愈合過(guò)程中的三維結(jié)構(gòu)變化[12]。而TPEF可以直接獲得生物組織樣本不同深度的圖像和光譜信息[13]。TPEF成像技術(shù)具有靈敏度高、分辨率強(qiáng)和無(wú)創(chuàng)的特點(diǎn)，可以活體追蹤表皮層活細(xì)胞組織中內(nèi)源性熒光基團(tuán)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，反映表皮厚度的變化[14]，這彌補(bǔ)了HE染色不能檢測(cè)活體組織的缺點(diǎn)。結(jié)果顯示，與模型組相比，給藥10 d后PAEs-M/H組表皮厚度明顯增加，推測(cè)此時(shí)期表皮層中的皮膚附屬物較成熟，皮膚分層和皮膚附屬物重建是皮膚成熟的關(guān)鍵步驟[15-17]。在PAE-H/M表皮層厚度的顯著增加和腺體、細(xì)胞器的生成方面，傳統(tǒng)HE染色的驗(yàn)證與光學(xué)成像結(jié)果基本吻合。

SHG成像技術(shù)以生物組織非中心對(duì)稱性的內(nèi)源性信號(hào)為來(lái)源而進(jìn)行激光掃描非線性光學(xué)顯微術(shù)，無(wú)需進(jìn)行離體組織染色，可以活體成像，對(duì)組織探測(cè)深、損傷小、分辨率高[18]。膠原纖維具有強(qiáng)烈的二階非線性極化率和結(jié)構(gòu)非中心對(duì)稱性，可以產(chǎn)生SHG。SHG成像技術(shù)可以活體觀察膠原纖維的病理變化。結(jié)果顯示，給藥10 d后PAEs-H/M組SHG信號(hào)強(qiáng)度增加。

毛細(xì)血管鏡系統(tǒng)是一種非侵入性、無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)手段，能夠直接獲得皮膚表面毛細(xì)血管的高分辨率成像圖，同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)量化分析，通過(guò)分析可得皮膚表面的毛細(xì)血管的生長(zhǎng)情況。在受損皮膚區(qū)域能否快速建立血液循環(huán)，也是對(duì)正常皮膚功能的一種評(píng)價(jià)[19]。給藥10 d后，各給藥組較正常皮膚毛細(xì)血管網(wǎng)數(shù)目顯著降低，與模型組相比略有增加但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，PAEs-H組較模型組血流量顯著下降，提示毛細(xì)血管構(gòu)建良好，血流趨于穩(wěn)定。毛細(xì)血管鏡系統(tǒng)觀察新生毛細(xì)血管具有一定的局限性，既往研究表明部分新生毛細(xì)血管垂直于創(chuàng)面生長(zhǎng)[20]，而毛細(xì)血管鏡系統(tǒng)只拍取平行于皮膚表面的一些新生毛細(xì)血管。

綜上所述，本研究通過(guò)TEPF、SHG和毛細(xì)血管鏡系統(tǒng)聯(lián)合使用檢測(cè)皮膚創(chuàng)傷大鼠皮下表皮層厚度變化、真皮層膠原纖維的排列與含量變化和新生毛細(xì)血管的生長(zhǎng)情況，評(píng)估PAEs促創(chuàng)傷愈合后表皮層、真皮層及血管的功能恢復(fù)和重建。結(jié)果表明，PAEs中高劑量具有良好的促創(chuàng)傷愈合作用，能夠加速創(chuàng)傷愈合，改善愈合質(zhì)量，促進(jìn)膠原纖維的形成和毛細(xì)血管的重建，為鹿茸蛋白促創(chuàng)傷愈合提供了新的證據(jù)。而TEPF成像、SHG成像和毛細(xì)血管鏡系統(tǒng)將成為一種新型對(duì)無(wú)創(chuàng)活體皮下組織和附屬器官直接進(jìn)行成像，為創(chuàng)傷相關(guān)疾病的診斷和藥物治療提供新的檢測(cè)方法，為促創(chuàng)傷愈合的研究提供新思路。