黃智琪，嚴(yán)鈺敏，郭 晶，郭繼深，朱杰寧，方咸宏，徐金東，單志新，

（1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006；2.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510515；3.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006；4.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510280；5.廣東省心血管病研究所，廣東省人民醫(yī)院//廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東廣州 510080）

目前，心血管疾病已占所有疾病死因的31%，是全球患者死亡的主要原因之一。心肌纖維化是導(dǎo)致心力衰竭的主要病理基礎(chǔ)，是公認(rèn)的導(dǎo)致高發(fā)病率和高死亡率的病因［1］。心肌纖維化是病理性細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重塑的過(guò)程［2］。最初的心肌纖維化可促進(jìn)心肌傷口愈合和組織再生，細(xì)胞外基質(zhì)沉積可起到保護(hù)作用，但持續(xù)性的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，尤其是I 型膠原分泌，導(dǎo)致基質(zhì)組成和質(zhì)量異常，進(jìn)而心肌功能受損［1-2］。已知多種疾病都會(huì)促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生，如高血壓性心臟病、糖尿病性肥厚型心肌病和特發(fā)性擴(kuò)張型心肌病［2-3］，而心肌梗死后也常會(huì)引起心肌纖維化疤痕。環(huán)狀RNA經(jīng)反向剪接而成，相對(duì)于線性形式，circRNA 在細(xì)胞中有著豐富且穩(wěn)定的存在［4-5］。越來(lái)越多的證據(jù)表明circRNA 參與包括心肌纖維化［6-7］、心肌缺血/再灌注損傷［8-9］、心力衰竭［10-11］及其他多種心血管疾病過(guò)程［12］。因此，深入研究circRNAs 調(diào)節(jié)心肌纖維化的作用機(jī)制，可為心力衰竭的治療研究提供科學(xué)資料，具有重要意義。我們已證實(shí)小鼠源性的circRNA_005647 可吸附miR-27b-3p，并解除miR-27b-3p對(duì)靶基因PPAR-γ的抑制作用，進(jìn)而發(fā)揮抑制心肌纖維化的作用［13］。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)與circRNA_005647 同源的人circ_0036176 在心衰病人心肌組織中表達(dá)亦上調(diào)，但circ_0036176 對(duì)心肌纖維化的調(diào)節(jié)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在初步探討circ_0036176 在心肌纖維化中的生物學(xué)功能，并了解其發(fā)揮作用的分子機(jī)制，或可為心肌病的臨床治療提供潛在干預(yù)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

利用心衰患者和健康器官捐獻(xiàn)者的心肌組織進(jìn)行circ_0036176 和宿主基因Myo9a 表達(dá)的RTqPCR 檢測(cè)。本文所涉及的臨床樣本實(shí)驗(yàn)均經(jīng)廣東省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［批準(zhǔn)號(hào)No.GDREC20 19238H（R1）］，所有患者均簽署知情同意書(shū)，相關(guān)心肌組織標(biāo)本均由廣東省心血管病研究所進(jìn)行提供，病例資料信息同以往報(bào)道［14］。

1.2 動(dòng) 物

SPF 級(jí)出生日齡1-3 d 的C57BL/6 乳小鼠，雌雄不限，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行繁育與提供，乳小鼠的生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（粵）2013-0034。

1.3 主要試劑

特級(jí)澳洲胎牛血清與DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基（BioInd）；miR-218-5p、-100-5p、-27b-3p 等mimic（廣州銳博）；轉(zhuǎn)染試劑Oligofectamine（Invitrogen）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）；RNase R（ribonuclease R）（廣州吉賽生物）；放線菌素D（生工有限公司）；RIPA 裂解液（碧云天）；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（碧云天）；抗GAPDH 抗體、抗TGF-β1抗體（Protein Technology）；抗Ⅰ型膠原蛋白α1 鏈（type Ⅰcollagen α1，COL1A1）、抗Ⅲ型膠原蛋白α1 鏈（typeⅢcollagen α1，COL3A1）抗體（Invitrogen）；抗α 平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（Abcam）；BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo）；蛋白Marker（Fermentas）；ECL 發(fā)光液（Millipore）；PVDF膜（What-man）；血管緊張素Ⅱ（Sigma）；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 主要方法

1.4.1 Masson 三色染色 從浸泡于冰生理鹽水中的人心肌組織標(biāo)本中切取出大小適宜的組織塊，放置在多聚甲醛中做固定處理，后將固定好的組織塊進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋操作，靜置凝固后進(jìn)行連續(xù)性切片，將切片厚度控制在4 μm。獲得組織切片后，利用Masson 染色試劑盒染色，最終將切片標(biāo)本置于顯微鏡下，觀察健康組與心衰病人組之間膠原纖維的沉積差異，并對(duì)其進(jìn)行拍照。

1.4.2 人心房肌成纖維細(xì)胞的原代分離、培養(yǎng) 從手術(shù)室中取得的左心耳用冷PBS清洗干凈，用滅菌的剪刀和鑷子清除脂肪及筋膜后將心耳組織剪碎，參照我們已報(bào)道的方法進(jìn)行HAF 的原代分離和培養(yǎng)［14］。本文實(shí)驗(yàn)使用的人心房肌成纖維細(xì)胞（human atrial fibroblasts，HAFs）為第3～5代。

1.4.3 小鼠心肌成纖維細(xì)胞的原代分離、培養(yǎng)、處理 基于已有報(bào)道的方法［15］并進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，將小鼠心肌成纖維細(xì)胞的進(jìn)行原代分離、培養(yǎng)。準(zhǔn)備適齡的SPF 級(jí)別的C57BL/6 小鼠，利用眼科剪從乳鼠體內(nèi)取出完整心臟，隨后立即對(duì)組織進(jìn)行適當(dāng)修剪與破碎，添加濃度為2×104U/L DNA 酶和2.5 g/L 胰酶的混合液，在37 ℃的條件下進(jìn)行反復(fù)數(shù)次酶消化，隨后把分離得到小鼠心肌成纖維細(xì)胞（mouse cardiac fibroblasts，mCFs）做離心處理，并利用含有10%血清濃度（100 mL 完全培養(yǎng)基中含10 mL 胎牛血清）的DMEM培養(yǎng)基對(duì)離心獲得的細(xì)胞沉淀進(jìn)行輕柔的重懸，而后將其置于潔凈無(wú)菌的培養(yǎng)瓶中。當(dāng)小鼠成纖維細(xì)胞的接觸密度增長(zhǎng)到接近90%的時(shí)候，即可進(jìn)行傳代處理，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中所用的mCFs代數(shù)均為P2。

1.4.4 Circ_0036176 重組腺病毒的構(gòu)建和包裝根據(jù)人circ_0036176 模板DNA 序列和腺病毒穿梭質(zhì)粒pAd-Track-cmv 多克隆位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)合成引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到circ_0036176模板的DNA插入片段。參照已報(bào)道方法［12］，將circ_0036176 模板DNA利用定向插入的方式，在pAd-Track-cmv載體上實(shí)現(xiàn)重組構(gòu)建。并進(jìn)一步將pAd-Track-cmvcirc_0036176 與pAd-Easy-I 在BJ5183E.Coli中 進(jìn)行重組。而后，利用PacI 酶將重組circ_0036176 腺病毒載體進(jìn)行酶切，利用轉(zhuǎn)染試劑將其轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，給予體積分?jǐn)?shù)5%血清的DMEM 培養(yǎng)基并于37 ℃恒溫下培養(yǎng)，待綠色熒光蛋白顯著表達(dá)則提示該重組腺病毒完成包裝，并做進(jìn)一步的病毒擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)時(shí)以rAd-GFP 作為對(duì)照組腺病毒（circ_0036176和rAd-GFP的MOI均是5）。

1.4.5 RT-qPCR 利用Trizol 法提取CFs 的總RNA，而后取800 ng，將其與5×逆轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行充分混合，同時(shí)使用Oligo（dT）15和random primers 進(jìn)行RNA 的逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。選擇GAPDH 作內(nèi)參照，用相應(yīng)的引物檢測(cè)TGF-β1 以及纖維化相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)水平。在ViiA 7 Quantitative PCR System（Applied Biosystems）進(jìn) 行PCR 反 應(yīng)后，TGF-β1 和纖維化相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)程度用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。所涉及引物均經(jīng)Invitrogen 進(jìn)行合成，具體序列見(jiàn)圖1。

1.4.6 Western blot 取適量的1×PBS 對(duì)處理后的成纖維細(xì)胞進(jìn)行清洗，將蛋白裂解液分別均勻滴加入每個(gè)板孔中，靜置于冰上10 min，輕輕刮取、裂解細(xì)胞，用移液槍收集裂解液，于10 000×g的轉(zhuǎn)速下4 ℃離心13 min 使細(xì)胞沉淀聚集，隨后分裝上層澄清蛋白裂解液，沉淀?xiàng)壢ァ５鞍踪|(zhì)定量18 μg，加入等量的4×SDS-PAGE 緩沖液，99 ℃金屬浴加熱10 min，使蛋白質(zhì)完全變性。取樣品在恒壓條件下進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，在恒流條件下進(jìn)行PVDF膜轉(zhuǎn)膜，在室溫環(huán)境下利用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉處理。按照蛋白對(duì)應(yīng)的不同位置，裁剪PVDF 膜條帶，并分別利用相應(yīng)的特異性抗體［COL1A1（1：2 000）、COL3A1（1：2 000）、TGF-β1（1：2 000）、α-SMA（1：2 000）］在4 ℃環(huán)境下緩慢均勻孵育過(guò)夜后將其取出，于常溫條件下分別與對(duì)應(yīng)的二抗稀釋液充分孵育1 h。最后利用ECL 發(fā)光試劑盒對(duì)目的蛋白進(jìn)行顯影處理。本文均使用GAPDH（1：5 000）作為內(nèi)參，借助ImageJ 對(duì)其灰度值做分析處理，對(duì)各目的蛋白進(jìn)行表達(dá)情況分析。

1.4.7 雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 利用特異的引物擴(kuò)增出circ_0036176 堿基片段，并將擴(kuò)增得到的片段通過(guò)定向克隆的方式，連接至pGL3-promoter 載體上，構(gòu)建雙螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-circ_0036176。將HEK293 細(xì)胞均勻接種于24 孔板中，穩(wěn)定培養(yǎng)24 h 后，利用Lipofectamine 2000 對(duì)400 ng重組螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒、0.9 ng pRL-TK（可在細(xì)胞中表達(dá)出海腎螢光素酶，作為內(nèi)參照質(zhì)粒）、100 nM miRNA 進(jìn)行包裹，20 min后分別共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，恒溫培養(yǎng)24 h。測(cè)定螢火蟲(chóng)螢光（Firefly luciferase，F(xiàn)L）和海腎螢光（Ranilla luciferase，RL）強(qiáng)度，由FL/ RL 比值推斷circ_0036176 與不同微小RNA間的結(jié)合能力的強(qiáng)弱。

表1 PCR引物序列Table.1 The sequences of the primers for PCR

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Image J 和GraphPad Prism8 分析與作圖，用SPSS 21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，當(dāng)兩組間作比較時(shí)，采用t檢驗(yàn)；當(dāng)多組間作比較時(shí)，采用單因素方差分析；在組間兩兩做比較時(shí)，則用Bonferroni 校正的t檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)，則為數(shù)據(jù)間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Circ_0036176在心衰心肌組織中表達(dá)增加

Masson 染色結(jié)果顯示心衰病人心肌組織中的微血管外周及細(xì)胞間質(zhì)膠原沉積，較健康人組有增加趨勢(shì)，并出現(xiàn)了較高程度的心肌纖維化（P＜0.001；圖1A）。RT-qPCR 結(jié)果顯示，circ_0036176在心力衰竭患者心肌組織中表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），而其宿主基因Myo9a 的表達(dá)變化不明顯（圖1B）。在Ang-Ⅱ處理的HAFs 心肌纖維化的細(xì)胞模型中，發(fā)現(xiàn)circ_0036176 和Myo9a 的表達(dá)一致性降低（P＜0.01；圖1C）。分別以人cDNA 和基因組DNA 為模板，PCR結(jié)果顯示，從人cDNA和gDNA中可PCR擴(kuò)增到Myo9a 基因產(chǎn)物，而circ_0036176 只能從人cDNA 中擴(kuò)增到（圖1D）。通過(guò)DNA 測(cè)序的方法，在PCR 產(chǎn)物中成功檢測(cè)出circ_0036176 的特異接頭序（TATGACTCTGAGCCGTTATTTTACCAAGAA）（圖1E）。

圖1 Circ_0036176在心衰心肌組織中表達(dá)增加Fig.1 Upregulation of circ_0036176 in the myocardium of patients with heart failure

2.2 Circ_0036176 在AC16 心肌細(xì)胞中的分布及穩(wěn)定性鑒定

定量PCR 和FISH 檢測(cè)結(jié)果顯示，circ_0036176除了富集于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞核內(nèi)也有分布（圖2A、B）。RT-qPCR 結(jié)果顯示，在放線菌素D 和RNase R 處理的人心肌細(xì)胞AC16 中后，Myo9a mRNA 水平相對(duì)于circ_0036176，發(fā)生較大程度的下降，此結(jié)果表明circ_0036176 具有較好的環(huán)狀RNA典型的穩(wěn)定性（P＜0.05；圖2C、D）。

圖2 Circ_0036176在AC16心肌細(xì)胞中的分布及RNA穩(wěn)定性鑒定Fig.2 Cellular distribution and RNA stability of circ_0036176 in AC16 cardiomyocytes

2.3 Circ_0036176抑制心肌成纖維細(xì)胞纖維化表型

利用重組circ_0036176 腺病毒感染HAFs 24 h后，共表達(dá)的綠色熒光蛋白（GFP）提示circ_0036176 已在成纖維細(xì)胞中成功過(guò)表達(dá)（圖3A）。通過(guò)RT-qPCR 對(duì)HAFs 中纖維化相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)circ_0036176 后可起到明顯的抑制作用（P＜0.05；圖3B）。進(jìn)一步的，利用Western-blot，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)circ_0036176 后，COL1A1、COL3A1、TGF-β1 和α-SMA 的蛋白表達(dá)同樣受到了抑制（P＜0.01；圖3C）。

圖3 circ_0036176在HAFs中具有下調(diào)纖維化相關(guān)基因表達(dá)的生物學(xué)功能Fig.3 Circ_0036176 inhibited the expression of fibrosis-related genes in HAFs

2.4 miR-218-5p 介導(dǎo)circ_0036176 抑制纖維化相關(guān)基因的表達(dá)

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)（https：//circinteractome.nia.nih.gov/index.html；http：//starbase.sysu.edu.cn/starbase2/index.php）結(jié)果顯示，circ_0036176 序列上有多個(gè)潛在的miRNAs 結(jié)合位點(diǎn)，并選擇12個(gè)心肌中高表達(dá)miRNAs，分別為：miR-7-5p、miR-99b-5p、miR-100-5p、miR-154-3p、miR-200b-3p、miR-200c-3p、miR-218-5p、miR-330-3p、miR-429、miR-485-3p、miR-487a-3p 和miR-665 進(jìn) 行鑒 定（圖4A）。以miR-27b-3p 作為無(wú)關(guān)對(duì)照組，將上述miRNA 的模擬物和pGL3-circ_0036176 共轉(zhuǎn)染至HEK293 細(xì)胞中進(jìn)行檢測(cè)。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)提示，circ_0036176 與5 個(gè)微小RNA 發(fā)生較為明顯的結(jié)合，其分別為miR-154-3p、miR-200b-3p、miR-218-5p、miR-487a-3p 和miR-665（P＜0.05；圖4B）。

進(jìn)一步通過(guò)RAP 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circ_0036176 與miR-154-3p、miR-200b-3p、miR-218-5p、miR-487a-3p 和miR-665 間結(jié)合能力的差異，利用circ_0036176 特異的生物素標(biāo)記寡核苷酸探針下拉AC16 細(xì)胞中circ_0036176，提取RNA 檢測(cè)circ_0036176 結(jié)合的相關(guān)miRNA 水平。RAP 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circ_0036176 可有效地結(jié)合miR-218-5p 和miR-665，而結(jié)合miR-218-5p 量的相對(duì)更多（P＜0.001；圖4C）。

為了明確miR-218-5p 是否參與介導(dǎo)circ_0036176發(fā)揮抑制心肌纖維化表型的作用，將miR-218-5p 模擬物轉(zhuǎn)染mCFs。Western blot 結(jié)果顯示，與Scramble 組相比，過(guò)表達(dá)miR-218-5p 可以促進(jìn)COL3A1、COL1A1、TGF-β1 和α-SMA 的表達(dá)（P＜0.01；圖4D）。而在mCFs 中同時(shí)過(guò)表達(dá)circ_0036176 和miR-218-5p，miR-218-5p 可有效逆轉(zhuǎn)circ_0036176 對(duì)心肌纖維化相關(guān)基因表達(dá)的抑制作用（P＜0.05；圖4E）。

圖4 circ_0036176以結(jié)合miR-218-5p方式抑制mCFs中纖維化相關(guān)基因表達(dá)Fig.4 Circ_0036176 inhibited fibrosis-related gene expression through sponging miR-218-5p in mCFs

3 討論

本文中，我們發(fā)現(xiàn)circ_0036176 在心衰心肌中表達(dá)上調(diào)，但在經(jīng)AngII 處理的HAFs 中表達(dá)下調(diào)。與之相似的，課題組前期工作中發(fā)現(xiàn)微小RNA miR-214-3p 在Ang-Ⅱ刺激下的小鼠整體模型與細(xì)胞模型中的表達(dá)出現(xiàn)相反趨勢(shì)［16-17］；KLHL20 是環(huán)形RNA circRNA_100395 的宿主基因，兩者在發(fā)生纖維化的人心耳組織中表達(dá)一致降低，而在經(jīng)過(guò)了Ang-Ⅱ處理的人心耳成纖維細(xì)胞中，兩者的表達(dá)一致增加［15］。針對(duì)circ_0036176在AngⅡ刺激下的HAFs 中表達(dá)下調(diào)，而在心衰心肌中表達(dá)增加的現(xiàn)象，其可能的原因是，相對(duì)于原代分離出來(lái)的細(xì)胞，整體水平的心肌中存在多種類型的細(xì)胞和復(fù)雜的病理刺激因素，如氧化應(yīng)激、急慢性炎癥等，在這些因素綜合作用，最終引起心衰心肌中circ_0036176 表達(dá)增加，但其中具體的調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待深入探討。

我們以往報(bào)道了小鼠源性circRNA_005647 具有抑制纖維化相關(guān)基因表達(dá)的作用［13］，而本文證實(shí)來(lái)自同一宿主基因Myo9a 的人源性circ_0036176同樣可以抑制心肌纖維化。我們既往已明確circRNA_005647可以特異吸附miR-27b-3p的方式發(fā)揮其生物學(xué)功能，盡管circRNA_005647 與人circ_0036176 的堿基序列比較相似（92.75%），但本文未發(fā)現(xiàn)circ_0036176 上具有miR-27b-3p 潛在的結(jié)合序列，提示同源的circRNA 即使有相同的生物學(xué)功能，但介導(dǎo)其生物學(xué)功能的分子機(jī)制可能不同。

在細(xì)胞RNA 的核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)中，我們證實(shí)circ_0036176 主要存在于mCFs 細(xì)胞質(zhì)中，這提示了此環(huán)形RNA 可能會(huì)通過(guò)經(jīng)典的特異吸附微小RNA 途徑來(lái)抑制心肌纖維化［18-19］，因此，我們借助生物信息學(xué)對(duì)circ_0036176 上潛在的miRNA 結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析，篩選了12 個(gè)可在心肌中高表達(dá)的miRNAs 進(jìn)行鑒定。根據(jù)雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)circ_0036176 可與12 個(gè)潛在微小RNA 中的5個(gè)發(fā)生有效結(jié)合，其分別為miR-154-3p、miR-200b-3p、miR-218-5p、miR-487a-3p 和miR-665；而RAP 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)circ_0036176 對(duì)miR-218-5p 的結(jié)合作用最顯著。功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-218-5p 具有促進(jìn)心肌纖維化相關(guān)基因表達(dá)的作用，并能有效逆轉(zhuǎn)circ_0036176 起到的抑制作用。因此，微小RNA miR-218-5p 可介導(dǎo)環(huán)形RNA circ_0036176 行使抑制纖維化的功能。既往研究證實(shí)miR-218-5p 可通過(guò)靶向RE1 沉默轉(zhuǎn)錄因子（RE1-silencing transcription factor，REST）發(fā)揮促進(jìn)心肌肥厚的作用［20］；降低miR-218-5p 的表達(dá)可以有效減緩大鼠心肌損傷及纖維化的發(fā)生進(jìn)程，同時(shí)可促進(jìn)血管生成［21］。但對(duì)于本文中參與生物學(xué)功能調(diào)控的miR-218-5p下游中起主導(dǎo)作用的目的基因，仍需進(jìn)一步探究。

綜上，本文明確了人源circ_0036176 可特異吸附miR-218-5p 來(lái)抑制纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，不同于同源的小鼠circRNA_005647 發(fā)揮抑制心肌纖維化作用的分子機(jī)制，目前尚未見(jiàn)有關(guān)同源circRNA 通過(guò)結(jié)合不同miRNA 發(fā)揮一致生物學(xué)作用的報(bào)道。本文尚存在一定局限性，還需在細(xì)胞水平明確circ_0036176 對(duì)mCFs 增殖和遷移的影響，并且我們擬繼續(xù)在整體動(dòng)物水平驗(yàn)證circ_0036176對(duì)心肌纖維化的抑制作用，并進(jìn)一步明確其下游作用靶基因和相關(guān)信號(hào)通路。