蒙永明 呂林艷 朱運(yùn)銳 黃源春 梁云飛 鄭志遠(yuǎn)

橫經(jīng)席提取物降血脂功效評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)研究

蒙永明1,2呂林艷1,2朱運(yùn)銳1,2黃源春1,2梁云飛1,2鄭志遠(yuǎn)1,2

（1.廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司，廣西 梧州 543000；2.廣西藥物提純工程技術(shù)研究中心，廣西 梧州 543000）

目的：研究和評(píng)價(jià)橫經(jīng)席提取物的降血脂功效。方法：建立高血脂斑馬魚模型，制備橫經(jīng)席根莖、枝葉和種子的提取物，并以高、中、低三種濃度分別處理高血脂斑馬魚，觀察和比較橫經(jīng)席不同部位提取物對(duì)高血脂斑馬魚甘油三脂、膽固醇、血流速度和血管壁厚度的影響。結(jié)果：橫經(jīng)席根莖、枝葉和種子的提取物均能降低高血脂斑馬魚的甘油三酯水平和膽固醇水平，并改善高血脂引起的血流速度和血管壁厚度異常。結(jié)論：橫經(jīng)席提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型具有降血脂功效。

橫經(jīng)席提取物；降血脂；功效評(píng)價(jià)

引言

橫經(jīng)席，又名薄葉紅厚殼、跌打?qū)④?、?dú)角風(fēng)等，其植株多個(gè)部位含有香豆素類、呫噸酮類、黃酮類、萜類等多種類化合物[1]，藥用前景廣闊，具有祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨、止痛、治療跌打損傷等功效。已有文獻(xiàn)公開了橫經(jīng)席的抗炎鎮(zhèn)痛作用，并且驗(yàn)證了其急性與毒性小的特點(diǎn)[2]。

橫經(jīng)席的種植周期長，多數(shù)源自于野生采摘[3]。隨著市場需求的增長，橫經(jīng)席藥材資源的供給相對(duì)緊張。鑒于橫經(jīng)席藥材的珍貴，如何進(jìn)一步開發(fā)更多的藥用功能、實(shí)現(xiàn)橫經(jīng)席藥材資源的綜合利用，是需要探討的技術(shù)問題。有關(guān)橫經(jīng)席的藥效學(xué)研究并不多見，目前未見有橫經(jīng)席其他藥用用途的報(bào)道。本文通過建立高血脂斑馬魚模型來開展實(shí)驗(yàn)，觀察比較橫經(jīng)席根莖、枝葉和種子的提取物對(duì)高血脂斑馬魚甘油三脂、膽固醇、血流速度和血管壁厚度的影響，以評(píng)價(jià)橫經(jīng)席提取物的降血脂功效。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

黑色素等位基因突變型半透明Albino品系斑馬魚，以自然成對(duì)交配繁殖方式進(jìn)行，年齡為受精后5天（5 dpf）的斑馬魚用于降血脂功效最大檢測濃度（maximum test concentration，MTC）測定及其功效評(píng)價(jià)。轉(zhuǎn)基因血管綠色熒光斑馬魚，以自然成對(duì)交配繁殖方式進(jìn)行，年齡為受精后5天（5 dpf）的斑馬魚用于改善血管壁厚度功效評(píng)價(jià)。

以上所述的實(shí)驗(yàn)用斑馬魚均飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚用水中（水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為450 μS·cm-1～550 μS·cm-1；pH為6.5～8.5；硬度為50 mg·L-1～100 mg·L-1CaCO3），由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司養(yǎng)魚中心繁殖提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（浙）2022-0004，飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC認(rèn)證（認(rèn)證編號(hào)：001458）的要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器、耗材與試劑

解剖顯微鏡（SZX7，日本OLYMPUS公司）；顯微注射儀（IM300，日本Narishige公司）；拉針儀（PC-10，日本Narishige公司）；CCD相機(jī)（VertA1，上海土森視覺科技有限公司）；電動(dòng)聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡（AZ100，日本Nikon公司）；精密電子天平（CP214，美國OHAUS公司）；6孔板（中國Nest Biotech公司）；心跳血流分析系統(tǒng)（ZebraBlood 3.4，法國ViewPoint Life Sciences公司）；激光共聚焦顯微鏡（A1R，日本Nikon公司）。

二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)BCCD8942，瑞士Sigma公司）；甲基纖維素（批號(hào)B2006074，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；膽固醇探針CholEsteryl BODIPY?542/563 C11（批號(hào)2291600，美國invitrogen公司）；油紅O（批號(hào)SHBM5455，美國Sigma公司）；1.2-丙二醇（批號(hào)20211117，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；純蛋黃粉（批號(hào)20200809，浙江艾格生物科技股份有限公司）；D-(+)-葡萄糖（批號(hào)20201105，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 藥物制備

取橫經(jīng)席根莖、枝葉和種子分別粉碎，各自稱取10 g所得藥粉加入50 mL純化水提取，保持微沸30 min，過濾，藥渣加入20 mL～30 mL純化水繼續(xù)提取，保持微沸20 min，再次過濾，合并兩次提取液，然后加入純化水定量至50 mL，即得含量為0.2 g·mL-1（每毫升提取液相當(dāng)于0.2 g生藥）的橫經(jīng)席提取物，以此作為樣品母液，并于-20 ℃分裝儲(chǔ)存，使用時(shí)稀釋。

陽性對(duì)照藥物：阿托伐他汀鈣片（以下簡稱阿托伐他汀鈣），白色片劑，批號(hào)202105219C，樂普醫(yī)療，陰涼避光儲(chǔ)存。用DMSO配制成11.6 mg·mL-1母液，-20 ℃分裝儲(chǔ)存，使用時(shí)稀釋。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTC測定

隨機(jī)選取5 dpf黑色素等位基因突變型半透明Albino品系斑馬魚于燒杯中，每燒杯30尾。分別水溶給予橫經(jīng)席根莖、橫經(jīng)席枝葉和橫經(jīng)席種子提取物高、中、低三種濃度的樣品溶液，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組和模型對(duì)照組，每杯容量為25 mL。除正常對(duì)照組外，其余各實(shí)驗(yàn)組均水溶給予高脂飼料（純蛋黃粉+葡萄糖）喂飼斑馬魚，建立斑馬魚高血脂模型。樣品與高脂飼料共同處理15 h（每天共同處理7.5 h）。在樣品處理期間，每天需統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組的斑馬魚死亡數(shù)量并及時(shí)移除。28 ℃處理48 h后，測定橫經(jīng)席樣品對(duì)高血脂模型斑馬魚的MTC。

2.2 降甘油三酯功效評(píng)價(jià)

斑馬魚高血脂模型建立如“2.1”節(jié)所述，增加陽性對(duì)照阿托伐他汀鈣11.6 μg·mL-1濃度，樣品與高脂飼料共同處理15 h（每天共同處理7.5 h）。28 ℃處理48 h后，給予油紅O進(jìn)行整體脂肪染色。染色結(jié)束后，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取10尾斑馬魚在解剖顯微鏡下拍照，用NIS-Elements D 3.20高級(jí)圖像處理軟件分析并采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚尾部血管染色強(qiáng)度，以該指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)橫經(jīng)席樣品降甘油三酯功效。

2.3 降膽固醇功效評(píng)價(jià)

斑馬魚高血脂模型建立如“2.1”節(jié)所述，增加陽性對(duì)照阿托伐他汀鈣11.6 μg·mL-1濃度，樣品與高脂飼料共同處理15 h（每天共同處理7.5 h）。28 ℃處理32 h時(shí)，注射膽固醇探針。繼續(xù)處理16 h后，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照，用NIS-Elements D 3.20高級(jí)圖像處理軟件分析并采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚尾部血管膽固醇熒光強(qiáng)度，以該指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)橫經(jīng)席樣品降膽固醇功效。

2.4 改善高血脂血流功效評(píng)價(jià)

斑馬魚高血脂模型建立如“2.1”節(jié)所述，增加陽性對(duì)照阿托伐他汀鈣11.6 μg·mL-1濃度，樣品與高脂飼料共同處理15 h（每天共同處理7.5 h）。28 ℃處理48 h后，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取10尾斑馬魚置于心跳血流分析系統(tǒng)下錄制斑馬魚血流視頻，分析統(tǒng)計(jì)斑馬魚血流速度，以該指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)橫經(jīng)席樣品改善高血脂血流功效。

2.5 改善血管壁厚度功效評(píng)價(jià)

隨機(jī)選取5 dpf轉(zhuǎn)基因血管綠色熒光斑馬魚于燒杯中，每燒杯30尾。分別水溶給予橫經(jīng)席根莖、橫經(jīng)席枝葉和橫經(jīng)席種子高、中、低三種濃度的樣品溶液，陽性對(duì)照阿托伐他汀鈣11.6 μg·mL-1濃度，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組和模型對(duì)照組，每杯容量為25 mL。除正常對(duì)照組外，其余各實(shí)驗(yàn)組均水溶給予高脂飼料，建立斑馬魚高血脂模型。樣品與高脂飼料共同處理15 h（每天共同處理7.5 h）。28 ℃處理48 h后，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取3尾斑馬魚置于激光共聚焦顯微鏡下拍照，以斑馬魚眼部血管壁厚度定性評(píng)價(jià)橫經(jīng)席樣品改善血管壁厚度功效。

2.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均采用（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，`c±SD）表示，運(yùn)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，＜0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與討論

3.1 MTC

從表1可看出，當(dāng)橫經(jīng)席根莖提取物和橫經(jīng)席枝葉提取物濃度均為250 μg·mL-1時(shí)，斑馬魚的表型較模型對(duì)照組狀態(tài)均開始嚴(yán)重。因此在本實(shí)驗(yàn)條件下，橫經(jīng)席根莖和橫經(jīng)席枝葉降血脂功效的MTC均為125 μg·mL-1，橫經(jīng)席種子降血脂功效的MTC為2000 μg·mL-1。

表1 橫經(jīng)席樣品降血脂功效濃度摸索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n = 30）

3.2 降甘油三酯功效評(píng)價(jià)

斑馬魚的血脂構(gòu)成、脂質(zhì)吸收和代謝與人類高度一致。實(shí)驗(yàn)中采用高脂食物（純蛋黃粉+葡萄糖）喂飼斑馬魚，使斑馬魚血漿中的脂肪含量快速升高[4]。研究表明，碳水化合物、脂質(zhì)、凝血因子等平衡的改變，可造成血管內(nèi)皮損傷、紅細(xì)胞聚集（變形能力受損）及血小板異常粘附，進(jìn)而造成甘油三酯和膽固醇在血管壁沉積、炎癥細(xì)胞滲出和遷移、血流動(dòng)力學(xué)改變等，最終引起組織、器官壞死[5]。油紅O是一種強(qiáng)脂溶劑和染脂劑，可特異性地與甘油三酯等中性脂肪結(jié)合而呈橘紅色，該顯色反應(yīng)常用于甘油三酯染色和定量評(píng)價(jià)[6]。在圖1的分析部位示意圖中，本實(shí)驗(yàn)選取箭頭所指的斑馬魚尾部靜脈作為分析部位。

如表2和圖1所示，在本實(shí)驗(yàn)條件下，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組尾部靜脈甘油三酯染色強(qiáng)度顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.001），表明模型建立成功；與模型對(duì)照組比較，陽性藥阿托伐他汀鈣可顯著降低尾部靜脈甘油三酯染色強(qiáng)度，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.001）；橫經(jīng)席根莖125 μg·mL-1濃度組尾部靜脈甘油三酯染色強(qiáng)度較模型對(duì)照組顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.001）；橫經(jīng)席枝葉31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1和125 μg·mL-1濃度組的尾部靜脈甘油三酯染色強(qiáng)度均較模型對(duì)照組降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.05 &＜0.01 &＜0.01）；橫經(jīng)席種子1000 μg·mL-1和2000 μg·mL-1濃度組尾部靜脈甘油三酯染色強(qiáng)度較模型對(duì)照組降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均＜0.05）。

降甘油三酯功效評(píng)價(jià)中，三個(gè)橫經(jīng)席樣品同濃度比較：（1）在31.2 μg·mL-1條件下，橫經(jīng)席枝葉尾部靜脈甘油三酯染色強(qiáng)度顯著低于橫經(jīng)席根莖（＜0.01）；（2）在62.5 μg·mL-1條件下，橫經(jīng)席枝葉尾部靜脈甘油三酯染色強(qiáng)度顯著低于橫經(jīng)席根莖（＜0.05）；（3）在125 μg·mL-1條件下，甘油三酯染色強(qiáng)度無顯著差異，但橫經(jīng)席根莖尾部靜脈甘油三酯染色強(qiáng)度絕對(duì)值低于橫經(jīng)席枝葉。由于尾部靜脈甘油三酯染色強(qiáng)度越低則降甘油三酯功效越佳，因此，本實(shí)驗(yàn)提示橫經(jīng)席枝葉的降甘油三酯功效最優(yōu)，橫經(jīng)席根莖次之。

表2 橫經(jīng)席樣品降甘油三酯功效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（`c±SD，n = 10）

注：與正常對(duì)照組比較，###＜0.001；與模型對(duì)照組比較，*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001。

圖1 橫經(jīng)席樣品處理后斑馬魚尾部靜脈甘油三酯染色強(qiáng)度典型圖

3.3 降膽固醇功效評(píng)價(jià)

膽固醇熒光探針CholEsteryl BODIPY?542/563 C11專門與膽固醇親和，在細(xì)胞中進(jìn)行運(yùn)輸和代謝，是有效的脂質(zhì)運(yùn)輸示蹤劑，其熒光強(qiáng)弱與血中膽固醇的含量高低成正比關(guān)系[7]。本實(shí)驗(yàn)選取同“3.2”節(jié)所述斑馬魚尾部靜脈作為分析部位。

如表3所示，在本實(shí)驗(yàn)條件下，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組尾部靜脈膽固醇熒光強(qiáng)度顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.001），表明模型建立成功；與模型對(duì)照組比較，陽性藥阿托伐他汀鈣可以顯著降低尾部靜脈膽固醇熒光強(qiáng)度，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.01）；橫經(jīng)席根莖125 μg·mL-1濃度組的尾部靜脈膽固醇熒光強(qiáng)度較模型對(duì)照組顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.001）；橫經(jīng)席枝葉125 μg·mL-1濃度組尾部靜脈膽固醇熒光強(qiáng)度較模型對(duì)照組降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.05）；橫經(jīng)席種子1000 μg·mL-1和2000 μg·mL-1濃度組尾部靜脈膽固醇熒光強(qiáng)度較模型對(duì)照組顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.01 &＜0.001）。

降膽固醇功效評(píng)價(jià)中，三個(gè)橫經(jīng)席樣品同濃度比較：（1）在31.2 μg·mL-1條件下，橫經(jīng)席枝葉尾部的靜脈膽固醇熒光強(qiáng)度顯著低于橫經(jīng)席根莖（＜0.05）；（2）在62.5 μg·mL-1條件下，橫經(jīng)席根莖尾部的靜脈膽固醇熒光強(qiáng)度絕對(duì)值與橫經(jīng)席枝葉相似，無顯著差異；（3）在125 μg·mL-1條件下，膽固醇熒光強(qiáng)度無顯著差異，但橫經(jīng)席根莖尾部靜脈膽固醇熒光強(qiáng)度絕對(duì)值低于橫經(jīng)席枝葉。因?yàn)槲膊快o脈膽固醇熒光強(qiáng)度越低則降膽固醇的功效越佳，故本實(shí)驗(yàn)提示降膽固醇功效橫經(jīng)席根莖最優(yōu)，橫經(jīng)席枝葉次之。

表3 橫經(jīng)席樣品降膽固醇功效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（`c±SD，n = 10）

注：與正常對(duì)照組比較，###＜0.001；與模型對(duì)照組比較，*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001。

3.4 改善高血脂血流功效評(píng)價(jià)

如表4所示，在本實(shí)驗(yàn)條件下，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血流速度顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.001），表明模型建立成功；與模型對(duì)照組比較，陽性藥阿托伐他汀鈣可以顯著增加血流速度，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.01）；橫經(jīng)席根莖62.5 μg·mL-1和125 μg·mL-1濃度組血流速度較模型對(duì)照組顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均＜0.001）；橫經(jīng)席枝葉31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1和125 μg·mL-1濃度組血流速度較模型對(duì)照組增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.05 &＜0.05 &＜0.001）；橫經(jīng)席種子500 μg·mL-1、1000 μg·mL-1和2000 μg·mL-1濃度組血流速度較模型對(duì)照組顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均＜0.001）。

在改善高血脂血流功效中，三個(gè)橫經(jīng)席樣品同濃度比較情況如下：（1）在31.2 μg·mL-1條件下，血流速度無顯著差異，但橫經(jīng)席枝葉血流速度絕對(duì)值高于橫經(jīng)席根莖；（2）在62.5 μg·mL-1條件下，橫經(jīng)席根莖血流速度顯著高于橫經(jīng)席枝葉（＜0.001）；（3）在125 μg·mL-1條件下，血流速度無顯著差異，但橫經(jīng)席根莖血流速度絕對(duì)值高于橫經(jīng)席枝葉。血流速度越高，則改善高血脂血流功效越佳，因而本實(shí)驗(yàn)提示改善高血脂血流功效橫經(jīng)席枝葉最優(yōu)，橫經(jīng)席根莖次之。

表4 橫經(jīng)席樣品改善高血脂血流功效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（`c±SD，n = 10）

注：與正常對(duì)照組比較，###＜0.001；與模型對(duì)照組比較，*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001。

3.5 改善血管壁厚度功效評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)中選取圖2箭頭所指區(qū)域作為橫經(jīng)席樣品處理后斑馬魚眼部血管壁厚度分析部位。如圖3所示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的血管壁厚（即圖中亮區(qū)）明顯增大。與模型對(duì)照組比較，陽性藥阿托伐他汀鈣可以顯著改善血管壁的厚度。觀察圖3結(jié)果可知，經(jīng)橫經(jīng)席樣品處理后的斑馬魚眼部血管內(nèi)的亮區(qū)區(qū)域顯著縮小，因此在本實(shí)驗(yàn)條件下，橫經(jīng)席根莖、橫經(jīng)席枝葉和橫經(jīng)席種子均具有改善血管壁厚度的功效。

圖2 橫經(jīng)席樣品處理后斑馬魚眼部血管壁厚度分析部位示意圖

圖3 橫經(jīng)席樣品處理后斑馬魚眼部血管典型圖

4 結(jié)論

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)條件下，橫經(jīng)席根莖、橫經(jīng)席枝葉和橫經(jīng)席種子均具有降血脂功效，具體表現(xiàn)為降甘油三酯水平、降膽固醇水平、改善高血脂引起的血流速度和血管壁厚度異常。結(jié)合降甘油三酯功效、降膽固醇功效和改善高血脂血流功效評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示橫經(jīng)席枝葉的降血脂功效最優(yōu)，橫經(jīng)席根莖次之。

本文提供了一種橫經(jīng)席提取物的制備方法，并通過建立高血脂斑馬魚模型評(píng)價(jià)了橫經(jīng)席的降血脂功效，為進(jìn)一步開發(fā)和利用橫經(jīng)席中藥材提供了可行途徑。

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Experimental Study on the Evaluation for Hypolipidemic Effect of Calophylli Herba Extracts

Objective: To study and evaluate the hypolipidemic effect of Calophylli herba extracts. Methods: A hyperlipidemic zebrafish model was established and the extracts of the rhizomes, branch, leaves and seeds of Calophylli herba were prepared. The hyperlipidemic zebrafish were treated with high, medium and low concentrations respectively. The effects of the extracts from different parts of the Calophylli herba on the triglyceride, cholesterol, blood flow velocity and vessel wall thickness of the hyperlipidemic zebrafish were observed and compared. Results: The extracts from the rhizomes, branch, leaves and seeds of Calophylli herba can reduce the triglycerides level and cholesterol level of hyperlipidemic zebrafish, and improve the abnormal blood flow velocity and vessel wall thickness caused by hyperlipidemia. Conclusion: The extracts of Calophylli herba have hypolipidemic effect in the experimental animal models.

Calophylli herba extracts; hypolipidemic; effect evaluation

R282

A

1008-1151(2022)12-0119-05

2022-09-21

梧州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022A04021）。

蒙永明（1987－），男，廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司工程師，從事藥用材料研究相關(guān)工作。

鄭志遠(yuǎn)（1967－），男，廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司高級(jí)工程師，從事藥物研究相關(guān)工作。