文 丹，吳 暉，邵 丹，何衛(wèi)東，鄭建新

（福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院，福建福州 350004）

竹葉青蛇是我國常見毒蛇之一，安全有效治療竹葉青蛇傷尤為重要。竹葉青蛇傷患者多出現(xiàn)傷口局部腫脹、疼痛、出血，皮膚散在血水皰及瘀斑，傷肢水腫明顯，發(fā)熱，口干，小便少，大便干硬或便秘等火毒證表現(xiàn)，“火毒損絡”是竹葉青蛇傷的基本病機，竹葉青蛇傷的中醫(yī)治療應立足于瀉火解毒法。前期基礎研究發(fā)現(xiàn)，竹葉青蛇毒導致血管內(nèi)皮細胞炎癥損傷，引起細胞凋亡；而蛇傷膠囊能夠對抗竹葉青蛇毒的損害，具有抑制細胞凋亡的作用，臨床療效顯著［1-6］。細胞色素C（cytochrome c，Cyt-C）從線粒體釋放是細胞凋亡的關鍵步驟，B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族相關凋亡因子是影響細胞線粒體凋亡途徑的重要調控因素，因此本研究從Cyt-C/Bcl-2信號通路研究竹葉青蛇傷絡脈損傷的病理機制，進一步闡明瀉火解毒法治療竹葉青蛇傷絡脈損傷的作用機理。

1 實驗材料

1.1 實驗動物和細胞 5月齡雄性新西蘭大白兔20只，體質量2.5～3.0 kg，由福建中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SYXK（閩）2018-0006。所有兔子實驗前適應性喂養(yǎng)3 d。人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVEC）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 實驗藥物 蛇傷膠囊為福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院院內(nèi)制劑（閩藥制字Z06106044），組成包括：大黃、黃連、山慈菇、土木香、白芷、雄黃、冰片等，藥物規(guī)格：0.37g×50粒/瓶，成人用量5粒/次，每天4次。將蛇傷膠囊用蒸餾水配成69.6 mg/mL濃度的蛇傷膠囊藥液用于灌胃。

1.3 實驗試劑 磷酸酶抑制劑、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司提供，批號：S1873、P0013B、P0010）；HRP標記羊抗小鼠二抗、HRP標記羊抗兔二抗、HRP標記兔抗羊二抗（武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA1051、BA1054、BA1060）；山羊多抗凋亡誘導因子（AIF）、鼠單抗Cyt-C（英國Abcam公司，批號：ab32516、ab13575）；兔多抗GAPDH（杭州賢至生物有限公司，批號：AB-P-R001）；兔多抗VDAC1（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：55259-1-AP）；ECL底物液（北京普利萊基因技術有限公司，批號：P1050）；Trizol（美國Ambion公司，批號：15596-026）；HiScript Reverse Transcriptase（RNase H）、SYBR Green Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號：R101-01/02、Q111-02）；ddH2O（DNase/RNase Free）（genecopoeia公司，批號：C1D230A）；Ribonuclease Inhibitor（TransGen公司，批號：AI101）；Taq Plus DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker（TIANGEN公司，批號：ET105-01、MD114-02）；細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物公司，批號：KGA108）。

1.4 實驗儀器 HI650離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；cytoFLEX流式細胞儀（美國Beckmancoulter公司）；JY300水平電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；DYCZ-電轉儀、DYCZ-24DN垂直電泳槽（北京六一儀器廠）；JY02S紫外分析儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；Quant-Studio 6實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；AJY-0501 Aquapro超級純水儀（艾科浦）。

2 實驗方法

2.1 含藥血清制備 參照文獻［6］制備含藥血清。健康新西蘭大白兔20只，常規(guī)飼養(yǎng)3 d后隨機分成空白組和中藥組，中藥組用蛇傷膠囊藥液灌胃，空白組用生理鹽水灌胃，每日灌胃2次（8時和20時），連續(xù)灌胃5 d。所有兔子末次灌胃后2 h，心臟采血并置離心管中，37℃水浴2 h，2 000 r/min離心10 min分離血清，將血清于56℃滅活30 min。用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌分裝，置-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 竹葉青蛇毒液配制 將竹葉青蛇毒凍干粉用滅菌生理鹽水配成濃度為1 mg/mL的竹葉青蛇毒液，用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌分裝，置4℃冰箱中保存。

2.3 細胞培養(yǎng)與干預 將HUVEC細胞接種于無菌培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2、95%濕度的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1～2 d更換培養(yǎng)液；4～5 d細胞長滿后傳代。傳代后的HUVEC以標準培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)液并隨機分為5組。①正常組：MEM培養(yǎng)液加10%的正常兔血清培養(yǎng)；②模型組：正常組基礎上加5μg/mL竹葉青蛇毒液培養(yǎng)；③低劑量含藥血清組（簡稱低劑量組）：在模型組基礎上培養(yǎng)6 h后加5%含藥兔血清繼續(xù)培養(yǎng)；④中劑量含藥血清組（簡稱中劑量組）：在模型組基礎上培養(yǎng)6 h后加10%含藥兔血清繼續(xù)培養(yǎng)；⑤高劑量含藥血清組（簡稱高劑量組）：在模型組基礎上培養(yǎng)6 h后加15%含藥兔血清繼續(xù)培養(yǎng)。各組分別培養(yǎng)72 h。

2.4 凋亡率檢測 各組分別培養(yǎng)72 h后，磷酸鹽緩沖液漂洗，參照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書，每個樣本加入500μL Binding Buffer，重懸細胞；5μL AnnexinV-FITC混勻后加入5μL PI，混勻；室溫避光反應5～15 min（同時設陰性對照，即正常細胞不加Annexin和PI；陽性對照1，以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對照，只加5μL AnnexinV單標；陽性對照2，以凋亡效果最明顯的溶劑組作為陽性對照，只加5μL PI單標），流式細胞儀上機檢測。

2.5 Western blot法檢測細胞漿及線粒體內(nèi)Cyt-C、AIF蛋白表達 收集各組培養(yǎng)后的HUVEC細胞，使用裂解液、蛋白酶抑制劑制備蛋白樣本，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白樣品濃度，蛋白變性后經(jīng)SDS-PAGE電泳后并轉至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入GAPDH、VDAC1多克隆抗體（1∶1 000）、山羊多抗AIF（1∶10 000）和鼠Cyt-C抗體（1∶5 000），4℃孵育過夜，TBST洗4次，每次5 min，二抗（1∶8 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜，用ECL化學發(fā)光顯色液，顯影讀片，應用Image-J軟件分析條帶的灰度值。胞漿Cyt-C、AIF蛋白相對表達以Cyt-C、AIF蛋白灰度值與GAPDH蛋白內(nèi)參灰度值比值表示，線粒體Cyt-C、AIF蛋白相對表達以Cyt-C、AIF蛋白灰度值VDAC1蛋白內(nèi)參灰度值比值表示，各重復3次取均值。

2.6 qPCR檢測HUVEC細胞凋亡相關因子mRNA表達 收集各組培養(yǎng)后的HUVEC細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA并反轉錄為cDNA，根據(jù)SYBRPremix Ex Taq試劑盒說明書制備qPCR反應體系，反應參數(shù)：95℃15 min，95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s，40個循環(huán)。引物合成由福州韋伯康生物科技有限公司完成。GAPDH上游引物5’-TCAAGAAG GTGGTGAAGCAGG-3’，下游引物5’-TCAAAGGT GGAGGAGTGGGT-3’；Bax上游引物5’-AAGAAG CTGAGCGAGTGTCT-3’，下游引物5’-GTTCTGAT CAGTTCCGGCAC-3’；Bcl-2上游引物5’-GCCTTC TTTGAGTTCGGTGG-3’，下游引物5’-GAAATCAA ACAGAGGCCGCA-3’；Bak上游引物5’-GGGACG ACATCAACCGACG-3’，下游引物5’-CCAGAAGA GCCACCACACG-3’；Bad上游引物5’-AGTCGCCA CAGCTCCTACCCC-3’，下游引物5’-CCTGCCCAA GTTCCGATCCCA-3’；Bid上游引物5’-TTGGGAA GAATAGAGGCAGA-3’，下游引物5’-GACATCAC GGAGCAAGGACG-3’；Bcl-xl上游引物5’-ACAAT GCAGCAGCCGAGAGC-3’，下游引物5’-TCCGAC TGAAGAGTGAGCCC-3’；Bcl-w上游引物5’-CGC CTTGTAGCCTTCTTT-3’，下游引物5’-CTGATGCC CAGTTCCCCT-3’；Caspase-3上游引物5’-ACTGG ACTGTGGCATTGAGA-3’，下游引物5’-GCACAA AGCGACTGGATGAA-3’；Caspase-9上游引物5’-ACATGCTGGCTTCGTTTCTG-3’，下游引物5’-TCT CAAGAGCACCGACATCA-3’，以GAPDH為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt方法計算Bax、Bak、Bad、Bid、Bcl-xl、Bcl-w、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的mRNA表達量。

2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 5組HUVEC細胞凋亡率比較見圖1、表1。

圖1 5組HUVEC細胞流式細胞圖

表1 5組HUVEC細胞凋亡率比較（±s，n＝3）

表1 5組HUVEC細胞凋亡率比較（±s，n＝3）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01；與低劑量組比較，3）P＜0.01；與中劑量組相比，4）P＜0.01。

凋亡率/%8.08±0.06 35.09±1.171）26.46±1.151）2）13.35±0.931）2）3）19.34±0.961）2）4）組別正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組

3.2 5組HUVEC細胞漿及線粒體內(nèi)Cyt-C、AIF蛋白表達比較見圖2、表2。

圖2 5組HUVEC細胞漿及線粒體內(nèi)Cyt-C、AIF蛋白電泳圖

表2 5組HUVEC細胞漿及線粒體內(nèi)Cyt-C、AIF蛋白表達比較（±s）

表2 5組HUVEC細胞漿及線粒體內(nèi)Cyt-C、AIF蛋白表達比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01；與低劑量組比較，3）P＜0.01；與中劑量組比較，4）P＜0.01。

線粒體AIF 0.64±0.11 0.16±0.061）0.29±0.071）2）0.50±0.071）2）3）0.38±0.071）2）4）組別正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組胞漿Cyt-C 0.17±0.08 0.77±0.091）0.62±0.091）2）0.39±0.121）2）3）0.49±0.111）2）4）胞漿AIF 0.16±0.07 0.74±0.121）0.61±0.121）2）0.39±0.081）2）3）0.49±0.101）2）4）線粒體Cyt-C 0.74±0.14 0.19±0.091）0.36±0.021）2）0.57±0.141）2）3）0.46±0.131）2）4）

3.3 5組HUVEC細胞凋亡相關因子的mRNA表達比較見表3。

表3 5組HUVEC細胞凋亡相關因子的mRNA表達（±s，n＝3）

表3 5組HUVEC細胞凋亡相關因子的mRNA表達（±s，n＝3）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01；與低劑量組比較，3）P＜0.01；與中劑量組比較，4）P＜0.01。

組別正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組組別正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組Bax 1.00±0.00 4.13±0.321）3.29±0.31）2）1.79±0.21）2）3）2.39±0.191）2）4）Bcl-w 1.00±0.00 0.31±0.061）0.48±0.061）2）0.84±0.061）2）3）0.63±0.041）2）4）Bak 1.00±0.00 5.01±0.461）1.79±0.21）2）1.90±0.141）2）3）2.92±0.241）2）4）Bcl-2 1.00±0.00 0.31±0.061）0.45±0.081）2）0.83±0.051）2）3）0.62±0.041）2）4）Bad 1.00±0.00 3.17±0.271）2.53±0.261）2）1.43±0.141）2）3）1.81±0.181）2）4）Caspase-3 1.00±0.00 4.02±0.21）3.14±0.291）2）1.71±0.211）2）3）2.43±0.121）2）4）Bid 1.00±0.00 4.28±0.251）3.49±0.171）2）1.88±0.191）2）3）2.65±0.21）2）4）Caspase-9 1.00±0.00 4.11±0.291）3.29±0.31）2）1.77±0.21）2）3）2.44±0.121）2）4）Bcl-xl 1.00±0.00 0.29±0.051）0.44±0.081）2）0.80±0.071）2）3）0.60±0.041）2）4）

4 討論

全世界每年有超過10萬人因毒蛇咬傷中毒死亡，40萬人身體殘疾。毒蛇咬傷尤其對山區(qū)、農(nóng)村和貧困地區(qū)產(chǎn)生了很大影響［7］。據(jù)《柳葉刀》報道，全球約有9 260多萬人生活在易受毒蛇傷害的地區(qū)，并指出抗蛇毒血清的缺乏給臨床治療帶來困難［8-9］。我國南方地區(qū)氣候濕熱，加上環(huán)境和生物保護政策，竹葉青蛇數(shù)量眾多，竹葉青蛇傷發(fā)病率、病死率和傷殘率非常高。竹葉青蛇傷患者以火毒證為主要表現(xiàn)，“火毒損絡”是基本病機，瀉火解毒法是基本治則。具有瀉火解毒功效的蛇傷膠囊是我院院內(nèi)制劑，治療竹葉青蛇傷臨床療效顯著，但瀉火解毒法治療竹葉青蛇傷的機制還不明確，影響了瀉火解毒法在蛇傷治療方面的進一步應用。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，竹葉青蛇傷時炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6等明顯升高，血管內(nèi)皮細胞NF-κB活性增強，ICAM-1、VCAM-1、MCP-1等表達增加，進而再次激活NF-κB，使炎癥因子產(chǎn)生、釋放增多，細胞損傷加重［2-5］。竹葉青蛇傷時存在明顯的血管內(nèi)皮細胞損傷，竹葉青蛇出血毒素可破壞血管內(nèi)皮的結構和功能，導致內(nèi)皮細胞變性，引起細胞凋亡，而瀉火解毒法代表方蛇傷膠囊能夠對抗竹葉青蛇毒的損害，減輕內(nèi)皮細胞損傷，抑制細胞凋亡，其具體作用機制需要進一步研究。線粒體/細胞色素C相關因子在細胞凋亡中具有重要作用。因此，本研究通過細胞實驗，圍繞Cyt-C/Bcl-2介導的細胞凋亡通路，研究蛇傷膠囊干預竹葉青蛇傷血管內(nèi)皮細胞凋亡的作用機制。

線粒體是細胞凋亡調控中心，多數(shù)凋亡刺激因子通過線粒體激活細胞凋亡途徑。細胞凋亡與線粒體的結構與功能有著密切的關系，在炎癥、氧化應激等相關因素刺激下，線粒體通透轉換孔開通，從而降低線粒體膜電位，引起Cyt-C及AIF等凋亡因子釋放到胞漿中，誘導細胞凋亡［10-11］。Caspase是含半胱氨酸的一組天冬氨酸蛋白水解酶，正常的細胞中，Caspase以非活化的酶原形式存在，在各種促凋亡信號刺激下，起始蛋白Caspase-9被激活，繼而激活下游的Caspase-3，啟動級聯(lián)反應，介導細胞凋亡。Cyt-C是一種含血紅素的蛋白，存在于線粒體內(nèi)側外膜上，隨著線粒體通透性增大，Cyt-C被釋放到胞漿中，與凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf-1）及無活性Caspase-9酶原結合形成凋亡小體，凋亡小體促進Caspase-9酶原裂解形成有活性的Caspase-9，進而激活Caspase-3，最終促進細胞凋亡［12-13］。Cyt-C的表達增加、Caspase-9和Caspase-3的活性增加，三者的級聯(lián)反應與細胞過度凋亡與有關，而下調Cyt-C的表達可降低Caspase-9和Caspase-3的活性，減少細胞凋亡［14-15］。Bcl-2蛋白家族是一組含有與Bcl-2同源BH結構域、功能相關的蛋白質，其可通過調節(jié)線粒體外膜的通透性而發(fā)揮調節(jié)細胞凋亡的作用，根據(jù)功能和結構可將其分為兩類，一類為促進凋亡，包括Bax、Bak、Bad、Bid；一類為抗凋亡，包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等。其中Bak和Bax通過寡聚化在線粒體外膜上形成孔道，提高線粒體外膜通透性，促進線粒體釋放Cyt-C進入胞漿，誘導細胞凋亡的發(fā)生，是調節(jié)細胞凋亡進程中發(fā)揮效應作用的蛋白質。Bcl-2、Bcl-xl可以與Bax形成異源二聚體，減少Bax同源二聚體形成，減少線粒體外膜上孔道形成，從而抑制Bax引起的凋亡［16-17］。AIF是一種線粒體黃素蛋白，存在于線粒體膜間隙，能夠誘導細胞凋亡，主要介導非Caspase依賴性的細胞凋亡途徑。在接收到凋亡信號后，AIF從線粒體中釋放到胞漿，并轉位到細胞核內(nèi)，促進DNA大片段斷裂，引起染色體核周邊凝集，最終導致細胞凋亡［18-20］。而減輕線粒體通透性，減少AIF從線粒體釋放到胞漿和阻止其向細胞核內(nèi)轉移能減輕細胞凋亡［21］。下調Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax mRNA表達，上調Bcl-2 mRNA表達可明顯減輕內(nèi)皮細胞核固縮，線粒體腫脹，減輕細胞凋亡［22］。

本研究結果顯示，在竹葉青蛇傷細胞模型中，血管內(nèi)皮細胞線粒體中Cyt-C、AIF明顯降低，胞漿中Cyt-C、AIF明顯升高，具有促凋亡作用的Bax、Bak、Bad、Bid明顯升高，具有抗凋亡作用的Bcl-xl、Bcl-w、Bcl-2明顯降低，Caspase-9、Caspase-3及凋亡率明顯升高，提示經(jīng)線粒體途徑介導的細胞凋亡是竹葉青蛇傷后血管內(nèi)皮細胞損傷的重要機制，其可能通過增加Bax、Bak、Bad、Bid等促凋亡蛋白，抑制Bcl-xl、Bcl-w、Bcl-2等抗凋亡蛋白，提高血管內(nèi)皮細胞線粒體膜通透性，促進線粒體上Cyt-C及AIF釋放進入胞漿，進而通過Cyt-C激活Caspase-9、Caspase-3級聯(lián)反應與AIF介導的非Caspase途徑促進細胞凋亡。低、中、高劑量的蛇傷膠囊均能夠增加抗凋亡蛋白Bcl-xl、Bcl-w、Bcl-2的表達，降低促凋亡蛋白Bax、Bak、Bad、Bid的表達，抑制線粒體中Cyt-C、AIF釋放進入胞漿，下調Caspase-9、Caspase-3的表達，而且以中劑量的蛇傷膠囊最為適宜。

綜上所述，結合前期研究，蛇傷膠囊能夠通過調控線粒體/Cyt-C介導的細胞凋亡信號通路抑制竹葉青蛇傷血管內(nèi)皮細胞凋亡，從而治療竹葉青蛇傷及其引起的血管損傷，一定程度上闡明了瀉火解毒法治療竹葉青蛇傷絡脈損傷的作用機理。