魏麗慧，劉建鑫，黃 彬，方 翌，林久茂*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350122；3.中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350122）

胃癌（gastric cancer，GC）是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年有100多萬(wàn)新病例，是男性第四常見(jiàn)的癌癥，女性第七常見(jiàn)的癌癥［1-3］。盡管在外科手術(shù)和輔助治療方面取得了很大的進(jìn)展，但胃癌的高轉(zhuǎn)移率，五年生存率仍較低［4］。因此，防治腫瘤轉(zhuǎn)移是提高胃癌患者生存率及生活質(zhì)量的重要方式。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的起始因素［5］。通過(guò)EMT過(guò)程，上皮細(xì)胞極性喪失，細(xì)胞間連接中斷，細(xì)胞骨架重組，細(xì)胞形態(tài)由扁平變?yōu)樗笮?，由此侵入血液系統(tǒng)并轉(zhuǎn)移到其他器官［6］。因此尋找逆轉(zhuǎn)EMT的藥物是當(dāng)前亟待解決的重要問(wèn)題。

中醫(yī)注重未病先防、已病防變的治“未病”，符合胃癌當(dāng)前的治療現(xiàn)狀。已有四百多年歷史的傳統(tǒng)中藥復(fù)方八寶丹，由天然牛黃、蛇膽、珍珠、羚羊角、三七、天然麝香等名貴中藥材組成，具有清熱解毒、活血化瘀、去黃止痛之效，臨床上被廣泛用于腫瘤和炎癥的治療［7-10］。前期研究表明，八寶丹具有抑制胃癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制轉(zhuǎn)移的作用［11-13］，但是否具有逆轉(zhuǎn)EMT作用及作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本課題擬在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)構(gòu)建MGC80-3裸鼠皮下移植瘤模型，觀察八寶丹對(duì)胃癌細(xì)胞EMT的影響及調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步豐富八寶丹的抗癌作用及作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞株MGC80-3購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，保存于福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院實(shí)驗(yàn)中心液氮罐中。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c裸鼠，20只，雄性（18～20 g，4周齡，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證：SCXK（滬）2018-0016，在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室溫度濕度恒定，每天光照時(shí)間12 h，正常飲水及飲食。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 八寶丹（廈門(mén)中藥廠，批號(hào)：180101），組方主要包括天然牛黃、蛇膽、珍珠、羚羊角、三七、天然麝香。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）、BCA法蛋白定量分析試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；SDS-PAGE配制凝膠試劑盒、NC膜（德國(guó)Merck Millipore公司）；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（蘇州宇恒生物科技有限公司）；一抗、二抗稀釋液（武漢博士德生物工程有限公司）；E-cadherin、Vimentin、Smad2/3及p-Smad2/3（美國(guó)CST公司）；MMP2、MMP9、TGF-β1、β-actin、兔二抗及鼠二抗（美國(guó)Proteintech Group公司）。

1.5 實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Countes?全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Life公司）；干式恒溫金屬?。ㄉ虾Ｅ嗲蹇萍加邢薰荆?；小型垂直電泳槽、Trans-Blot小型轉(zhuǎn)印槽轉(zhuǎn)膜儀、超高靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 八寶丹藥液配制 用生理鹽水將八寶丹配成濃度為25 mg/mL的八寶丹母液，存于4℃冰箱備用。

2.2 細(xì)胞完全培養(yǎng)基配制 在RPMI-1640空白培養(yǎng)基中加入10%體積的胎牛血清和1%體積的青霉素-鏈霉素，存于4℃冰箱備用。

2.3 裸鼠皮下移植瘤模型構(gòu)建 MGC80-3細(xì)胞以1.5×105個(gè)/mL的密度接種于75 cm2的大培養(yǎng)瓶中，每瓶15 mL，觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞的匯合度長(zhǎng)到90%～100%時(shí)，用0.25%EDTA胰蛋白酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底部脫落后加入5 mL的完全培養(yǎng)基終止消化。離心，細(xì)胞沉淀用空白R(shí)PMI-1640培養(yǎng)基清洗3次后重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為3×106個(gè)/mL，與基質(zhì)膠1∶1充分混勻（冰上進(jìn)行）。于每只裸鼠右前肢腋窩處注射200μL的細(xì)胞懸液，共計(jì)20只。接種后每日觀察裸鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)和移植瘤的生長(zhǎng)情況。

2.4 動(dòng)物分組與給藥 瘤體長(zhǎng)約至80～100 mm3時(shí)，按瘤體體積隨機(jī)分為對(duì)照組和八寶丹組各10只。八寶丹組按0.25 mg/kg予八寶丹藥液灌胃，對(duì)照組予等容積的生理鹽水灌胃，每周給藥6 d。隔日對(duì)裸鼠進(jìn)行稱(chēng)重、測(cè)量瘤體最長(zhǎng)徑L和最短徑W，計(jì)算移植瘤體積，繪制移植瘤的生長(zhǎng)曲線圖。

2.5 動(dòng)物取材和標(biāo)本采集 注射2%的戊巴比妥鈉麻醉后用頸椎脫臼法將裸鼠處死，將瘤體組織剝離取出，先保存于液氮中。

2.6 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 瘤體放置2 mL的離心管中，加入研磨鋼珠進(jìn)行研磨，分別加入300～500μL的RIPA裂解液，提取總蛋白。然后用BCA定量試劑盒進(jìn)行定量。每組樣本取50μg的蛋白上樣，進(jìn)行電泳，結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，加入相應(yīng)的一抗4℃孵育過(guò)夜，用TBST清洗3次后，孵育二抗，2 h后用TBST清洗3次，最后于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影、拍照。

2.7 HE染色法觀察肝、腎組織形態(tài) 肝、腎組織于多聚甲醛溶液中固定48 h后，再轉(zhuǎn)移至70%無(wú)水乙醇脫水12 h。將肝、腎組織取出，修剪成合適大?。?.5 cm×0.5 cm×0.5 cm）的組織塊，接著進(jìn)行脫水，石蠟包埋，切片，烤片，脫蠟，蘇木素染色，伊紅染色，吹干，封片。在Leica顯微鏡下隨機(jī)選取六個(gè)視野進(jìn)行拍照。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，方差齊者采用單因素方差分析；方差不齊者采用秩和檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布者采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 八寶丹抑制移植瘤的生長(zhǎng) 如圖1所示，給藥第7天開(kāi)始，八寶丹組裸鼠移植瘤的體積明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。如圖2所示，2組裸鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，八寶丹具有抑制MGC80-3細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的作用，對(duì)裸鼠的體質(zhì)量無(wú)影響。

圖1 2組裸鼠瘤體體積比較

圖2 2組裸鼠體質(zhì)量比較

3.2 2組裸鼠瘤體中E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)比較 如圖3所示，與對(duì)照組比較，八寶丹組中E-cadherin的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），Vimentin的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），提示八寶丹具有逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞EMT的作用。

圖3 2組裸鼠瘤體中E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)比較

3.3 2組裸鼠瘤體中MMP2、MMP9蛋白表達(dá)比較如圖4所示，與對(duì)照組比較，八寶丹組中MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），提示八寶丹可能通過(guò)抑制MMP2和MMP9的表達(dá)，從而抑制胃癌移植瘤生長(zhǎng)及EMT。

圖4 2組裸鼠瘤體中MMP2、MMP9蛋白表達(dá)比較

3.4 八寶丹抑制移植瘤細(xì)胞TGF-β/Smad信號(hào)通路的活化 如圖5所示，與對(duì)照組比較，八寶丹組中TGF-β1、p-Smad2/3的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），而總蛋白Smad2/3沒(méi)有改變（P＞0.05），提示八寶丹具有抑制裸鼠皮下移植瘤細(xì)胞TGF-β/Smad信號(hào)通路活化的作用。

圖5 2組裸鼠瘤體TGF-β、p-Smad2/3、Smad2/3蛋白表達(dá)比較

3.5 2組裸鼠肝、腎組織病理形態(tài)觀察 如圖6所示，2組肝細(xì)胞無(wú)水腫及壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)正常、分界明顯，肝細(xì)胞索排列整齊，肝細(xì)胞索間可見(jiàn)不規(guī)則的肝血竇，竇腔內(nèi)可見(jiàn)枯否氏細(xì)胞。2組腎小球結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)增生及固縮，腎小囊無(wú)膨大，毛細(xì)血管叢基底膜無(wú)增厚表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示八寶丹對(duì)裸鼠無(wú)肝、腎毒性。

圖6 2組裸鼠肝、腎組織HE染色圖（×400）

4 討論

由于缺乏有效的腫瘤轉(zhuǎn)移治療方法，近十年來(lái)胃癌的病死率并沒(méi)有明顯下降。并且臨床上許多胃癌患者被診斷時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，迫切需要尋找有效的防治胃癌轉(zhuǎn)移的藥物。與現(xiàn)代化療藥物相比，中醫(yī)注重未病先防、已病防變治“未病”，并且副作用少，越來(lái)越受到患者和臨床醫(yī)生的青睞。具有400多年歷史的中藥復(fù)方八寶丹，在包括腫瘤等多種疾病中發(fā)揮很好的治療作用，可以消除腫塊、去除炎癥、減輕疼痛，并且輔助化療可以提高臨床療效，改善患者的不良反應(yīng)［7-13］。因此，本課題在此研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察及闡明八寶丹防治胃癌轉(zhuǎn)移及其作用機(jī)制。首先構(gòu)建了胃癌細(xì)胞皮下裸鼠移植瘤模型，證實(shí)八寶丹具有抑制瘤體生長(zhǎng)的作用，并對(duì)裸鼠體質(zhì)量沒(méi)有明顯的影響。這與課題組前期報(bào)道的結(jié)果一致。另外，大量的證據(jù)表明，上皮性癌細(xì)胞在早期入侵血液或轉(zhuǎn)移到其他組織是由EMT驅(qū)動(dòng)的［5］。細(xì)胞在發(fā)生EMT時(shí)，失去了細(xì)胞極性，與周?chē)突|(zhì)細(xì)胞接觸減少，細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)能力增加；同時(shí)細(xì)胞表型發(fā)生了改變，細(xì)胞喪失上皮表型，如E-鈣黏素（E-cadherin）減少，獲得間充質(zhì)表型，如Vimentin、纖連蛋白、N-鈣黏素等增加［6］。因此，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了移植瘤瘤體中EMT相關(guān)的蛋白表達(dá)，結(jié)果表明八寶丹顯著提高E-cadherin表達(dá)，降低Vimentin表達(dá)。研究提示，八寶丹具有逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞EMT的作用。

研究報(bào)道，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）屬于鋅依賴(lài)性?xún)?nèi)肽酶家族，其功能主要是降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），維持細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡。其中，MMP2和MMP9是其重要的成員，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控的作用，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤血管形成［14］。因此在本實(shí)驗(yàn)中，也觀察了八寶丹對(duì)MMP2和MMP9蛋白的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)八寶丹顯著的抑制MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)。

EMT受多條信號(hào)通路調(diào)控，其中TGF-β/Smad通路是其經(jīng)典調(diào)控通路之一［6］。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β與細(xì)胞表面受體結(jié)合后，形成異源三聚體，異源三聚體通過(guò)磷酸化激活受體調(diào)節(jié)型Smad（R-smad）蛋白，磷酸化的R-smad蛋白在胞漿中累積，與共同調(diào)節(jié)型（Co-smad）smad蛋白結(jié)合后，在Co-smad蛋白的幫助下，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與靶基因結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。其中Rsmad包括smad2、smad3；Co-smad包括smad4［15］。另外，TGF-β還可誘導(dǎo)MMP-2、MMP9的表達(dá)，促進(jìn)基底膜降解，為腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)、侵襲提供良好的環(huán)境，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生與發(fā)展［16］。本研究結(jié)果顯示，八寶丹可以下調(diào)TGF-β1和p-Smad2/3的表達(dá)，證實(shí)八寶丹可以阻斷TGF-β/Smad信號(hào)通路的活化。但是，對(duì)于八寶丹是否通過(guò)抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路的活化發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞增殖及逆轉(zhuǎn)EMT進(jìn)程還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

另外，藥物的安全性問(wèn)題一直以來(lái)是中藥臨床應(yīng)用關(guān)注的熱點(diǎn)。為了評(píng)價(jià)八寶丹的藥物安全性和探究是否對(duì)裸鼠具有肝、腎的毒理作用。在本課題研究中，首先觀察實(shí)驗(yàn)過(guò)程中裸鼠的生長(zhǎng)狀況，確認(rèn)了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)裸鼠死亡，且活動(dòng)度可、狀態(tài)良好。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)裸鼠體質(zhì)量進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)八寶丹對(duì)裸鼠體質(zhì)量沒(méi)有影響。并運(yùn)用HE染色觀察裸鼠的肝、腎的細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果表明八寶丹沒(méi)有改變裸鼠肝、腎的細(xì)胞形態(tài)。

綜上所述，八寶丹具有抑制胃癌生長(zhǎng)及逆轉(zhuǎn)細(xì)胞EMT的作用，下調(diào)MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)及抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路的活化可能是其重要的調(diào)控機(jī)制之一。