衡先培，王志塔，李 亮，黃蘇萍，楊柳清

（1.福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004；2.福建中醫(yī)藥大學，福建 福州 350122）

糖尿病不僅是糖脂代謝病，也是氨基酸代謝病，無論糖尿病的發(fā)病、進展及預(yù)后，都與氨基酸代謝密切相關(guān)［1-2］。氨基酸代謝不但與糖脂代謝密切相關(guān)，也與基因和蛋白質(zhì)代謝密不可分。由于氨基酸是蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)是構(gòu)建人體組織器官、維護器官功能的基本要素，對人體生理、病理具有關(guān)鍵的影響，氨基酸代謝異常可導(dǎo)致患者生活質(zhì)量與健康顯著下降?；瘜W藥物強化治療雖能有效改善血糖、血脂、血壓等客觀指標，但不能改善氨基酸代謝，甚至存在惡化氨基酸代謝的風險［3］。臨床研究表明，痰瘀同治丹瓜方可改善糖尿病患者的糖脂代謝，降低高危糖尿病患者冠心病發(fā)病和全因不良風險，同時也提高患者生活質(zhì)量［4］。由于氨基酸代謝與蛋白質(zhì)代謝之間存在著密切關(guān)系，提示痰瘀同治法的療效可能與改善氨基酸代謝有關(guān)。因此，本研究基于蛋白質(zhì)及磷酸化代謝組學，探討丹瓜方對氨基酸代謝的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 7周齡SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（311±11）g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證編號：SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（22±1）℃，濕度（50±5）%，自由攝食。動物實驗遵守倫理原則，符合國家及相關(guān)部門有關(guān)實驗動物保護與使用準則，善待動物。

1.2 實驗藥物 丹瓜方（國家發(fā)明專利號：2014 10599300.6）由丹參、栝蔞、赤芍、法半夏、僵蠶、薤白組成。

1.3 實驗試劑 鏈脲佐菌素（STZ）、碘代乙酰胺、二硫蘇糖醇、尿素、三乙基碳酸氫銨（美國Sigma公司）；蛋白酶抑制劑（Calbiochem公司）；胰酶（Promega公司）；乙腈（Fisher Chemical公司）；超純水、三氟乙酸（Sigma-Aldrich公司）；甲酸（Fluka公司）；EDTA、Ethidium Bromide、MOPS（華 美 生 物 工 程公司）。

1.4 實驗儀器 小型垂直電泳槽、電泳儀、IMARK酶標儀（美國Bio-Rad公司）；300 Extend C18色譜柱（美國Agilent公司）；分析柱和Acclaim?PepMap?100 C18液相色譜柱（164568）、SpeedVac濃縮器、Heraeus Multifuge X1R臺式高速冷凍離心機（美國ThermoFisher Scientific公司）；JY92-ⅡN高強度超聲波處理器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；High pH reverse-phase HPLC（L3000）（中國RIGOL Technologies）；TS-200脫色搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；DK-8D型電熱恒溫水槽（上海森信實驗儀器有限公司）；Velocity 18R臺式冷凍離心機（英國Dynamica公司）；timsTOF Pro質(zhì)譜儀（德國Bruker公司）；CR2032微量血糖測試儀（德國BAYER公司）；光學顯微鏡（德國Leica公司）。

2 實驗方法

2.1 造模與分組 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行口服葡萄糖耐量試驗（OGTT），選取空腹血糖（FBG）＜6.1 mmol/L、2小時血糖（2 h PBG）＜7.8 mmol/L的大鼠。以空腹體質(zhì)量分層，按PBG由高到低，以1∶2隨機分為對照組和造模組。對照組飼以普通飼料，造模組飼以高脂高糖飼料（配方：精煉豬油10%，膽固醇2%，豬膽鹽0.3%，蔗糖20%，常規(guī)飼料67.7%）。4周后，造模組再做OGTT，以空腹體質(zhì)量分層，按PBG由高到低，以1∶1隨機分為模型組和丹瓜方組。丹瓜方組按20.5 g/（kg·d）以丹瓜方灌胃液灌胃，模型組用清潔自來水灌胃，每日1次。3組均繼續(xù)喂食各自原有飼料。根據(jù)既往實驗，用藥物干預(yù)10周后，禁食但不禁水12 h取標本。根據(jù)體質(zhì)量與血糖，每組隨機取6只大鼠采血和取肝組織，用于本研究的指標測定。

2.2 口服葡萄糖負荷試驗 大鼠禁食不禁水8～10 h后，鼠尾尖取血，用微量血糖儀測FBG后，按葡萄糖2 g/kg以50%的葡萄糖注射液灌胃并記錄灌胃時間，2 h后再次測2 h PBG。

2.3 生化檢測 采用常規(guī)生化法檢測血漿膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）。

2.4 肝組織染色 分別采用HE染色、油紅O脂肪染色和Masson染色觀察各組大鼠肝組織。HE染色：組織洗滌，石蠟包埋，切片，脫蠟，蘇木素浸染，1%鹽酸酒精分藍，自來水浸泡返藍，伊紅浸染，浸洗，樹脂封片。Masson染色：石蠟切片，脫蠟，切片鉻化處理，自來水浸洗至黃色消失后，再用蒸餾水滴注洗滌，加入Regaud蘇木精染液，充分水洗，加入Masson麗春紅酸性復(fù)紅液，洗滌，1%磷鉬酸水溶液分化，苯胺藍染色，0.2%冰醋酸水溶液浸洗，脫水透明，中性樹膠封片。油紅O染色：冰凍切片，厚度10μm，70%乙醇固定，蒸餾水洗滌，油紅稀釋液染，避光，密封，加入60%乙醇，蒸餾水洗滌，蘇木素復(fù)染，蒸餾水洗滌，甘油明膠封片。

2.5 LC-MS/MS分析 取每只大鼠的肝標本50 mg，將同一組的2個標本放入研磨器中用液氮研磨。每組的3個樣品含有6個大鼠的肝組織樣本，用于蛋白質(zhì)提取和磷酸化修飾的非標記定量組學分析。胰蛋白酶消化后，根據(jù)商家提供的說明書進行機上檢測。技術(shù)路線：蛋白質(zhì)提取→胰蛋白酶消化→親和富集→LC-MS/MS分析→數(shù)據(jù)庫搜索→生物信息學分析。亞細胞定位用Wolfpsort庫（v.0.2，http：//www.genscript.com/psort/wolf_psort.html），富集分析用Perl module庫（v.1.31，https：//metacpan.org/pod/Text：：NSP：：Measures：：2D：：Fisher），GO注釋用InterProScan庫（v.5.14-53.0，http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）。

2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料屬正態(tài)分布者用（±s）表示，多樣本兩兩比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 3組大鼠血糖、血脂指標比較 模型組2 h PBG、TG和TC均明顯高于對照組（P＜0.01）；丹瓜方組2 h PBG、TG、TC均明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），見表1。

表1 3組大鼠血糖、血脂指標比較（±s） mmol/L

表1 3組大鼠血糖、血脂指標比較（±s） mmol/L

注：與對照組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

TC 2.35±0.32 5.99±0.681）5.06±0.413）組別對照組模型組丹瓜方組n6 6 6 FBG 6.05±0.30 6.26±0.43 6.06±0.56 2 h PBG 6.58±0.43 8.00±0.801）7.38±0.192）TG 1.07±0.22 1.80±0.201）1.49±0.192）

3.2 3組大鼠肝組織病理形態(tài) 正常組肝臟呈暗褐色，肝細胞結(jié)構(gòu)正常，胞核分布均勻，僅在匯管區(qū)有少量藍色纖維組織染色和細粒狀脂肪染色。模型組肝臟呈嫩白色，肝細胞空泡狀且分布不均，胞核邊移，藍色纖維組織呈網(wǎng)狀，紅色大脂滴滿布。丹瓜方組肝臟呈褐紅色，肝細胞結(jié)構(gòu)清楚，胞核分布均勻，匯管區(qū)呈蟹足樣纖維染色，中小脂滴較多。見圖1。

圖1 3組大鼠肝組織病理形態(tài)圖

3.3 丹瓜方對差異表達蛋白亞細胞結(jié)構(gòu)定位的影響 如圖2A所示，模型組與對照組的差異表達顯著性蛋白涉及細胞質(zhì)、線粒體、細胞核、質(zhì)膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。如圖2B所示，丹瓜方組與模型組的差異表達蛋白出現(xiàn)在細胞核、細胞質(zhì)，尤其是線粒體和質(zhì)膜。這些膜結(jié)構(gòu)及其功能，都與氨基酸與蛋白質(zhì)代謝密切相關(guān)。此外，丹瓜方組還能影響細胞骨架蛋白（cytoskeleton）的表達。由于蛋白質(zhì)由氨基酸構(gòu)成，表明丹瓜方可能影響糖脂代謝異常大鼠的氨基酸代謝，并可能由此改善蛋白質(zhì)代謝。

圖2 LC-MS/MS分析亞細胞定位餅圖

3.4 丹瓜方對生物學進程的影響 如圖3A所示，丹瓜方不但可顯著影響肝組織甘油脂生物合成過程（glycerolipid biosynthetic process）、磷脂生物合成過程（phospholipid biosynthetic process）、甘油磷脂代謝過程（glycerophospholipid metabolic process）、磷脂代謝過程（phospholipid metabolic process）、甘油脂代謝過程（glycerolipid metabolic process）等糖脂的代謝進程，而且也能調(diào)節(jié)包括細胞生長（regulation of cell growth）、細胞形態(tài)發(fā)生（regulation of cell morphogenesis）、心臟發(fā)育（heart development）、超分子纖維組織（regulation of supramolecular fiber organization）、骨骼發(fā)育（bone development）等。尤其是正調(diào)控細胞發(fā)育（positive regulation of cell development）、促進蛋白質(zhì)寡聚化（protein oligomerization）和正調(diào)控轉(zhuǎn)移酶活性（positive regulation of transferase activity），都表明丹瓜方能加強蛋白質(zhì)的功能，促進細胞發(fā)展，這些都離不開充分合理的氨基酸代謝，進一步提示丹瓜方可能通過改善氨基酸代謝，以改善蛋白質(zhì)代謝及細胞功能。在圖3B的磷酸化組學中，丹瓜方顯著調(diào)控組織再生（tissue regeneration）、肽轉(zhuǎn)運（peptide transport）、酰胺轉(zhuǎn)運（amide transport），都與氨基酸代謝密切關(guān)聯(lián)，表明此觀點與事實相符。

圖3 生物學進程功能富集圖

3.5 丹瓜方對氨基酸代謝調(diào)控分析 從表2的COG功能條目中可以看出，涉及能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化、碳水化合物的運輸與代謝、核苷酸轉(zhuǎn)運與代謝、酶轉(zhuǎn)運與代謝、脂肪轉(zhuǎn)運與代謝、無機離子轉(zhuǎn)運與代謝、次生代謝物的生物合成、轉(zhuǎn)運和分解代謝以及氨基酸的轉(zhuǎn)運與代謝，模型組都有多個功能蛋白發(fā)生顯著性差異表達和差異磷酸化。經(jīng)過丹瓜方干預(yù)后，其中大部分條目都有不同數(shù)量功能蛋白對模型組發(fā)生差異化表達。其中涉及氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝的差異表達蛋白有4個（D3ZPY2、Q68FT5、P10860、D4A904），差異磷酸化蛋白有2個（P10860、D4A904），見表3。

表2 COG分類功能條目在丹瓜方干預(yù)后的差異表達蛋白個數(shù)

表3 氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝差顯調(diào)節(jié)蛋白

4 討論

氨基酸是蛋白質(zhì)的基本構(gòu)成單位，蛋白質(zhì)是生命活動的基本要素。人體組織器官的基本構(gòu)架都以蛋白質(zhì)為主體，人體的功能活動本質(zhì)上是蛋白質(zhì)功能的宏觀體現(xiàn)。糖尿病患者氨基酸代謝異常，必然伴隨著不同程度的組織蛋白質(zhì)合成障礙，同時也導(dǎo)致功能蛋白質(zhì)的異常。這些功能蛋白質(zhì)包括各種酶、激素、抗體與受體、神經(jīng)遞質(zhì)等，調(diào)控人體的各種功能及代謝，是影響患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵因素。

大量研究表明，糖尿病伴隨氨基酸代謝異常，并且是影響糖尿病心血管事件及全因終點的獨立危險因素［2］。研究表明，2型糖尿病患者尿氨基酸排泄水平顯著升高，其中尿苯丙氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的排泄顯著高于健康對照［5］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者循環(huán)血液中的γ-氨基丁酸（GABA）（可由谷氨酸轉(zhuǎn)化而來）、精氨酸、谷氨酰胺和磷酸乙醇胺濃度顯著降低，而纈氨酸水平高于對照組。IGT組GABA水平降低，酪氨酸濃度升高。血漿必需氨基酸水平與空腹及激發(fā)后血糖、空腹C肽、HOMA胰島素抵抗、空腹胰高血糖素水平呈正相關(guān)［6］。2型糖尿病患者標準餐后150 min外周血中絲氨酸、鳥氨酸水平顯著低于健康對照組，而苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸水平高于正常對照組［7］。

在2019年，有研究者對475例2型糖尿病患者進行了為期6年的隊列研究，發(fā)現(xiàn)甘氨酸水平位于最高分位的人群，5年新發(fā)為糖尿病的風險比最低分位的人群降低了76%。支鏈氨基酸、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸）水平較高的研究對象5年新發(fā)糖尿病的風險明顯較高，而甘氨酸水平較高的研究對象5年新發(fā)糖尿病的風險明顯較低［1］。另一項臨床研究結(jié)果也顯示，血漿多種氨基酸水平的變化與糖尿病發(fā)病風險相關(guān)［8］。因此，調(diào)節(jié)氨基酸代謝，對于防治糖尿病及提高糖尿病的治療效果，是關(guān)鍵的一環(huán)。

本研究從系統(tǒng)生物學角度，利用組學技術(shù)研究了中藥復(fù)方制劑丹瓜方對糖脂代謝紊亂模型氨基酸代謝的影響?；诒?分析可以看出，D3ZPY2蛋白的基因是Hsd3b7，主要涉及代謝途徑包括膽汁酸和膽鹽的合成與代謝，在肝臟生物化學與生物物理兩大屏障方面與氨基酸代謝密切相關(guān)，同時還與氨基酸交換和相關(guān)酶活性有關(guān)［9］。國外在肥胖兒童中發(fā)現(xiàn)參與脂質(zhì)與氨基酸代謝的基因CES1、NPRR3和BHMT2發(fā)生顯著性差異表達［10］。Q68FT5蛋白的基因是Bhmt2，即甜菜堿-高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶，主要影響含硫氨酸（包括結(jié)構(gòu)氨基酸蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸和非結(jié)構(gòu)氨基酸高半胱氨酸），促進這些氨基酸的合成或轉(zhuǎn)化［11］。D4A904蛋白的基因是Nags，催化谷氨酸與乙酰輔酶A進行乙?；磻?yīng)生成N-乙酰谷氨酸的酶。N-乙酰谷氨酸（N-acetyl glutamic acid，NAG）是精氨酸內(nèi)源合成途徑的第一個合成酶，即氨基甲酰磷酸合成酶I（carbamyl phosphate synthase I，CPSI）的變構(gòu)激活劑［1］，還可催化氨甲酰磷酸合成酶以調(diào)節(jié)氨基酸代謝的最后環(huán)節(jié)，即尿素循環(huán)。

P10860蛋白的基因是Glud1或GDH1，即谷氨酸脫氫酶1，是一種線粒體酶，催化氨還原性固定到α-酮戊二酸上，形成谷氨酸（α-酮戊二酸＋NH3＋NADH+＋H+→谷氨酸＋NAD+）。此外，GDH1還調(diào)節(jié)纈氨酸、氨基丁酸、亮氨酸代謝。在慢性疲勞綜合征中，發(fā)現(xiàn)谷氨酸/谷氨酰胺、支鏈氨基酸和一些必需氨基酸都顯著下調(diào)［12］。表2示，丹瓜方不但顯著恢復(fù)性上調(diào)GDH1的表達，還顯著上調(diào)其磷酸化水平，上調(diào)其功能，可以促進更多的糖脂代謝中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為谷氨酸。在組學數(shù)據(jù)中還發(fā)現(xiàn)，與谷氨酸代謝或轉(zhuǎn)化相關(guān)的多種酶蛋白都有上調(diào)，包括谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基（glutamatecysteine ligase catalytic subunit）、蛋白質(zhì)谷氨酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶（protein-glutamate O-methyltransferase）、谷氨酸-半胱氨酸調(diào)節(jié)亞基（glutamate-cysteine regulatory subunit）、線粒體谷氨酸載體1樣蛋白（A0A0G2K5L2）、富含谷氨酸的WD重復(fù)序列蛋白1（基因為Grwd1）、D-谷氨酸環(huán)化酶（D-glutamate cyclase）、谷氨酸受體2（glutamate receptor 2）、葉酰聚谷氨酸合酶（folylpolyglutamate synthase）；谷氨酸代謝磷酸化上調(diào)蛋白包括谷氨酸-半胱氨酸調(diào)節(jié)亞基（glutamate-cysteine regulatory subunit）、精氨酸-谷氨酸富集蛋白（arginine and glutamate-rich protein 1）。這表明，丹瓜方可顯著上調(diào)谷氨酸的代謝。由于谷氨酸是各種氨基酸代謝或轉(zhuǎn)化的樞紐和中間環(huán)節(jié)，通過谷氨酸代謝的上調(diào)，進而可影響其他多種氨基酸的代謝。

研究結(jié)果顯示，丹瓜方干預(yù)糖脂代謝異常，可直接調(diào)節(jié)蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、精氨酸、N-乙酰谷氨酸、氨甲酰磷酸、谷氨酸的合成，尤其是通過多途徑上調(diào)谷氨酸的合成，并通過調(diào)節(jié)膽汁酸代謝和尿素循環(huán)，最終影響各種氨基酸的代謝，其機制與調(diào)節(jié)D3ZPY2、Q68FT5、P10860、D4A904蛋白表達及P10860、D4A904蛋白的磷酸化有關(guān)。綜上，痰瘀同治丹瓜方顯著改善糖脂代謝紊亂模型的氨基酸代謝，這一作用有助于理解丹瓜方顯著改善糖尿病患者生活質(zhì)量和預(yù)后的機制。