李沖,楊悅,騫宇，趙欣*

1(重慶第二師范學(xué)院重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶，400067)2(重慶第二師范學(xué)院重慶市功能性食品工程技術(shù) 研究中心，重慶，400067)3(重慶第二師范學(xué)院功能性食品研發(fā)重慶市工程實驗室，重慶，400067) 4(重慶第二師范學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，重慶，400067)

氧化損傷是機體在生長過程中限制其正常生長的一個主要因素，機體損傷是指通過不同的機制引起細(xì)胞炎性因子的增加，氧化水平越高其機體損傷程度越重[1]。反映機體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的標(biāo)志物有谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和一氧化氮(nitric oxide，NO)，GSH-Px作為機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，可以起到保護細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[2-3]。細(xì)胞因子IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-β和IFN-γ在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而機體及其器官損傷以慢性低級別炎癥為特征，因此可以通過測量炎癥水平來評價白茶多酚對D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠腎損傷的改善作用。

D-半乳糖是目前用來建立亞急性衰老模型的工具藥，并被廣泛地應(yīng)用于藥物抗衰老的研究之中[4]。它能夠在機體內(nèi)參與葡萄糖代謝，但是如果攝入過量或在體內(nèi)積聚過多會導(dǎo)致葡萄糖代謝紊亂從而引起血糖水平升高、加重機體的氧化損傷程度和通過分泌IL-6、TNF-α、IFN-γ等炎癥細(xì)胞因子引起炎癥[5-6]。D-半乳糖也可直接引起腎臟組織復(fù)制性衰老，如腎臟結(jié)構(gòu)被破壞，壞死細(xì)胞增多，炎性細(xì)胞浸潤，進而可導(dǎo)致腎功能減退[7]。D-半乳糖可在半乳糖氧化酶的作用下，轉(zhuǎn)化為過氧化氫和醛糖，從而產(chǎn)生大量的超氧陰離子自由基，導(dǎo)致機體內(nèi)的生物大分子氧化損傷，損害機體健康[8-9]。

白茶原產(chǎn)于福建福鼎地區(qū)，屬微發(fā)酵茶，是中國茶農(nóng)創(chuàng)制的傳統(tǒng)名茶，中國六大茶類之一。茶多酚是其中的一種活性成分，具有高效的抗氧化、抗炎、抗腫瘤、防止動脈粥樣硬化和老年癡呆、降低血脂血糖體重等作用[10]。茶多酚是茶葉中一類多羥基類化合物，由30多種含酚基的物質(zhì)組成，其中兒茶素含量最高[11]。研究表明茶多酚是一種強抗氧化劑，可有效地改善D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠腎損傷的程度。

因此，本研究考察了白茶多酚的作用機制，并以D-半乳糖作為誘導(dǎo)劑，建立小鼠腎損傷模型，考察不同濃度白茶多酚對小鼠腎損傷模型的改善作用，同時對其中的活性成分進行了測定并作分析，為白茶多酚改善小鼠腎損傷導(dǎo)致的相關(guān)疾病提供一定的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雄性小鼠(24±5) g，重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，本研究經(jīng)重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心倫理委員會批準(zhǔn)實施(20200625B)。

白茶(規(guī)格：100 g)，福鼎仙居林生態(tài)茶業(yè)有限公司。

D-半乳糖，上海國藥化學(xué)試劑有限公司；DPPH，東京化成工業(yè)株式會社；MDA、CAT、GSH-px、NO、T-AOC試劑盒，南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素(IL-6、IL-10)、干擾素(TNF-α、IFN-β、IFN-γ)，北京誠林生物科技有限公司；FL-3大孔樹脂，天津歐瑞生物科技有限公司；ABTS、無水乙醇、PBS(0.01 mol/L)、七水合硫酸亞鐵、二甲苯、甲醛、二甲基亞砜、過硫酸鉀，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BioMate 3S UV-Visible光度計、UltiMate3000 HPLC、QuantStudioTM6 Flex聚合酶式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；EYELA N-1001S旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會社；KQ-250ES超聲波清洗器，昆山市超聲儀器；Centrifuge 5418R冷凍離心機，德國Eppendorf公司；ELx808酶標(biāo)儀，美國Bio-TeK公司；FLUOstar OPTIMA熒光酶標(biāo)儀，德國BMG公司；BY-R16離心機，北京白洋醫(yī)用離心機有限責(zé)任公司；SCSJ-Ⅱ-40L純水機，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；水浴鍋，無錫瑪瑞特科技有限公司；WK-10B粉碎機，青州市邁德森制藥機械廠；XY-GZL烘箱，上海昕儀儀器儀表有限公司；SHB-ⅢS型臺式循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；PR224ZHE分析天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 白茶提取物的制備

提取方法采用乙醇水浴浸提：將白茶樣品烘干，粉碎、研磨后過篩(100目)，然后用萬分之一天平精密稱取一定量白茶粉末于燒杯中，加入20倍體積的80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，60 ℃水浴2.5 h，重復(fù)3次，抽濾，收集液體備用，并使其過FL-3大孔樹脂(80%乙醇洗脫至無色)。將過樹脂后的液體通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(60 ℃)除去水分和乙醇(蒸至燒杯無液體流動為止)，于60 ℃恒溫干燥48 h。將烘干樣品取出，研磨、稱重后封存于干凈的EP管中，放置于4 ℃環(huán)境中，備用[12]。

1.3.2 體外抗氧化實驗

1.3.2.1 DPPH自由基清除實驗

將0.5 mL不同質(zhì)量濃度(0.06、0.08、0.10 mg/mL)的白茶多酚添加到2 mL的DPPH乙醇溶液(0.335 mmol/mL，通過預(yù)實驗得到)，混合后在室溫條件下黑暗中靜置30 min，在517 nm處測定溶液的吸光度[13]。每組3個平行，DPPH自由基清除率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：Ai，DPPH工作液+白茶多酚OD值；Aj，空白校正，白茶多酚+乙醇OD值；Ao，空白對照，DPPH工作液+乙醇OD值。

1.3.2.2 ABTS陽離子自由基清除實驗

ABTS陽離子自由基工作液配制：A液：將3 mg的ABTS加入0.8 mL雙蒸水中，充分混勻、溶解；B液：將1 mg的過硫酸鉀加入1.5 mL雙蒸水中，充分混勻、溶解；各取A、B液0.2 mL混合后，黑暗中放置氧化12 h，用無水乙醇稀釋至在734 nm處測的OD為0.7±0.02[14]。結(jié)果表明，20倍稀釋時可達到實驗要求。

ABTS陽離子自由基清除實驗：向2.5 mL的EP管中加入1 mL的ABTS陽離子自由基工作液，加入0.4 mL不同質(zhì)量濃度(0.008、0.010、0.030 mg/mL)的白茶多酚，在黑暗中放置30 min，于734 nm處測定OD值。每組3個平行，ABTS陽離子自由基清除率計算如公式(2)所示：

(2)

式中：Ae，ABTS工作液+白茶多酚樣液OD值；Af，空白校正，白茶多酚樣液+無水乙醇OD值；Ag，空白對照，ABTS工作液+無水乙醇OD值。

1.3.3 動物

昆明雄性小鼠40只(6周齡)，將其飼養(yǎng)在恒溫[(25±2) ℃]和相對濕度[(50±5)%]的受控設(shè)施中，給予12/12 h的明暗周期，讓其自由食用標(biāo)準(zhǔn)鼠糧和水。

1.3.4 小鼠腎損傷模型的誘導(dǎo)

讓新購入的小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機分為4組(正常組、模型組、低劑量組、高劑量組)，每組10只。所有組均正常飲食和水，為期6周，正常組小鼠腹腔注射生理鹽水，另外 3組小鼠腹腔注射D-半乳糖120 mg/(kg·d)(0.1 mL/10g小鼠體重)[15]，時間為6周。低劑量組小鼠灌胃250 mg/(kg·d)白茶多酚溶液，高劑量組小鼠灌胃500 mg/(kg·d)白茶多酚溶液，注射或口服劑量為0.2 mL，每日1次，所有組小鼠均正常飲食。通過參考文獻以及預(yù)實驗證明白茶多酚濃度選擇對小鼠無明顯致死作用[16]。該動物試驗方案經(jīng)重慶第二師范學(xué)院重慶市功能食品協(xié)同創(chuàng)新中心動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3.5 收集樣本

按照D-半乳糖誘導(dǎo)模型方法喂養(yǎng)6周后，最后1次灌胃后將其禁食24 h處死。采取摘眼球取血，等小鼠完全死后迅速進行解剖，得到腎組織，切除腎器官周圍脂肪和結(jié)締組織，并用生理鹽水清洗殘余血液及其他雜質(zhì)，準(zhǔn)確稱取腎器官重量并記錄數(shù)據(jù)。切除小部分腎臟組織固定于10%(體積分?jǐn)?shù))甲醛溶液中保存用于后續(xù)制作切片。其余保存在-80 ℃為后續(xù)實驗備用。

1.3.6 組織學(xué)觀察

通過蘇木精-伊紅染色法進行。腎臟組織用10%甲醛溶液固定后，用不同濃度梯度的乙醇溶液進行梯度脫水，脫水后的組織用二甲苯和酒精混合液處理再進行透蠟，最后進行包埋、切片與染色，然后顯微觀察。

1.3.7 腎組織中生化指標(biāo)的測定

1.3.7.1 腎組織勻漿

取出-80 ℃下放置的小鼠腎臟組織，待其解凍后，用冰冷的生理鹽水漂洗，除去血液，濾紙拭干，然后精密稱取0.1 g，置于勻漿管中，加入1 mL的生理鹽水上勻漿機混勻制成10%的腎組織勻漿，再用普通的離心機離心取上清液待測。多余的放入-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7.2 測定方法

采用試劑盒檢測腎臟組織中生化指標(biāo)GSH-Px、CAT、T-AOC、NO、MDA。具體操作方法參照各試劑盒說明書。

1.3.8 腎臟組織中細(xì)胞因子的測定

取用1.3.7.1中備用的腎臟組織勻漿，使用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ABCAM，美國)測定細(xì)胞因子IL-6、IL-10、IFN-α、IFN-β、IFN-γ的水平。具體操作方法參照各試劑盒說明書。

1.3.9 化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)

隱綠原酸、表兒茶素、山柰苷、對香豆酸，北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司；沒食子兒茶素沒食子酸酯，上海金穗生物科技有限公司；蘆丁，廣州分析測試中心科力技術(shù)開發(fā)公司。

1.3.10 高效液相色譜分析

1.3.10.1 樣液制備和色譜條件

精密稱取0.1 g的白茶粉末于10 mL容量瓶再加入二甲基亞楓(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液定容至刻度線混勻30 s，得到質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，再用50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇稀釋至2.0 mg/mL。樣液過0.22 μm濾膜過濾至棕色液相小瓶中，上機測試。色譜柱：Accucore C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)。流動相A：0.5%(體積分?jǐn)?shù))的乙酸水，流動相B：乙腈，流速1.2 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長285 nm，進樣體積10 μL。梯度洗脫條件為：平衡階段10% B為10 min(等梯度)；10%～90% B為0～30 min(線性梯度)，90% B為30～35 min(等梯度)；90%～10% B為35～40 min(線性梯度)。

1.3.10.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

精密吸取50 μL各標(biāo)準(zhǔn)溶液隱綠原酸(0.4 mg/mL)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(1 mg/mL)、表兒茶素(2.2 mg/mL)、蘆丁(1.5 mg/mL)、山柰苷(1 mg/mL)、對香豆酸(1.15 mg/mL)于EP管中制成300 μL的原標(biāo)溶液，再加入50%甲醇溶液700 μL混勻，于1.3.10.1中色譜條件下分別進樣10、8、6、4、2 μL，測定其峰面積，以各標(biāo)準(zhǔn)品實際進樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.10.3 重現(xiàn)性實驗

精密稱取白茶，按照1.3.10.1中方法配制成2 mg/mL樣品溶液，過濾，用移液槍吸取1 mL過0.22 μm濾膜后置棕色色譜瓶中，重復(fù)進樣6次，每次進樣10 μL，在相同色譜條件下進行測定，計算6次峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)。

1.3.10.4 回收率試驗

精密稱取白茶試樣，按照1.3.10.1中方法配成2 mg/mL的樣品溶液，并各取900 μL樣品溶液于6個EP管中，再分別取隱綠原酸(0.4 mg/mL)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(1 mg/mL)、表兒茶素(2.2 mg/mL)、蘆丁(1.5 mg/mL)、山柰苷(1 mg/mL)、對香豆酸(1.15 mg/mL)標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL混勻，過0.22 μm濾膜，轉(zhuǎn)置于色譜瓶中在相同色譜條件下進行測定，從而計算其回收率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行計算，結(jié)果采用Duncan多重比較和單因素方差分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。所有的實驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 白茶多酚的抗氧化活性

DPPH是一種極穩(wěn)定的自由基，能夠接受電子或氫自由基的單電子并成為穩(wěn)定的抗磁電子，它也能使乙醇溶液從深紫色變成黃色，且變色程度與其接受電子數(shù)量呈定量關(guān)系[17]。如圖1所示，清除實驗表明0.10 mg/mL的白茶提取物對DPPH自由基有68%(P<0.05)的清除能力，高于0.08 mg/mL組的47%(P<0.05)和0.06 mg/mL組的34%(P<0.05)。

正解：焰色反應(yīng)呈黃色說明該物質(zhì)中一定含鈉元素,既可能是金屬鈉,也可能是鈉的化合物;鈉的黃光對觀察鉀的焰色有干擾,必須透過藍(lán)色的鈷玻璃濾去黃光后才能觀察有無鉀元素。

ABTS是一種過氧化氫酶的底物，ABTS/ABTS陽離子自由基的氧化還原電位為0.68 V，容易發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，生成穩(wěn)定的綠色ABTS陽離子陽離子自由基，可以通過檢測樣品對ABTS陽離子自由基的清除能力了解其抗氧化性強弱[18]。如圖1所示，0.030 mg/mL的白茶多酚對ABTS陽離子自由基有58.0%(P<0.05)的清除能力，高于0.010 mg/mL組的42.9%(P<0.05)和0.008 mg/mL組的38.9%(P<0.05)。

綜上，白茶多酚質(zhì)量濃度越高其清除自由基能力越強(P<0.05)，表明白茶多酚對2種自由基的清除能力具有劑量依賴關(guān)系，其濃度與清除能力大小呈正相關(guān)，且存在顯著性差異(P<0.05)。

A-DPPH自由基清除能力；B-ABTS陽離子自由基清除能力圖1 白茶多酚對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力Fig.1 The scavenging ability of white tea polyphenols on DPPH radical,ABTS cationic radical 注：不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.2 小鼠腎臟器官系數(shù)的觀察

器官系數(shù)是毒理學(xué)實驗中常用的重要指標(biāo)，器官系數(shù)減小，表明器臟萎縮及其他退行性改變等，而器官系數(shù)增大則表明器臟水腫、充血或增生肥大等[19]。因此觀察小鼠器官指數(shù)的變化對判斷小鼠衰老具有重要參考價值。如表1所示，與正常組相比，模型組的小鼠腎臟系數(shù)明顯下降，而經(jīng)由白茶多酚[250、500 mg/(kg·d)]處理后，其腎臟系數(shù)有所升高，其中高劑量組[500 mg/(kg·d)]效果最好。與正常組相比，模型組、低劑量和高劑量組P值均小于0.01，說明測定結(jié)果的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 白茶多酚對D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠腎臟系數(shù)的影響Table 1 Effects of white tea polyphenols on renal organ coefficients induced by D-galactose in mice

2.3 組織學(xué)分析

腎臟是人體重要的排泄器官，它可以通過生成尿液來清除體內(nèi)水溶性代謝產(chǎn)物及某些廢物、毒物，也對電解質(zhì)、水，與酸堿平衡調(diào)節(jié)和各種生物活性物質(zhì)分泌有著重要的作用，如果腎功能衰竭會對人體產(chǎn)生很嚴(yán)重的危害[20-21]。經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)由D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠發(fā)生了嚴(yán)重的腎損傷，通過對腎臟組織切片的觀察發(fā)現(xiàn)腎臟組織的形態(tài)發(fā)生了較大的變化。如圖2所示，正常組腎臟組織細(xì)胞內(nèi)腎小球大多呈球形或橢圓形，形態(tài)比較規(guī)則，腎小管的結(jié)構(gòu)也比較完整清晰，細(xì)胞染色均勻，炎癥較輕。而模型組細(xì)胞腎小球，形態(tài)不規(guī)則，腎小囊腔面積增大，細(xì)胞排列雜亂沒有規(guī)則，且細(xì)胞染色不均勻，有嚴(yán)重炎癥。經(jīng)白茶多酚[250、500 mg/(kg·d)]處理后，小鼠腎臟細(xì)胞較模型組排列有序，且形態(tài)略變規(guī)則，腎小球，腎小囊腔面積均減小，炎癥情況有所改善，其中[500 mg/(kg·d)]白茶多酚處理的小鼠腎臟較[250 mg/(kg·d)]效果更好。并且與模型組相比，白茶多酚處理的小鼠腎臟細(xì)胞髓袢更為規(guī)則，其形態(tài)結(jié)構(gòu)及排列規(guī)則與正常組更相近。

圖2 不同劑量白茶多酚處理對小鼠腎損傷細(xì)胞的影響Fig.2 Effects of different concentrations of white tea polyphenols on rat damaged renal cells 注: A-1：正常組(×40倍數(shù))；A-2：正常組(×200倍數(shù))；B-1模型組 (×40倍數(shù))；B-2：模型組(×200倍數(shù))；C-1：250 mg/(kg·d) 白茶多酚組(×40倍數(shù))；C-2：250 mg/(kg·d)白茶多酚組(×200倍數(shù))； D-1：500 mg/(kg·d)白茶多酚組(×40倍數(shù))；D-2：500 mg/(kg·d) 白茶多酚組(×200倍數(shù))；E: 正常組髓袢；F: 模型組髓袢；G: 250 mg/(kg·d) 白茶多酚組髓袢；H: 500 mg/(kg·d)白茶多酚組髓袢

2.4 白茶多酚處理后小鼠腎損傷細(xì)胞中MDA、NO、CAT、GSH-Px、T-AOC含量變化

MDA是機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，其含量高低能反應(yīng)機體過氧化程度,會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性，在體外會影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性[22]。如圖3所示，與正常組相比，模型組腎臟組織中MDA、NO含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，經(jīng)白茶多酚[250、500 mg/(kg·d)]處理組腎臟組織MDA和NO含量均有所下降，500 mg/(kg·d)劑量組含量最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。正常情況下，機體的氧化和抗氧化處于動態(tài)平衡狀態(tài)，然而當(dāng)這種平衡被打破時，外界的刺激很容易導(dǎo)致機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，進而產(chǎn)生大量的過氧化物危害身體健康[23]。NO是一種化學(xué)性質(zhì)活潑的自由基，半衰期短，能夠傳遞生物信息，維持體內(nèi)微循環(huán)內(nèi)環(huán)境恒定和保護機體非特異性免疫功能，其異常會引起相關(guān)疾病的發(fā)生，且濃度會隨年齡的增長而增加[24]。

CAT是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可以清除機體內(nèi)的H2O2，保護細(xì)胞免受過氧化物的侵害，根據(jù)其蛋白結(jié)構(gòu)和氨基酸序列的異同可以分為單功能CAT、雙功能CAT、錳CAT，大量研究結(jié)果表明單功能CAT在機體抗氧化、生長發(fā)育、抵御疾病的氧平衡方面起著重要作用[25]。GSH-Px是一種過氧化物分解酶，能將體內(nèi)的H2O2和脂質(zhì)過氧化物代謝為水和相應(yīng)的惰性醇，并且能夠催化GSH變?yōu)镚SSG，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而保護細(xì)胞和組織過氧化損[26]。T-AOC 能夠反映機體防御系統(tǒng)的總抗氧化能力。與正常組比較，模型組小鼠腎臟組織中T-AOC、GSH-Px、CAT活力均有顯著的降低(P<0.05)。與模型組相比，在不同質(zhì)量濃度(250、500 mg/mL)的白茶多酚處理后，小鼠腎臟組織中T-AOC、GSH-Px、CAT含量均有所提高(P<0.05)，并且高劑量的白茶多酚處理效果更好。

A-MDA；B-NO；C-CAT；D-T-AOC；E-GSH-Px圖3 白茶多酚對腎損傷細(xì)胞內(nèi)MDA、NO、GSH-Px、CAT、T-AOC含量的影響Fig.3 Effects of white tea polyphenols on the contents of MDA, NO, GSH-PX, CAT and T-AOC in renal damaged cells

2.5 白茶多酚處理后小鼠腎損傷細(xì)胞中IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-β、IFN-γ水平變化

如圖4所示，與正常組相比，模型組小鼠腎組織中IL-6、TNF-α、IFN-γ均有所升高(P<0.05)，經(jīng)過不同劑量[250、500 mg/(kg·d)]的白茶多酚處理后，其水平均有所降低(P<0.05)，并且高濃度組水平最低。其中腫瘤壞死因子TFN-α可能通過刺激腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生多種縮血管介導(dǎo)因子，如血小板活化因子、前列腺素等，引起血管收縮，加重腎功能障礙，也可以促進細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子，進而促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生[27-28]。IL-6會導(dǎo)致炎癥部位急性蛋白和T細(xì)胞的積累[29]?？寡装Y因子IL-10能夠減輕體內(nèi)炎癥程度，使機體維持在正常水平。

A-IL-6；B-TNF-α；C-IL-10；D-IFN-β；E-IFN-γ圖4 白茶多酚對腎損傷細(xì)胞內(nèi)IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-β、IFN-γ的影響Fig.4 Effects of white tea polyphenols on IL-6, TNF-α, IL-10, IFN-β and IFN-γ levels in renal damaged cells

2.6 白茶多酚的化學(xué)成分分析

2.6.1 白茶多酚的種類及含量分析

通過高效液相色譜對比相關(guān)文獻分析，共檢測到6種化合物：隱綠原酸(7.220 min)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(8.703 min)、表兒茶素(8.997 min)、蘆丁(9.453 min)、山柰苷(9.667 min)、對香豆酸(10.563 min)。6種化合物在255 nm處分離效果較好，且色譜峰面積比較大，響應(yīng)效果好，峰形也較好。根據(jù)圖5、圖6與表2可知，其含量分別為1.096 00、5.545 00、0.472 50、0.051 35、0.075 50、0.210 60 mg/g，其中沒食子兒茶素沒食子酸酯含量最高，其次是隱綠原酸，蘆丁含量最少。

1-隱綠原酸；2-沒食子兒茶素沒食子酸酯3-表兒茶素；4-蘆丁；5-山柰苷；6-對香豆酸(下同)圖5 混合標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖Fig.5 Liquid chromatogram of mixed standard substance

圖6 白茶多酚液相色譜圖Fig.6 Liquid chromatography of white tea polyphenols

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗

通過試驗可知隱綠原酸、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、蘆丁、山柰苷、對香豆酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液線性方程如表2所示，以各標(biāo)準(zhǔn)品實際進樣量(μg)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 線性關(guān)系試驗結(jié)果Table 2 Linear relationship test results

結(jié)果表明，隱綠原酸、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、蘆丁、山柰苷、對香豆酸的擬合度R2分別為0.974 6、0.987 3、0.996 7、0.981 8、0.978 0、0.999 6，線性方程表現(xiàn)了良好的線性關(guān)系。

2.6.3 重現(xiàn)性

隱綠原酸、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、蘆丁、山柰苷、對香豆酸的峰面積RSD值分別為0.64%、3.75%、1.56%、4.87%、4.22%、1.43%，表明此方法重現(xiàn)性良好。

2.6.4 加標(biāo)回收率

由表3可知，隱綠原酸、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、蘆丁、山柰苷、對香豆酸的回收率分別為97.43%、91.96%、101.5%、93.73%、85.25%、97.91%，說明高效液相色譜法對白茶多酚類化合物的質(zhì)量控制準(zhǔn)確性較好。

表3 回收率試驗結(jié)果Table 3 Recovery test results

3 討論

茶既是飲料，又可用來防病、治病，健身，兩種功效兼?zhèn)鋄31]。而茶內(nèi)含的多酚類物質(zhì)是一種具有預(yù)防惡性腫瘤作用的化學(xué)物質(zhì)，具有很強的清除和降低自由基活性能力。白茶多酚已被證明可以降低血糖、血脂水平，具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤特性，同時還可以延緩衰老和解毒[32]。

采用高效液相色譜法檢測白茶多酚樣品，發(fā)現(xiàn)其含有隱綠原酸、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、蘆丁、山柰苷、對香豆酸6種生物活性成分，其中沒食子兒茶素沒食子酸酯可以顯著減少細(xì)胞內(nèi)脂滴和主要脂生轉(zhuǎn)錄因子的表達，如PPAR γ, SREBP-1c and C/EBP α，也能夠劑量依賴性地降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和IL-6誘導(dǎo)的產(chǎn)生[33]。蘆丁的結(jié)構(gòu)中含有豐富的官能團，能與金屬離子螯合成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),發(fā)揮穩(wěn)定的生物活性作用,具有抗自由基、抗炎、抗病毒和保護心腦血管、胃腸道黏膜等作用[34]。山柰苷可以抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡，在人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣共體細(xì)胞中減輕炎癥，并且可以降低IL-6和TNF-α的表達水平[35]。對香豆酸可以清除體內(nèi)的自由基，抑制脂質(zhì)過氧化和DNA氧化損傷，抗炎和抗腫瘤的作用，有效預(yù)防血小板凝集，并對細(xì)菌有一定的抑制作用[36]。綜上所述，這些活性化學(xué)物質(zhì)在白茶多酚中的存在可能是其各種藥理作用的主要原因。

白茶多酚[250、500 mg/(kg·d)]對D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠腎損傷模型的改善作用包括：調(diào)節(jié)小鼠腎臟器官的重量；改善腎臟細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、水腫和炎癥；提升機體內(nèi)CAT、GSH-Px、T-AOC的含量和降低MDA和NO的含量；下調(diào)炎癥因子IL-6、TNF-α、IFN-γ的濃度和上調(diào)抗炎癥因子IL-10、IFN-β的濃度；此外，高效液相色譜檢測的6種化合物已被證實具有抗氧化、抗炎癥和抗腫瘤等多種生物活性。但是，本研究僅對白茶多酚的體外抗氧化活性及腎損傷的改善作用作了初步研究，對于抗氧化作用的保護機制，還需進一步深入研究。