鄧衍宏，劉慶國，汪虎，應(yīng)漢杰，陳勇*，李義

1(宿州中糧生物化學(xué)有限公司，安徽 宿州，234000)2(南京高新工大生物技術(shù)研究院有限公司，江蘇 南京，210032) 3(吉林中糧生化有限公司，吉林 長春，130033)

傳統(tǒng)的大宗生化品發(fā)酵模式依然采用大接種量的單批次發(fā)酵，如燃料酒精、氨基酸、有機(jī)酸和酶制劑等，發(fā)酵工藝優(yōu)化改進(jìn)空間有限，而生產(chǎn)成本最高的部分——料問題短期內(nèi)也無法得到有效緩解，所以生產(chǎn)企業(yè)在未來競爭中生存的根本是發(fā)酵技術(shù)的創(chuàng)新[1-2]。傳統(tǒng)發(fā)酵工藝主要存在2個(gè)方面的缺陷:一是生物催化劑耐受性差，易失活。細(xì)胞是由蛋白質(zhì)、磷脂等物質(zhì)組成的一種柔性結(jié)構(gòu)。工業(yè)環(huán)境中有機(jī)酸、高濃度鹽類、H+等化學(xué)物質(zhì)的侵入容易使其失去生命功能。由于細(xì)胞耐受性差，生物反應(yīng)體系的最終產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)過程效率均低于化學(xué)催化體系。二是生物催化劑易老化。微生物細(xì)胞隨著時(shí)間的推移細(xì)胞增殖和分化的能力逐漸衰退,自溶現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致發(fā)酵過程的合成能力下降和催化劑浪費(fèi)的現(xiàn)象,從而表現(xiàn)為底物轉(zhuǎn)化效率低[3]。

解決上述問題的最佳途徑是固定化發(fā)酵技術(shù)。常規(guī)固定化載體包括海藻酸鈣、卡拉膠、聚乙烯醇凝膠等[4-5]。然而，高攪拌環(huán)境嚴(yán)重影響了固定化技術(shù)的可行性。表面固定化技術(shù)作為一種新型表面固定化方法以多方面優(yōu)勢而越來越受到世人關(guān)注。短短20年期間，發(fā)展非常迅速，應(yīng)用越來越廣泛。利用棉纖維作為表面固定化材料具有成本低、比表面積大、吸附效果好以及表面基團(tuán)易于修飾改性等優(yōu)點(diǎn)。目前已經(jīng)在有機(jī)酸、酶制劑以及工業(yè)污水處理等應(yīng)用中實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)室或小試規(guī)模的成功驗(yàn)證[6-9]；尤其在燃料乙醇方面，陳勇研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)完成了320 t發(fā)酵罐規(guī)模的示范試驗(yàn)研究[5]。

本研究基于前期研究的基礎(chǔ)上，采用化學(xué)修飾的方式對(duì)纖維載體進(jìn)行基團(tuán)修飾，以提高菌體吸附能力，進(jìn)行定量化的固定化發(fā)酵產(chǎn)乙醇的研究，為工業(yè)化應(yīng)用提供更為精準(zhǔn)的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

安琪耐高溫活性酵母粉。

1.1.2 固定化載體

固定化載體為棉纖維，采用化學(xué)修飾劑為(F6)進(jìn)行化學(xué)改性，用量是毛巾質(zhì)量的10%(-1)、25%(-2)和50%(-3)。在95%乙醇中浸泡毛巾，42 ℃下?lián)u床(轉(zhuǎn)速200 r/min)中振蕩反應(yīng)48 h。反應(yīng)結(jié)束后，用純水清洗10次，并進(jìn)行凍干處理備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：麥芽汁固體培養(yǎng)基(麥芽250 g/L磨碎過濾加瓊脂20 g/L，121 ℃滅菌20 min，備用)。種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏10、蛋白胨20、葡萄糖20、磷酸二氫鉀1.5、硫酸銨4、硫酸鎂0.5。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏5、蛋白胨5、葡萄糖230、磷酸二氫鉀3、硫酸銨4、硫酸鎂 0.5、七水合硫酸亞鐵0.05、七水合硫酸鋅0.05。

1.1.4 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜，安捷倫；752 N分光光度計(jì)，上海儀電；SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；JSM-6010掃描電鏡，JEOL；XSP10顯微鏡，萬衡儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 種子培養(yǎng)

挑取1環(huán)經(jīng)麥芽汁活化的斜面種子于200 mL滅菌過的種子培養(yǎng)基中，并置于溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min的搖床培養(yǎng)18 h。

1.2.2 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)及固定

將裝有4 g呈正方形棉纖維(2.5 cm×2.5 cm×2 mm)的500 mL的錐形瓶加入200 mL新鮮種子培養(yǎng)基，115 ℃滅菌15 min。冷卻至室溫后，量取10%(體積分?jǐn)?shù))的種子液加到錐形瓶中。再置于30 ℃搖床上固定16 h。

1.2.3 固定化細(xì)胞發(fā)酵

將固定結(jié)束后的廢液倒出，加入新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，于溫度33 ℃，轉(zhuǎn)速100 r/min的搖床上培養(yǎng)若干時(shí)間(以不產(chǎn)氣泡及糖降至3 g/L以下為準(zhǔn)，下同)。該實(shí)驗(yàn)為破壞性實(shí)驗(yàn)，每批次設(shè)3個(gè)平行搖瓶，每批次樣培養(yǎng)結(jié)束倒出發(fā)酵液測溶液OD600值，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)、出芽率和死亡率。瓶中載體加入200 mL純水振蕩，并整體倒入1 L的燒杯中，超聲振蕩解離出酵母細(xì)胞，將載體取出，燒杯中的液體檢測OD600值，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)、出芽率和死亡率，并取10 mL離心測量菌體體積。測完后排出液體，將載體放回?zé)?，重新倒?00 mL純水解離細(xì)胞，清液檢測OD600值，再重新加水洗，然后再重復(fù)2次，即加水4次。

1.2.4 游離細(xì)胞發(fā)酵

500 mL的錐形瓶加入200 mL新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，設(shè)3個(gè)平行樣。115 ℃滅菌15 min。冷卻至室溫后，量取10%(體積分?jǐn)?shù))的種子液加到錐形瓶中。再置于溫度33 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min的搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)若干時(shí)間。結(jié)束倒出發(fā)酵液測溶液OD600值，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)、出芽率和死亡率。

1.2.5 分析方法

OD值測定：游離酵母：稀釋一定倍數(shù)，通過可見分光光度計(jì)，在波長為600 nm的條件下檢測。固定化酵母：通過振蕩從棉纖維上解離下來，然后用上述方法測得OD值。

細(xì)胞數(shù)測定：血球計(jì)數(shù)法，取2.5 mL混勻樣品放入100 mL容量瓶中，加1 mL次亞甲基藍(lán)；定容、靜置1 min，置于血球計(jì)數(shù)板上，用顯微鏡計(jì)量細(xì)胞個(gè)數(shù)，其中，死亡率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

葡萄糖測定：生物傳感分析儀SBA。

乙醇測定：氣相色譜：初始柱溫70 ℃，升溫速率20 ℃/min，終止溫度為190 ℃；前進(jìn)樣口溫度180 ℃；前檢測器溫度220 ℃；氫氣流速30 mL/L，空氣流速200 mL/L，氮?dú)饬魉?0 mL/L。相關(guān)計(jì)算如公式(2)～公式(4)所示：

(2)

(3)

(4)

掃描電鏡：參照文獻(xiàn)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌體吸附的影響

如圖1所示，轉(zhuǎn)速越高，游離酵母數(shù)越高，說明菌體吸附量越低，故轉(zhuǎn)速過大不利于菌體吸附。棉纖維對(duì)菌體的吸附作用是利用載體和細(xì)胞表面所帶電荷的靜電引力，使細(xì)胞吸附于載體上。載體對(duì)微生物的吸附主要是細(xì)胞表面與載體表面間的范德華力和離子型氫鍵的靜電相互作用的結(jié)果，這種作用力相對(duì)較弱[11-12]。而當(dāng)轉(zhuǎn)速過低，如轉(zhuǎn)速40 r/min時(shí)，游離酵母數(shù)幾乎為0，這是由于菌體大量沉淀，并非由于吸附的作用，此轉(zhuǎn)速下，菌體由于自身重力較大，下沉作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于橫向吸附的作用，故轉(zhuǎn)速過低，也不利于菌體吸附。當(dāng)轉(zhuǎn)速為80 r/min時(shí)，無菌體沉淀現(xiàn)象，游離酵母數(shù)較低，說明菌體已經(jīng)幾乎被完全吸附?？紤]后面不同修飾作用對(duì)載體吸附能力評(píng)估實(shí)驗(yàn)，故將轉(zhuǎn)速定為100 r/min相對(duì)較佳，此時(shí)菌體吸附比例為71.2% (初始OD值為12.10)。

2.2 固定化載體修飾對(duì)菌體吸附的影響

如圖2所示，經(jīng)過F6處理后的載體吸附效果有不同程度提升。F6-1與未修飾的載體對(duì)酵母吸附能力差異不顯著(P>0.05)。F6-2、F6-2與未修飾的載體對(duì)酵母吸附能力差異顯著(P<0.05)，其中F6-2處理效果更佳。F6-2對(duì)酵母吸附量達(dá)到83.1%(初始OD值為11.03)，比未處理的固定化載體提高了15.9%。

圖1 不同轉(zhuǎn)速對(duì)載體吸附能力的影響Fig.1 Effect of different rotational speeds on carrier adsorption capacity

圖2 不同處理方法對(duì)載體吸附能力的影響Fig.2 Influence of different treatment methods on carrier adsorption capacity

從電鏡照片上看(圖3)，處理過的載體表面(圖3-b)相比未處理的(圖3-a)更為粗糙。由圖3-c可明顯發(fā)現(xiàn)，菌體易于在粗糙的表面聚集生長。另一方面研究表明，酵母在酸性環(huán)境下表面攜帶正電荷[13]。當(dāng)棉纖維表面羥基與硅氧烷發(fā)生耦聯(lián)反應(yīng)，使得棉纖維引入丙烯酸基團(tuán)而呈負(fù)電荷特性。故修飾后的載體與酵母的結(jié)合能力進(jìn)一步提高。結(jié)果表明，F(xiàn)6-2對(duì)載體的修飾是有效的，且修飾后的載體對(duì)菌體吸附效果也是顯著的。

a-未處理載體表面；b-化學(xué)處理載體表面； c-修飾載體表面吸附的酵母圖3 載體表面電鏡照片F(xiàn)ig.3 Electron microscopy of carrier surface

2.3 游離發(fā)酵與反復(fù)批次發(fā)酵對(duì)比

發(fā)酵終點(diǎn)以不產(chǎn)氣泡及殘還原糖降至3 g/L以下為準(zhǔn)。從表1看，固定化發(fā)酵周期呈現(xiàn)下降趨勢，相應(yīng)的產(chǎn)率有顯著提高。發(fā)酵至6批時(shí)發(fā)酵周期縮短至18 h，產(chǎn)率達(dá)到6.33 g/(L·h)。乙醇濃度和轉(zhuǎn)化率值較為穩(wěn)定。發(fā)酵6批的平均轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率分別為96.77%和5.22 g/(L·h)，相比游離發(fā)酵，分別提高3%和51.7%。相關(guān)研究表明，固定化載體可促進(jìn)菌體形成明顯的生物膜，降低細(xì)胞毒害作用。同時(shí)由于顯著的菌群優(yōu)勢使得反應(yīng)速率大幅提高[14-16]，本文研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相一致。

表1 各批次發(fā)酵指標(biāo)Table 1 Fermentation indexes of each batch

2.4 細(xì)胞集群效應(yīng)分析

從表2中可發(fā)現(xiàn)，游離發(fā)酵體系中，3個(gè)平行樣結(jié)果差距不明顯，說明平行效果較好。游離發(fā)酵總細(xì)胞數(shù)近2.5×108個(gè)/mL，發(fā)酵終點(diǎn)死亡率較高、出芽率較低。

從圖4-a可明顯發(fā)現(xiàn)，游離細(xì)胞部分呈現(xiàn)不飽滿形態(tài)。這主要由于高酒度低營養(yǎng)環(huán)境中游離酵母在攪拌的剪切作用下更易發(fā)生衰退現(xiàn)象[16]。

a-游離酵母；b-固定化酵母圖4 載體表面電鏡照片F(xiàn)ig.4 Electron microscopy of carrier surface

在固定化發(fā)酵體系中，如表3所示，游離酵母細(xì)胞為0.9×108個(gè)/mL左右，濃度較為恒定。而載體上吸附菌量隨著批次增加呈現(xiàn)上升趨勢。另外，載體上的菌體出芽率較低，且相比游離細(xì)胞，形態(tài)更為完整(圖4-b)，說明細(xì)胞生長周期顯著延長。而載體上細(xì)胞死亡率相對(duì)較高，這可能是由于內(nèi)部菌體受傳質(zhì)影響引起的死亡現(xiàn)象[17]?？傮w細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢可能由于每批次的游離細(xì)胞部分吸附于載體表面所致。6批培養(yǎng)后菌體吸附量為200×108個(gè)/g，(其折算到固定化發(fā)酵體系里為4.03×108個(gè)/mL)，固定化發(fā)酵體系總酵母數(shù)為4.86×108個(gè)/mL，是游離發(fā)酵體系的2倍。這與上述2種模式發(fā)酵速率之間的差別結(jié)果較為一致。祝英等[18]對(duì)比了海藻酸鈣凝膠法、瓊脂凝膠法、明膠-戊二醛交聯(lián)法和聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)對(duì)酵母固定化發(fā)酵影響，發(fā)現(xiàn)8%的PVA發(fā)酵效果更佳，載體吸附量為8×108個(gè)/g，發(fā)酵48 h酒度為10%～11%，即對(duì)應(yīng)的反應(yīng)速率近2 g/(L·h)，是游離發(fā)酵速率的2～3倍。相關(guān)研究表明，細(xì)胞吸附于載體后大量增殖，形成密集的菌群，進(jìn)而顯示出集群效應(yīng)[19]。集群效應(yīng)使群體成員之間實(shí)現(xiàn)生理協(xié)同作用，提高整個(gè)種群的代謝活力和生存能力[14]。吸附固定化方法克服了傳統(tǒng)包埋、交聯(lián)和共價(jià)結(jié)合法的缺陷，既能使細(xì)胞聚集發(fā)揮作用，又不會(huì)對(duì)細(xì)胞本身的活性產(chǎn)生顯著影響[20]。集群效應(yīng)提高了菌群優(yōu)勢，從而表現(xiàn)為較強(qiáng)的催化效率。

表3 固定化細(xì)胞發(fā)酵體系酵母生長情況Table 3 Yeast growth of immobilized cell fermentation system

3 結(jié)論與討論

(1)載體對(duì)菌體的吸附與轉(zhuǎn)速有顯著相關(guān)性，較高與較低均不利于酵母細(xì)胞吸附，轉(zhuǎn)速為100 r/min時(shí)效果最佳，菌體吸附比例達(dá)71.2%。

(2)經(jīng)過F6-2處理后的載體吸附效果有明顯提升，其吸附比例達(dá)到83.1%，比未處理的固定化載體提高了15.9%。處理過的載體表面相比未處理的更為粗糙，菌體易于在粗糙的表面聚集生長。

(3)固定化發(fā)酵穩(wěn)定性較好，發(fā)酵6批的平均轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率分別為96.77%和5.22 g/(L·h)，相比游離發(fā)酵，分別提高3%和51.7%。

(4)固定化發(fā)酵6批后菌體吸附量為4.03×108個(gè)/mL，總酵母數(shù)為4.86×108個(gè)/mL，是游離發(fā)酵體系的2倍，這可以定量地解釋2種模式發(fā)酵速率之間的差異性。