尹可宏，楊茜，趙秀飛，楊曦，李云嵌，張雪春*

1(西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明，650224)2(尋甸回族彝族自治縣衛(wèi)生健康綜合監(jiān)督執(zhí)法局，云南 昆明，655200)

花生(ArachishypogaeaL.)隸屬于豆科一年生草本植物，是我國(guó)種植產(chǎn)量最豐富、食用最廣泛的堅(jiān)果之一，其作為世界四大油料作物之一，富含蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]?；ㄉ手泻?4%～36%的蛋白質(zhì)，大部分為鹽溶性蛋白[2]。其中，花生球蛋白約占總蛋白的63%，分子質(zhì)量為350 kDa[3]，其具有較好的乳化性、起泡性、吸水性和凝膠性等功能特性，可作為一種優(yōu)良的食品原料廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。

研究發(fā)現(xiàn)，食品體系中的蛋白質(zhì)易受到自由基作用發(fā)生氧化，導(dǎo)致食品中蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)損失、風(fēng)味惡化以及功能性質(zhì)下降，進(jìn)而影響食品品質(zhì)。如不飽和脂肪酸氧化酸敗可使核桃蛋白發(fā)生氧化，使其食品色澤、風(fēng)味及品質(zhì)發(fā)生改變，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低[4]；崔旭海等[5]發(fā)現(xiàn)氧化可導(dǎo)致乳蛋白物理、化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，進(jìn)而改變其凝膠能力、保水能力和乳化能力；李艷青等[6]發(fā)現(xiàn)不受控制的激烈氧化環(huán)境會(huì)導(dǎo)致大豆蛋白功能性質(zhì)下降。但這些研究主要是針對(duì)核桃、大豆、米等植物蛋白進(jìn)行研究，對(duì)于花生蛋白組分的功能性質(zhì)評(píng)估相對(duì)較少，而關(guān)于羥自由基氧化對(duì)花生球蛋白結(jié)構(gòu)、功能性質(zhì)的影響方面的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究選取花生球蛋白為研究對(duì)象，利用鐵/過(guò)氧化氫/抗壞血酸(Fe/H2O2/Asc)建立羥自由基氧化體系(hydroxyl radical oxidation system，HROS)，對(duì)花生球蛋白進(jìn)行不同程度的氧化處理，考察羥自由基氧化對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響，從而為花生的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

花生仁(云南紅殼小花生)購(gòu)于昆明；牛血清白蛋白、福林酚試劑，上海源葉生物科技有限公司；過(guò)氧化氫、三氯乙酸、乙酸乙酯、三氯化鐵、抗壞血酸、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；三羥基甲基氨基甲烷-甘氨酸(trihydroxymethylaminomethane-glycine，Tris-Gly)緩沖溶液、2，4-二硝基苯肼(2, 4-dinitrophenyl hydrazine，DNPH)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalene sulfonic acid，ANS)，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。以上藥品、試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

5804R型多功能臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；艾卡IKA RV10基本型立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，南京榮華科學(xué)器材有限公司；Infinite F50型酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；F-7000型日立熒光分光光度儀，日本日立公司；Jasco J-715圓二色譜儀，佰泰科技有限公司；UV-2600紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花生球蛋白的提取

花生仁經(jīng)粉碎后置于燒杯中，加入5倍體積的石油醚，室溫條件下進(jìn)行攪拌脫脂3 h(重復(fù)3次)，風(fēng)干后過(guò)40目篩，即為脫脂花生粉。按照料液比1∶15(g∶mL)向脫脂花生粉中加入0.05 mol/L pH 7.9的Tris-HCl緩沖液，于30 ℃的環(huán)境下攪拌提取1 h，然后在4 ℃的環(huán)境中，以4 000 r/min離心30 min，保留上清液。在上清液中加入NaHSO3，使得上清液含NaHSO3濃度為0.01 mol/L，調(diào)節(jié)pH至6.4，同樣于30 ℃的環(huán)境下攪拌提取1 h。再次離心，沉淀用去離子水洗3次，凍干后即為花生球蛋白。

1.2.2 羥自由基氧化花生球蛋白的制備

參照PARK等[7]的方法并略加修改，通過(guò)鐵/過(guò)氧化氫/抗壞血酸(Fe/H2O2/Asc)體系產(chǎn)生羥自由基，主要是由FeCl3和H2O2通過(guò)氧化還原反應(yīng)而產(chǎn)生。在氧化體系中分別加入花生球蛋白，使其最終質(zhì)量濃度為10 mg/mL，添加H2O2使其終濃度分別為0、0.1、0.5、1、5、10、15 mmol/L，同時(shí)固定FeCl3和抗壞血酸在體系中終濃度為0.1 mmol/L，并置于搖床中37 ℃恒溫孵育氧化24 h后，添加EDTA終止氧化反應(yīng)，然后于去離子水中透析72 h，凍干后即為氧化花生球蛋白。以花生球蛋白添加等體積0.01 mmol/L pH 7.9的Tris-HCl緩沖液代替Fe/H2O2/Asc體系作為對(duì)照組。

1.2.3 羰基含量的測(cè)定

參照HUANG等[8]的方法并略加改動(dòng)。用0.01 mmol/L Tris-HCl緩沖液(含0.6 mol/L NaCl、pH 7.9)將氧化后的花生球蛋白粉配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的蛋白液。取4.5 mL 10 mg/mL的蛋白液于50 mL離心管中，加入3 mL 10 mmol/L的DNPH溶液，混勻后于室溫避光靜置1 h，并每隔10 min振蕩1次，然后加入3 mL 200 mg/mL的三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。在8 000 r/min下離心15 min，保留沉淀物，用3 mL等體積比的乙酸乙酯-乙醇溶液進(jìn)行洗滌3次(去除未反應(yīng)試劑)。加入12 mL 6 mol/L的尿素溶液，在37 ℃水浴下溶解沉淀20 min，最后在10 000 r/min下離心15 min，取1 mL上清液于370 nm處測(cè)定吸光值。以3 mL 2 mol/L的HCl溶液代替DNPH溶液作為空白對(duì)照。

1.2.4 游離巰基與總巰基含量的測(cè)定

參照HUANG等[8]的方法并略加修改。取45 mg花生球蛋白分散在15 mL測(cè)試液中，于25 ℃保溫1 h后，在25 ℃ 10 000 r/min離心15 min。取5 mL上清液，并添加50 μL 4 mg/mL的DTNB溶液，混勻靜置15 min后取1 mL上清液于412 nm處測(cè)吸光值。以5 mL的Tris-Gly緩沖液、5 mL含8 mol/L尿素的Tris-Gly緩沖液代替上清液分別作為測(cè)量游離巰基和總巰基含量的試劑空白。其中，Tris-Gly緩沖液(pH 8.0)用作游離巰基含量的測(cè)試液，pH 8.0含8 mol/L尿素的Tris-Gly緩沖液用作總巰基含量的測(cè)試液。

1.2.5 紫外掃描光譜測(cè)定

參照BACHRI等[9]的方法并略加修改。以pH 7.90.01 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液為空白，在室溫下測(cè)定質(zhì)量濃度為1 mg/mL氧化后花生球蛋白的紫外吸收?qǐng)D譜。

1.2.6 差示熱量掃描儀(differential scanning calorimetry，DSC)測(cè)定

參照PUGLIESE等[10]的方法并略加修改。采用DSC分析樣品的熱力學(xué)性質(zhì)，稱取5～10 mg樣品至鋁坩堝中，然后密封壓片，置于差示掃描熱分析儀分析。設(shè)置初始溫度為20 ℃，然后以10 ℃/min的速率升溫至120 ℃。

1.2.7 圓二色譜測(cè)定

參照LEE等[11]的方法并略加修改。將未氧化和氧化的花生球蛋白分別用去離子水配制成質(zhì)量濃度為50 μg/mL的蛋白溶液，之后用圓二色譜儀在25 ℃下測(cè)定其在190～250 nm的遠(yuǎn)紫外圖譜。以去離子水作為空白對(duì)照。在掃描速率、間隔時(shí)間、寬度以及最小間隔度分別為100 nm/min、0.25 s、1.0 nm和0.2 nm條件下進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)線性擬合出花生球蛋白中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的含量。

1.2.8 花生球蛋白溶解度的測(cè)定

參照WANG等[12]的方法并略加修改?；ㄉ虻鞍滓?0 mmol/L pH 7的磷酸鹽緩沖液配制成1 mg/mL溶液，攪拌1 h后，于8 000 r/min離心15 min，用福林酚法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，并用凱氏定氮法測(cè)定樣品中總蛋白質(zhì)含量。按公式(1)計(jì)算花生球蛋白的溶解性:

(1)

1.2.9 花生球蛋白濁度的測(cè)定

參考JIANG等[13]的方法并略加修改。吸取5 mL 1 mg/mL經(jīng)不同羥自由基氧化體系氧化的花生球蛋白溶液于試管中，在40 ℃的水浴鍋中水浴30 min后取出，冷卻后在600 nm處測(cè)定吸光值，用吸光度代表濁度。以不加花生球蛋白的溶液為空白。

1.2.10 花生球蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的測(cè)定

參照CANO-MEDINA等[14]的方法并略為修改。花生球蛋白以50 mmol/L pH 7的磷酸鈉緩沖液配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，攪拌1 h后取40 mL蛋白液于10 000 r/min均質(zhì)分散2 min，分別測(cè)定 0 min 和60 min的蛋白液的總體積。花生球蛋白的起泡性與起泡穩(wěn)定性分別按公式(2)和公式(3)計(jì)算:

(2)

(3)

式中：V，初始體積，mL；V1，分散后0 min的體積，mL；V2，靜置60 min的體積，mL。

1.2.11 花生球蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

(4)

(5)

式中：A0，0 min的吸光值；A10，靜置10 min的吸光值；N，稀釋因子，500；ρ，蛋白質(zhì)量濃度，g/mL；φ，乳狀液油相體積分?jǐn)?shù)，25%；L，比色光徑，1 cm；t，時(shí)間間隔，10 min。

1.2.12 花生球蛋白表面疏水性的測(cè)定

1.2.13 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Origin 8.6軟件分析和作圖，SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性分析，P<0.05認(rèn)為樣品間具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥自由基氧化對(duì)花生球蛋白羰基含量的影響

蛋白質(zhì)中側(cè)鏈上帶有—NH或—NH2的氨基酸容易受羥自由基氧化而產(chǎn)生羰基，羰基含量可以反映出蛋白質(zhì)氧化程度[16]。HROS對(duì)花生球蛋白羰基含量的影響如圖1所示。隨著H2O2濃度的增加，羰基含量整體以濃度依賴性呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)。當(dāng)H2O2濃度為0～5 mmol/L時(shí)，其羰基含量緩慢上升；當(dāng)H2O2濃度為10 mmol/L時(shí)，其羰基含量迅速增加，并在H2O2濃度為15 mmol/L時(shí)含量達(dá)到最高值，為(29.69±0.14) nmol/mg，是對(duì)照組[(16.05±0.13) nmol/mg]的1.85倍(P<0.05)。該結(jié)果表明花生球蛋白的氧化程度隨H2O2濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，這與ZHANG等[17]研究結(jié)果相一致。可能是因?yàn)殡S著H2O2濃度的增加，越來(lái)越多的羥自由基會(huì)進(jìn)攻氨基酸分子中的自由氨基或亞氨基，使部分氨基酸殘基和多肽鏈發(fā)生氧化，進(jìn)而氧化生成羰基衍生物和NH3，故隨著氧化劑用量的增大，氧化體系產(chǎn)生的羰基含量也逐漸增加。

圖1 羥自由基氧化后花生球蛋白羰基含量變化情況Fig.1 Changes of carbonyl content of arachin after hydroxyl radical oxidation 注：不同字母表示同組間不同氧化程度的花生球蛋白樣品之間 差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 羥自由基氧化對(duì)花生球蛋白游離巰基和總巰基含量的影響

蛋白被氧化之后，其總巰基和游離巰基含量會(huì)發(fā)生下降，可用于表征氧化程度。HROS對(duì)花生球蛋白的游離巰基和總巰基含量的影響如圖2所示，在一定范圍內(nèi)隨著H2O2濃度的增加，花生球蛋白游離巰基和總巰基含量均逐漸減少。當(dāng)H2O2的濃度為15 mmol/L時(shí)，游離巰基和總巰基含量分別減少至(9.49±0.12)、(10.00±0.21) μmol/g，分別是對(duì)照組[(14.35±0.41)、(15.88±0.35) μmol/g]的66%和0.63%(P<0.05)，表明花生球蛋白的氧化程度逐漸增強(qiáng)，這與本課題組前期的結(jié)果相一致[2]。這可能是在H2O2的作用下，花生球蛋白中的巰基被氧化生成二硫鍵或進(jìn)一步氧化生成磺酸類等產(chǎn)物，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面的游離巰基和總巰基含量下降。

圖2 羥自由基氧化后花生球蛋白游離巰基和總巰基含量 變化情況Fig.2 Changes of free sulfhydryl groups and total sulfhydryl groups in arachin after hydroxyl radical oxidation 注：游離巰基含量用不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)， 總巰基含量用不同大寫字母表明顯著性差異(P<0.05)

2.3 羥自由基氧化對(duì)花生球蛋白紫外掃描光譜的影響

蛋白質(zhì)中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等氨基酸能吸收一定的波長(zhǎng)范圍的紫外光，因此蛋白質(zhì)的紫外光譜能直觀地反映出其結(jié)構(gòu)的變化情況[18]。HROS對(duì)可溶性花生球蛋白紫外掃描光譜的影響如圖3所示，未氧化的花生球蛋白最大吸收峰在287 nm處，隨著H2O2濃度的增加，吸收峰強(qiáng)度明顯減弱，當(dāng)H2O2的濃度達(dá)到15 mmol/L時(shí)，峰強(qiáng)度最低，說(shuō)明上清液中花生球蛋白的含量隨氧化程度加深而逐漸降低。花生球蛋白的λmax發(fā)生輕微藍(lán)移，表明分子表面可吸收紫外光的殘基減少，即花生球蛋白中部分可吸收紫外光的氨基酸基團(tuán)因氧化程度增大而引起結(jié)構(gòu)變化[19]。在280～287 nm處，氧化處理后花生蛋白的吸收峰強(qiáng)度出現(xiàn)了明顯的上升，這可能是因?yàn)檠趸鹆说鞍踪|(zhì)聚集，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了變化，從而使其紫外吸收光譜發(fā)生了改變[20]。

圖3 羥自由基氧化后花生球蛋白的紫外掃描圖譜Fig.3 Ultraviolet scanning atlases of arachin oxidized by hydroxyl radical

2.4 羥自由基氧化對(duì)花生球蛋白DSC曲線的影響

當(dāng)物質(zhì)所處的溫度環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，會(huì)導(dǎo)致物質(zhì)能量也隨之發(fā)生改變，其表現(xiàn)方式為吸熱或放熱，因此可通過(guò)觀測(cè)蛋白質(zhì)的熱能差異來(lái)反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化[21]。HROS修飾后的花生球蛋白的DSC掃描曲線如圖4所示，在不同H2O2濃度下花生球蛋白的放熱幅度有所差異，但其變化曲線規(guī)律基本一致。隨著H2O2濃度的提高，花生球蛋白放熱峰的溫度依次為74、72、70、75、70、72、73 ℃，與對(duì)照組(72 ℃)相比無(wú)明顯變化，表明羥自由基氧化對(duì)花生球蛋白的熱穩(wěn)定性影響較小，這和YAMAGUCHI等[22]報(bào)道的結(jié)果相一致。

圖4 羥自由基氧化后花生球蛋白的DSC曲線Fig.4 DSC curve of arachin after hydroxyl radical oxidation

2.5 羥自由基氧化對(duì)花生球蛋白圓二色譜的影響

在蛋白質(zhì)分子中，肽鏈的不同部分可分別形成α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等特定的立體結(jié)構(gòu)，這些立體結(jié)構(gòu)都是不對(duì)稱的，且蛋白質(zhì)的肽鍵在紫外185～240 nm處有光吸收，使其在這一波長(zhǎng)范圍內(nèi)有圓二色性[23]。因此，利用圓二色譜可以靈敏地檢測(cè)出蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲)的變化，其結(jié)果如表1所示。隨著H2O2濃度的增加，可溶性花生球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)明顯減少，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)明顯增加(P<0.05)，而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角變化不明顯(P>0.05)。結(jié)果表明經(jīng)羥自由基氧化處理后，可溶性花生球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋減少、無(wú)規(guī)則卷曲增加，其他結(jié)構(gòu)變化不明顯，這與DEL等[24]的研究結(jié)果相類似。同未氧化的花生球蛋白相比，當(dāng)H2O2濃度為15 mmol/L時(shí)，花生球蛋白α-螺旋減少6.25%、無(wú)規(guī)則卷曲增加10.25%，這也同樣說(shuō)明在H2O2氧化的過(guò)程中，可溶性花生球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生一定改變，其變化規(guī)律則與氧化的條件和程度有關(guān)。

表1 羥自由基氧化后花生球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化情況Table 1 Changes of secondary structure of arachin after hydroxyl radical oxidation

2.6 羥自由基氧化對(duì)花生球蛋白溶解度的影響

蛋白溶解度是蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與溶劑之間相互作用的結(jié)果，與其粒徑大小有一定的關(guān)系，可用于表征蛋白質(zhì)交聯(lián)及聚集的程度，同時(shí)也是蛋白質(zhì)具有其他功能性質(zhì)的必要條件[25]。HROS對(duì)花生球蛋白溶解度的影響如圖5所示，隨著H2O2濃度的增加，花生球蛋白溶解度呈下降趨勢(shì)，當(dāng)H2O2濃度為15 mmol/L時(shí)其溶解度減小至(50.98±0.14)%，顯著低于對(duì)照組的(68.50±0.36)%(P<0.05)。這可能是由于羥自由基破壞了花生球蛋白的構(gòu)象，并隨著羥自由基濃度的增大，花生球蛋白疏水基團(tuán)逐漸暴露，蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，使可溶性聚集體進(jìn)一步聚集形成不可溶性聚集體，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水化作用逐漸減弱，溶解度下降，這與WANG等[12]結(jié)果相一致。

圖5 羥自由基氧化對(duì)花生球蛋白溶解度的影響Fig.5 Effect of hydroxyl radical oxidation on the solubility of arachin

2.7 羥自由基氧化對(duì)花生球蛋白濁度的影響

濁度是指當(dāng)光線通過(guò)溶液時(shí)所產(chǎn)生的阻礙程度，可以反映出其溶解度的大小。本實(shí)驗(yàn)采用樣品在600 nm下的吸光值表示其濁度，結(jié)果如圖6所示。經(jīng)氧化后花生球蛋白的濁度均高于對(duì)照組，且隨著H2O2濃度的增大而遞增(P<0.05)。當(dāng)H2O2濃度為15 mmol/L時(shí)，花生球蛋白的吸光度達(dá)到0.20±0.001，其濁度是對(duì)照組(0.07±0.001)的2.86倍。該結(jié)果與JIANG等[13]結(jié)果相一致，原因是氧化使蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)而聚集，導(dǎo)致其溶解度下降，濁度上升。本論文中，濁度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與溶解度的現(xiàn)象相一致，進(jìn)一步說(shuō)明氧化會(huì)使蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，從而導(dǎo)致其溶解度降低。

圖6 羥自由基氧化對(duì)花生球蛋白濁度的影響Fig.6 Effect of hydroxyl radical oxidation on the turbidity of arachin

2.8 羥自由基氧化對(duì)花生球蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性的影響

蛋白質(zhì)的起泡性可以賦予食品疏松的結(jié)構(gòu)，使其具有良好的口感，其與蛋白中可溶性蛋白含量及其在溶液中的穩(wěn)定性相關(guān)[26]。HROS對(duì)花生球蛋白的起泡性和起泡穩(wěn)定性的影響如圖7所示，隨著H2O2濃度的增加，花生球蛋白起泡性呈先增加后下降的趨勢(shì)，起泡穩(wěn)定性呈逐漸上升的趨勢(shì)。原因是經(jīng)過(guò)羥自由基氧化后，蛋白分子部分展開，其內(nèi)部疏水殘基暴露在蛋白表面，使蛋白質(zhì)分子能迅速吸附至氣-水界面，進(jìn)而增強(qiáng)起泡性；隨著氧化程度的加深，巰基逐漸氧化形成二硫鍵而發(fā)生更大交聯(lián)，形成蛋白聚合物等不可溶的聚集體，使界面張力增加。同時(shí)溶解度的降低使其用來(lái)發(fā)泡的有效蛋白質(zhì)含量降低，故而起泡性減小[27]。起泡穩(wěn)定性隨H2O2濃度增加而逐漸上升，且當(dāng)H2O2濃度為15 mmol/L時(shí)(P<0.05)，起泡穩(wěn)定性最好[(27.44±0.11)%]，這可能是部分暴露的疏水性基團(tuán)發(fā)生相互吸引，使得泡沫穩(wěn)定性增強(qiáng)[14]。

圖7 羥自由基氧化對(duì)花生球蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性 的影響Fig.7 Effects of hydroxyl radical oxidation on the foaming and foaming stability of arachin 注：起泡性用不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)， 起泡穩(wěn)定性用不同大寫字母表明顯著性差異(P<0.05)

2.9 羥自由基氧化對(duì)花生球蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

乳化性質(zhì)是指蛋白質(zhì)與食品體系中的油和水形成乳狀液的能力，其是蛋白質(zhì)的一項(xiàng)重要的功能性質(zhì)，一般通過(guò)乳化性和乳化穩(wěn)定性來(lái)評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的乳化能力[28]。HROS對(duì)花生球蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響如圖8所示，隨H2O2濃度增大，花生球蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性均呈先增加后下降的趨勢(shì)。當(dāng)H2O2濃度為1 mmol/L時(shí)，乳化性最高為(79.2±0.62) m2/g；當(dāng)H2O2濃度為0.5 mmol/L時(shí)，乳化穩(wěn)定性最好為38 min(P<0.05)。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的乳化性能受其溶解度、粒徑、分子柔韌性等影響，當(dāng)?shù)蜐舛鹊腍2O2作用于花生球蛋白時(shí)，維持花生球蛋白空間結(jié)構(gòu)的非共價(jià)鍵(疏水相互作用、靜電相互作用)被破壞，蛋白分子內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，分子柔韌性提高，更多的蛋白分子結(jié)合到油-水界面，使花生球蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性增加[29]。繼續(xù)增大H2O2濃度，巰基逐漸被氧化形成二硫鍵，蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)形成不可溶性聚集體，使其溶解度下降、分子柔韌性降低、蛋白表面積縮小，導(dǎo)致花生球蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性下降。

圖8 羥自由基氧化對(duì)花生球蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effects of hydroxyl radical oxidation on the emulsification and emulsification stability of arachin 注：乳化性用不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)， 乳化穩(wěn)定性用不同大寫字母表明顯著性差異(P<0.05)

2.10 羥自由基氧化對(duì)花生球蛋白表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)的表面疏水性是維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力，可用于蛋白表面疏水性來(lái)衡量蛋白質(zhì)的變性程度，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的穩(wěn)定具有重要意義。HROS對(duì)可溶性花生球蛋白表面疏水性的影響如圖9所示，隨著H2O2濃度的增加，花生球蛋白的表面疏水性逐漸下降，且當(dāng)H2O2濃度為15 mmol/L時(shí)，疏水性最低為10±1，與對(duì)照組(112±3)相比減少了102(P<0.05)，這與RAMREZ等[15]的研究結(jié)果相似。在蛋白質(zhì)氧化過(guò)程中，HROS誘導(dǎo)蛋白質(zhì)內(nèi)部氨基酸殘基發(fā)生氧化，使蛋白質(zhì)去折疊而外露出疏水基團(tuán)，進(jìn)而通過(guò)疏水作用形成聚集體，隨著H2O2濃度的增大，其表面疏水性逐漸減小，這可能是由于花生球蛋白形成聚集體所致[30]。

圖9 羥自由基氧化對(duì)花生球蛋白表面疏水性的影響Fig.9 The effect of hydroxyl radical oxidation on surface hydrophobicity of arachin

3 結(jié)論

本研究以羥自由基氧化體系建立氧化模型，對(duì)花生球蛋白進(jìn)行不同程度的氧化處理，并考察羥自由基氧化體系對(duì)花生球蛋白結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)變化的影響。結(jié)果表明，羥自由基氧化對(duì)花生球蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)都會(huì)產(chǎn)生一定的影響，在一定范圍內(nèi)隨著H2O2濃度的增加，花生球蛋白的羰基含量、濁度、起泡穩(wěn)定性呈上升的趨勢(shì)；游離巰基、總巰基、溶解度、紫外吸收峰強(qiáng)度和表面疏水性呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)；乳化性、乳化穩(wěn)定性和起泡性呈先上升后下降的趨勢(shì)；而HROS對(duì)可溶性花生球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲也造成一定的影響。結(jié)果說(shuō)明氧化使花生球蛋白的結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)發(fā)生了一定的變化。因此，可在貯藏加工過(guò)程中采取有效措施來(lái)控制花生的氧化程度，減少過(guò)度氧化引起的花生品質(zhì)的劣變，也可以通過(guò)適度氧化以改善其加工性質(zhì)。本研究可以為花生資源的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供一定科學(xué)依據(jù)。