何慶，鄭素慧，秦南南，劉雪艷，關(guān)軍鋒，吳斌*，于永春

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052)2(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，新疆 烏魯木齊，830091) 3(河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，河北 石家莊，050051)4(特克斯縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，新疆 伊犁哈薩克自治州，835500)

紅地球葡萄因果粒較大，果肉硬脆，營養(yǎng)豐富等優(yōu)點，是市場最受歡迎的鮮食葡萄品種之一。采后葡萄會由于某些生理代謝的影響而迅速衰老,易出現(xiàn)軟化、果粒碎裂和果梗失水、褐變等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響葡萄的貨架品質(zhì)[1-2]。果實軟化是評價果實銷售商品性的重要指標(biāo)之一，果實軟化導(dǎo)致果實易受病原菌侵染，降低貨架品質(zhì)，縮短貯藏期及貨架期。果實的軟化與細(xì)胞壁成分和細(xì)胞壁降解酶[多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase, PG)、果膠甲酯酶(pectin methylesterase, PME)、纖維素酶(cellulase, Cx)和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, β-Gal)]活性密切相關(guān)[3-4]，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的變化是果實軟化的主要原因[5]。細(xì)胞壁水解酶活性和微生物侵染使原果膠逐漸轉(zhuǎn)化為果膠，從而使其硬度降低[6]。果實軟化導(dǎo)致對病原菌的敏感性增加，果實細(xì)胞壁降解酶的敏感性增加[7]，果實軟化也是消費者一直關(guān)注的問題。

水楊酸(salicylic acid，SA)是一種內(nèi)源性信號分子[8]，近年來研究表明，外源SA可以延緩芒果[9-10]、小白杏[11]和獼猴桃[12]硬度下降，但關(guān)于采前SA是否可以調(diào)節(jié)葡萄細(xì)胞壁代謝延緩果實軟化系統(tǒng)的報道較少，目前尚不清楚。

本文分析采前噴施SA對紅地球葡萄細(xì)胞壁代謝的影響，探討采前噴施SA處理延緩葡萄果實軟化的作用機理，為SA在葡萄采后果實軟化調(diào)控、延長貨架期和保鮮中的應(yīng)用提供理論及技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅地球葡萄采自昌吉三工鎮(zhèn)葡萄種植園，采收后即運回新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院冷庫。在0 ℃預(yù)冷12 h后在(22±1) ℃條件下貯藏，選擇大小均勻、色澤相近、果形端正、無機械損傷和無病蟲害的果實作為實驗材料。

SA(≥99.50%，分析純)，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(DP411),天根生化科技(北京)有限公司；Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB?Premix Ex TaqTMII試劑盒，TaKaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600紫外可見分光光度計，天津森羅有限公司；核酸電泳儀，北京市六一儀器廠；PCR儀，德國耶拿分析儀器公司；核酸蛋白測定儀，德國Eppendorf公司；LightCycler?96實時定量熒光PCR儀，Roche公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 采前處理

選擇長勢一致、光照良好的葡萄果穗，基于前期試驗結(jié)果[13]，分別于2019年7月下旬(膨大期)、8月下旬(轉(zhuǎn)色期)和9月中旬預(yù)收期(采收前2 d)對葡萄果穗進行噴施SA處理，濃度為1.0 mmol/L SA(含體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-80)，噴施相同體積的蒸餾水作CK組。每次處理需均勻噴施果面數(shù)次，每串果穗噴施藥液約為200 mL，自然晾干，每個處理200串。采收預(yù)冷后于(22±1) ℃貯藏，4～5 串/筐，每天測定相關(guān)品質(zhì)指標(biāo)。

1.3.2 品質(zhì)指標(biāo)測定

硬度測定每個處理隨機取3筐，每筐10個果實，使用GY-4型果實硬度計在果實赤道部位進行測定，探頭直徑為3 mm，刺入深度為10 mm，重復(fù)3次。按照公式(1)、(2)分別計算腐爛率和失重率：

(1)

(2)

每天隨機取15串果實進行分級。分為5級，果梗沒有褐變?yōu)?級，果梗褐變面積不超過總面積的1/4為1級，果梗褐變面積占總面積的1/4～1/2為2級，果梗褐變面積占總面積的1/2～3/4為3級，果梗變面積超過3/4為4級。按照公式(3)計算果梗褐變指數(shù)：

(3)

1.3.3 原果膠(protopectin,PP)、水溶性果膠(water soluble pectin,WSP)和纖維素含量測定

PP和WSP的含量參照GE等[4]的方法測定，樣品溶液在530 nm處測定吸光度，以純化的半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品。纖維素含量參考BU等[14]方法測定，樣品溶液在620 nm處測定吸光度，使用純化纖維素標(biāo)準(zhǔn)曲線計算PP、WSP含量和纖維素含量。

1.3.4 細(xì)胞壁代謝相關(guān)酶活性測定

PME活性的測定采用GE等[15]的方法，稍作修改。反應(yīng)混合物由0.5 mL酶液、0.5 mL 10 g/L果膠和1.0 mL醋酸緩沖液(50 mmol/L, pH 5.5)組成，37 ℃ 水浴1 h后，加入1.5 mL 3, 5-二硝基水楊酸終止反應(yīng)，沸水浴5 min。在540 nm測定吸光度。PME活性用U表示，其中1 U定義為1 h 1 g鮮重(FW)催化生成1 μg半乳糖醛酸的量，PME活性表示為U/g。

PG活性參考GE等[4]的方法測定，以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)，在540 nm測定吸光度。一個酶活性單位U定義為1 g鮮重1 h釋放1 mg半乳糖醛酸所需的酶量，PG活性表示為U/g。

Cx采用GE等[4]的方法測定。反應(yīng)混合物由酶液0.5 mL和1.5 mL 10 mg/mL羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose, CMC)組成。37 ℃水浴1 h后，加入1.5 mL 3, 5-二硝基水楊酸終止反應(yīng)，沸水浴5 min。540 nm處測定吸光度。纖維素酶活性以U/g表示，其中1 U表示1 h 1 g FW催化生產(chǎn)1 mg還原糖的能力。

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,β-Glu)活性參考GE等[4]的方法測定，β-Glu活性用U表示，其中1 U表示1 h 1 g FW生產(chǎn)1 mg葡萄糖的能力，β-Glu活性表示為U/g。

β-Gal活性參考GE等[15]的方法測定。β-Gal的反應(yīng)混合物包括0.5 mL 0.1 mol/L乙酸鈉(pH 5.2)，0.5 mL 3 mmol/L對硝苯基-β-D-吡喃半乳糖苷和0.5 mL酶液。37 ℃水浴30 min后，加入2.0 mL 0.5 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)。400 nm處測定吸光度。β-Gal活性單位表示為U/g。

1.4 熒光定量PCR檢測果實軟化相關(guān)基因PME、PG、β-glu和β-Gal相對表達量

(1)葡萄果肉或果皮組織總RNA的提取

取葡萄果肉或果皮液氮研磨，按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根DP411)說明書提取總RNA。提取的RNA經(jīng)Biospectrometer(Eppendorf,德國)測定OD值以及電泳檢測合格后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)cDNA合成

參照PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。反應(yīng)體系及反應(yīng)程序按照鄭素慧等[16]的方法進行。

(3)mRNA定量分析

VvPME、VvPE、VvPG、Vvβ-Glu和Vvβ-Gal和VvActin基因定量引物采用DNAman 6.0根據(jù)國際生物技術(shù)信息中心檢索數(shù)據(jù)庫(NCBI)中已經(jīng)登陸的VvPME(AY043232.1)、VvPG(XM_003632610.3)、Vvβ-Glu(NM_001281232.1)、Vvβ-Gal(XM_002282096.3)和VvActin(XM_002279636.3)氨基酸保守序列設(shè)計引物，并將設(shè)計好的引物通過Oligo 6.0軟件進行檢測，避免引物錯配，二聚體，發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。再送上海生工公司進行合成。熒光定量qPCR參照TB Green?Premix Ex TaqTMII試劑盒說明書進行，每個處理設(shè)3次重復(fù)，以VvActin基因作為內(nèi)參，采用ABI7500分析軟件中2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量。熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按照程玉豆等[17]的方法進行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Sigma Plot 12.5軟件作圖，SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)方差分析(ANOVA)并利用Duncan法進行均值比較。*表示P<0.05差異顯著，**表示P<0.01差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 采前噴施SA對紅地球葡萄硬度的影響

如圖1所示，在0～7 d葡萄果實的硬度呈下降趨勢。0 d時1.0 mmol/L 采前噴施SA處理組硬度為14.86 N，CK組為12.50 N，采前噴施SA處理組硬度是CK組的1.19倍(P<0.01)，7 d時采前噴施SA處理組硬度為12.94 N，CK組為10.05 N，采前噴施SA處理組硬度是CK組的1.29倍(P<0.01)。在0～7 d SA處理組與CK組存在顯著性差異。說明采前噴施SA處理能夠提高果實硬度(0 d)，延緩果實采后硬度下降，維持果實的品質(zhì)。

圖1 采前噴施SA處理對紅地球葡萄硬度的影響Fig.1 Effect of pre-harvest spraying SA treatment on firmness of red globe grape 注：*表示同一貯藏時間2組間差異顯著(P<0.05)， **表示同一貯藏時間2組間差異極顯著(P<0.01)(下同)

2.2 采前噴施SA對紅地球葡萄失重率、腐爛率和果梗褐變指數(shù)的影響

如圖2-a所示，在貯藏期間，葡萄的失重率呈上升趨勢。5 d時CK組0.591%，采前噴施SA處理組為0.367%，CK組失重率是采前噴施SA組的1.61倍。6 d時CK組0.91%，采前噴施SA處理組為0.51%，CK組失重率是的采前噴施SA處理組1.787倍，采前噴施SA處理組與CK組0～2 d無顯著性差異，3～7 d存在顯著性差異(P<0.05)，說明采前噴施SA處理能夠延緩果實失重率的上升。

如圖2-b所示，在貯藏期間，果實的腐爛率呈上升趨勢。CK組2 d開始出現(xiàn)腐爛，SA處理組5 d開始發(fā)生腐爛，采前噴施SA處理組的腐爛率低于CK組，7 d時CK組腐爛率15.53%，采前噴施SA處理腐爛率2.20%，CK組腐爛率是采前噴施SA處理組的7.06倍，在0～7 d存在顯著性差異(P<0.01)，說明采前噴施SA處理前期可以延緩果實腐爛的發(fā)生，后期可以抑制腐爛率的上升。

如圖2-c所示，在貯藏期間，果梗褐變指數(shù)呈上升趨勢。7 d時CK組果梗褐變指數(shù)達到86.00%，采前噴施SA處理組的果梗褐變指數(shù)為57.33%，CK組是SA處理組的1.50倍，采前噴施SA處理組的果梗褐變指數(shù)低于CK組，5～7 d存在顯著性差異(P<0.05)，說明采前噴施SA處理可以延緩果梗的褐變。

研究結(jié)果與弓德強等[10]的研究結(jié)果一致。SA處理可以延緩果實貯藏期間品質(zhì)下降，延長果實的貨架期。

a-失重率；b-腐爛率；c-果梗褐變指數(shù)圖2 采前噴施SA處理對紅地球葡萄失重率、 腐爛率和果梗褐變的影響Fig.2 Effects of preharvest spraying SA treatment on weight loss rate, decay rate and browning index of fruit stem of red globe grape

2.3 采前噴施SA處理對紅地球葡萄PP、WSP和纖維素含量的影響

PP含量在0～7 d呈下降趨勢(圖3-a)，采前SA處理組PP含量高于CK組(P<0.05)，0 d時SA處理組PP含量是CK組的1.25倍，7 d時SA處理組PP含量是CK組的1.37倍。說明采前噴施SA可以促進葡萄果實PP的合成，在采后貯藏過程中可以延緩PP含量下降。

WSP含量在0～7 d呈上升趨勢(圖3-b)，采前SA處理組WSP含量低于CK組(P<0.05)，4 d時CK組WSP含量是SA處理組的2.16倍，7 d時CK組WSP含量是SA處理組的1.87倍，說明采前噴施SA可以延緩WSP含量上升。

纖維素含量在0～7 d呈下降趨勢(圖3-c)，采前SA處理組纖維素含量高于CK組(P<0.05)，2 d時SA處理組纖維素含量是CK組的1.42倍，5 d時SA處理組纖維素含量是CK組的1.39倍，說明采前噴施SA可以提高葡萄果實纖維素的合成，在采后可以延緩纖維素降解。

通過相關(guān)性分析(表1)，硬度與PP(CK:r2=0.906，SA:r2=0.926)和纖維素含量(r2=0.902，r2=0.923)呈顯著呈正相關(guān)(P<0.01)，與WSP含量(r2=-0.807，r2=-0.850)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。PP、WSP和纖維素含量與葡萄果實硬度密切相關(guān)，說明SA處理可以通過延緩PP和纖維素含量的下降、WSP含量的上升，延緩葡萄果實硬度的下降。

a-PP含量；b-WSP含量；c-纖維素含量圖3 采前噴施SA處理對紅地球葡萄PP、WSP和纖維素含量的影響Fig.3 Effects of pre-harvest spraying SA treatment on PP、 WSP and cellulose content of red globe grape

2.4 采前噴施SA對紅地球葡萄PG活性及基因表達量的影響

果實PG活性呈先上升后下降趨勢(圖4)，在貯藏期間，采前SA處理組PG活性低于CK組(P<0.05)，2 d時CK組PG活性是SA處理組的2.14倍，6 d時CK組PG活性是SA處理組的1.71倍，通過相關(guān)性分析(表1)，PG活性與硬度呈顯著負(fù)相關(guān)(r2=-0.572，r2=-0.866)。VvPG基因相對表達量總體呈先上升再下降的趨勢(圖4)，5 d時CK組VvPG基因大量表達，是SA組的4.19倍(P<0.01)，1～2 d和4～7 d SA組VvPG基因表達量低于CK組(P<0.05),說明采前噴施SA可以延緩PG活性上升，抑制VvPG基因表達，與ALRASHDI等[18]研究結(jié)果一致。

a-PG活性；b-VvPG基因相對表達量圖4 采前噴施SA處理對紅提葡萄PG活性及基因 表達量的影響Fig.4 Effect of preharvest spraying SA treatment on PG activity and gene expression of red grape

2.5 采前噴施SA對紅地球葡萄PME活性及基因表達量的影響

PME在決定果膠含量中起重要作用[19]。PME活性在0～7 d呈先上升后下降的趨勢(圖5)，采前SA處理組PME活性低于CK組(P<0.05)，2 d時CK組PME活性是SA處理組的1.7倍，5 d時CK組VvPME活性是SA處理組的1.56倍。說明采前噴施SA可以延緩PME活性上升。

VvPME基因相對表達趨勢與PME活性變化趨勢相近(圖5)，總體呈先上升后下降的趨勢，5 d時CK組VvPME基因大量表達，是SA組的4.61倍(P<0.01)，2～7 d CK組VvPME基因相對表達量快速上升，顯著高于SA組(P<0.05)。通過相關(guān)性分析(表1)，PME活性與PP含量呈顯著負(fù)相關(guān)(r2=-0.924，r2=-0.885)，與WSP含量呈顯著正相關(guān)(r2=0.765，r2=0.870)，PG活性與PME活性呈顯著正相關(guān)(r2=0.856，r2=0.973)，說明PG與PME在果實軟化過程中存在協(xié)同作用。

a-PME活性；b-VvPG基因相對表達量圖5 采前噴施SA處理對紅地球葡萄PME活性及基因 表達量的影響Fig.5 Effect of preharvest spraying SA treatment on PME activity and gene expression of red globe grape

2.6 采前噴施SA對紅地球葡萄β-Glu活性及基因相對表達量的影響

β-Glu活性呈先上升后下降趨勢(圖6)，在0～7 d CK組β-Glu活性高于SA處理組(P<0.05)，4 d時CK組β-Glu活性是SA處理組的1.17倍，7 d時CK組β-Glu活性是SA處理組的1.14倍。

Vvβ-Glu基因相對表達量呈下降趨勢(圖6)，0～7 d SA組Vvβ-Glu基因相對表達量低于CK組，0～7 d SA組Vvβ-Glu基因相對表達量與CK組存在顯著性差異(P<0.05)。說明采前噴施SA處理可以抑制Vvβ-Glu基因表達，延緩β-Glu活性上升。通過相關(guān)性分析(表1)，β-Glu 活性與PP和纖維素含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與WSP含量呈顯著正相關(guān)，說明采前噴施SA可以通過延緩β-Glu 活性上升，進一步延緩PP和纖維素降解。

圖6 采前噴施SA處理對紅地球葡萄β-Glu 活性及基因表達量的影響Fig.6 Effect of preharvest spraying SA treatment on β-Glu activity and gene expression of red globe grape

2.7 采前噴施SA對紅地球葡萄β-Gal活性及基因相對表達量的影響

β-Gal活性呈先上升后下降趨勢(圖7)，在貯藏期間，CK組β-Gal活性高于SA處理組，0～5 d差異顯著(P<0.05)，0 d時CK組β-Gal活性是SA處理組的1.24倍，4 d時CK組β-Gal活性是SA處理組的1.36倍。Vvβ-Gal基因相對表達量變化趨勢與β-Gal活性變化趨勢相近，總體呈先上升后下降趨勢(圖7)，貯藏期間SA組Vvβ-Gal基因表達量低于CK組。1、6和7 d CK組極顯著高于SA組(P<0.01)，CK組Vvβ-Gal基因相對表達量是SA組的3～4倍。通過相關(guān)性分析(表1)，β-Gal活性與果實硬度呈顯著負(fù)相關(guān)。說明采前噴施SA可以通過抑制Vvβ-Gal基因表達，延緩β-Gal活性上升，硬度下降。

圖7 采前噴施SA處理對紅地球葡萄β-Gal 活性及基因表達量的影響Fig.7 Effect of preharvest spraying SA treatment on β-Gal activity and gene expression of red globe grape

2.8 采前噴施SA對紅地球葡萄Cx活性的影響

Cx活性變化趨勢與PG酶活性變化趨勢相近(圖8)，在0～6 d Cx活性呈上升趨勢，6～7 d呈下降趨勢。2～7 d CK組Cx活性顯著高于SA處理組(P<0.05)，3 d時CK組Cx活性是SA處理組的1.75倍。說明采前噴施SA可以延緩Cx活性上升。Cx活性升高的同時纖維素含量下降，通過相關(guān)性分析(表1)，Cx活性與纖維素含量呈顯著負(fù)相關(guān)(r2=-0.967，r2=-0.955)。說明采前噴施SA可以通過延緩Cx活性升高來延緩纖維素分解。

圖9 采前噴施SA處理對紅地球葡萄Cx活性的影響Fig.9 Effect of preharvest spraying SA treatment on Cx activity of red globe grape

表1 紅地球葡萄硬度與細(xì)胞壁成分及細(xì)胞壁代謝相關(guān)酶活性之間的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of red globe grape firmness with cell wall components and cell wall metabolism-related enzyme activities

3 討論

SA能延緩多種園藝產(chǎn)品的采后成熟衰老進程，延長果實的貨架壽命，在果實貯藏保鮮中具有較好的應(yīng)用前景[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)采前噴施1.0 mmol/L SA可以延緩紅提葡萄果實硬度下降。這可能是因為大分子物質(zhì)逐步分解成分子質(zhì)量較小的物質(zhì)，使得分子間的空隙加大，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致的。研究發(fā)現(xiàn)采前噴施1.0 mmol/L SA處理對紅提葡萄的腐爛、失重率和果梗褐變指數(shù)有明顯的抑制作用，與前人使用SA在芒果[10]和小白杏[11]中的研究結(jié)果一致。

果實軟化主要是果膠質(zhì)、纖維素在細(xì)胞壁相關(guān)酶作用下降解導(dǎo)致果實硬度下降[22]。果膠、纖維素含量決定了采后果實的質(zhì)地，在PME、β-Gal、PG和Cx等細(xì)胞壁代謝酶作用下會使細(xì)胞壁物質(zhì)發(fā)生降解，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體，導(dǎo)致果實軟化。果實軟化過程中，PP在細(xì)胞壁水解酶的作用下逐漸降解為WSP和果膠酸，由水不溶性向可溶性轉(zhuǎn)變，伴隨PP和纖維素的降解導(dǎo)致果實硬度下降[23]。研究發(fā)現(xiàn)采前噴施SA可以延緩PP和纖維素含量下降，WSP含量上升。

PG參與果膠的降解，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體，導(dǎo)致果實軟化，β-Glu主要是改變果膠分子相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞壁的完整性下降[24]。研究發(fā)現(xiàn)，采前噴施SA處理可以抑制VvPG、VvPME、Vvβ-Glu和Vvβ-Gal基因表達，采前噴施SA處理組基因表達量低于CK組。延緩PG、PME、Cx、β-Glu和β-Gal活性上升，采前噴施SA處理組PG、PME、Cx、β-Glu和β-Gal活性低于CK組。說明細(xì)胞壁代謝關(guān)鍵酶活性和基因表達受到SA的影響。細(xì)胞壁代謝關(guān)鍵酶活性上升會加速細(xì)胞壁物質(zhì)的降解，導(dǎo)致果實中WSP含量上升，PP和纖維素含量下降，而采前SA處理抑制了細(xì)胞壁代謝關(guān)鍵酶活性，延緩WSP含量的上升和PP、纖維素含量的下降，達到延緩葡萄果實硬度下降，維持葡萄采后貯藏品質(zhì)，延長貨架期。與GE等[4, 15]在棗和蘋果研究結(jié)果，通過抑制PG、PME、Cx和β-Gal等酶活性減緩果實硬度下降的結(jié)果一致。

綜上分析表明，采前噴施SA可以影響細(xì)胞壁代謝，抑制細(xì)胞壁代謝基因表達，延緩細(xì)胞壁代謝相關(guān)酶活性上升，延緩紅地球葡萄果實細(xì)胞壁物質(zhì)的降解，從而延緩采后葡萄果實的軟化。

4 結(jié)論

采前噴施SA可通過抑制葡萄果實中VvPG、VvPME、Vvβ-Glu和Vvβ-Gal基因的表達，延緩PG、PME、Cx、β-Glu、β-Gal活性和WSP含量上升，PP和纖維素降解，達到有效延緩葡萄果實硬度下降的效果，減少葡萄采后軟化和腐爛等問題造成的經(jīng)濟損失，提高了葡萄果實采后食用安全性。