程爽，臧晉，王崎錁，楊浩文，鄧洲

(1.河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術重點實驗室，河南 南陽 473004；2.南陽理工學院 生物與化學工程學院，河南 南陽 473004)

酸菜是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，因其口味酸爽、營養(yǎng)豐富、增進食欲等特點被人們所喜愛。由于各地原料、制作方法、發(fā)酵菌種、發(fā)酵時間等存在較大差異，造成了酸菜的口味風格各異。目前我國酸菜的研究主要以東北酸菜[1-3]、四川泡菜[4-6]為主，研究人員針對酸菜的微生物多樣性、優(yōu)良發(fā)酵菌種選育、加工工藝、品質控制等方面展開了較深入細致的研究。李欣蔚等[7]利用高通量測序技術對來自東北16個地區(qū)的自然發(fā)酵酸菜樣品中細菌多樣性進行了分析，結果表明乳酸桿菌屬(Lactobacillus)是東北自然發(fā)酵酸菜中的優(yōu)勢菌屬，來源于松原和大慶的樣品中細菌多樣性較為豐富。馬長路等[8]從自然發(fā)酵東北酸菜中分離到10株乳酸菌，并對其降解膽固醇能力進行了研究，其中植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)MHS1701的膽固醇降解能力為41%，可耐受11.95%的膽鹽，具有一定的應用價值。李恒等[9]對不同發(fā)酵階段的傳統(tǒng)四川泡菜母水中微生物群落進行了分析，結果表明發(fā)酵前期主要優(yōu)勢細菌的多樣性較好，Lactobacillus在整個發(fā)酵周期均為優(yōu)勢種群。毛丙永等[10]對8份四川老鹵泡菜的pH值、總酸、總糖、NaCl濃度、總氮等理化指標進行了測定，并通過GC-MS對其中的揮發(fā)性和非揮發(fā)性成分進行了分析，結果表明老鹵泡菜的主要揮發(fā)性成分是烷烴和酯類等具有水果香味的物質；利用純培養(yǎng)方式從中分離得到36株菌，其中植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)為優(yōu)勢菌株(占分離菌株的88.8%)。

河南省淅川縣是南水北調中線工程的水源地和渠首所在地，當?shù)鼐用駳v來有制作食用酸菜的傳統(tǒng)。淅川酸菜多以雪里紅(俗稱剌菜)、蘿卜纓、紅薯葉等為主要原料，經(jīng)過清洗、漂燙、發(fā)酵等工序制作而成，成品色澤黃亮，酸湯黏稠，爽口宜人。目前對淅川酸菜的研究鮮有報道，嚴重制約了淅川酸菜的標準化工業(yè)化生產(chǎn)。因此，本文以傳統(tǒng)自然發(fā)酵淅川酸菜為研究對象，擬從中篩選出用于酸菜發(fā)酵的優(yōu)良菌種，并對其生長及益生特性進行研究，從而為篩選出適宜淅川酸菜的微生物接種劑提供了技術資料。

1 材料與方法

1.1 材料

酸菜：從淅川農(nóng)戶家庭采集到5份自然發(fā)酵酸菜，將酸菜及其汁液置于無菌采樣袋中，于4 ℃保溫冰盒中帶回實驗室冰箱備用。

1.2 主要試劑與儀器

蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉等(均為生物純)：北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖、Na2HPO4·7H2O、KH2PO4等(均為分析純)：天津科密歐化學試劑有限公司；人工腸液、人工胃液：福州飛凈生物科技有限公司；乳酸菌生理生化鑒定試劑盒:廣州環(huán)凱科技有限公司；柱式細菌DNA基因組提取試劑盒、PCR及電泳所用試劑：均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

無菌針式過濾器 美國密理博公司；DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設備有限公司；SHA-C水浴振蕩器 常州國華電器有限公司；5804R高速冷凍離心機 德國艾本德公司；LDZX-50KBS高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；CX32三目光學顯微鏡 奧林巴斯公司；Biodrop超微量紫外可見分光光度計；Biometra T-Professional Standard PCR儀；DYY-7C電泳儀、DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳槽 北京六一生物科技有限公司；JY04S-3E凝膠成像分析儀 北京君意東方電泳設備有限公司；TU-1901紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 培養(yǎng)基

MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、檸檬酸氫二銨2.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、吐溫80 1.0 mL、乙酸鈉5.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.25 g/L、瓊脂15 g/L、蒸餾水1000 mL、pH 6.2～6.6(在初篩時加入2%的碳酸鈣用來觀察溶鈣圈)。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、檸檬酸氫二銨2.0 g/L、葡萄糖 20.0 g/L、吐溫80 1.0 mL、乙酸鈉5.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.25 g/L、蒸餾水1000 mL、pH 6.2～6.6。

1.4 方法

1.4.1 樣品處理

將采集到的酸菜汁液用0.22 μm無菌針式過濾器進行過濾，用于富集酸菜汁液中的微生物，過濾20 mL后，在無菌條件下將濾膜取出置于含有無菌生理鹽水的三角瓶中，于37 ℃，150 r/min恒溫振蕩器中振蕩1 h，使濾膜上附著的微生物洗脫分散至無菌水中，即為菌懸液。

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料以頻數(shù)及百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4.2 菌株分離純化

將菌懸液用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，得到10-1～10-5CFU/mL不同濃度梯度的稀釋液，然后分別采用傾注法和涂布法對乳酸菌進行分離；觀察傾注和涂布后的平板，篩選出四周有溶鈣圈的菌株，初步認定為乳酸菌，通過觀察菌株的菌落形態(tài)、顏色、凸起程度、濕潤狀態(tài)等特征初步選出形態(tài)有所差異的乳酸菌菌株。觀察稀釋涂布后的平板，挑選顏色、菌落大小不同且有溶鈣環(huán)的菌株在MRS培養(yǎng)基上進行劃線純化，直至菌落單一后對菌株進行編號并斜面保藏于4 ℃冰箱中備用。對分離純化后的菌株進行革蘭氏染色并在光學顯微鏡下觀察其顯微形態(tài)。

1.4.3 菌株分子生物學鑒定

利用生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取分離菌株基因組DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的DNA質量。若檢測合格，以提取基因DNA為模板擴增分離菌株的16S rDNA。擴增引物為27F:5′-AGAGTTTG-ATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGT-TACGACTT-3′。將PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果登錄NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，利用BLAST軟件進行比對。

1.4.4 生理生化鑒定

利用廣州環(huán)凱科技有限公司的乳桿菌生化鑒定試劑盒進行所分離乳酸菌的生理生化鑒定。

1.4.5 生長曲線及產(chǎn)酸量測定

1.4.6 人工胃液耐受能力檢測

將活化后長至對數(shù)期的菌株用無菌生理鹽水于12000 r/min，1 min洗滌3次，并用無菌生理鹽水調整至105CFU/mL，各取0.2 mL菌懸液加入1 mL 人工胃液中，于37 ℃溫育4 h后取0.1 mL混合液涂布MRS固體培養(yǎng)基平板，每個樣品涂布3個平板，同時涂布未處理的對應菌株作為對照，37 ℃培養(yǎng)48 h后計算其存活率。

1.4.7 不同膽鹽濃度人工腸液耐受能力檢測

以購買的人工腸液為溶劑，分別配制膽鹽濃度為0.5，1，3，5 g/mL的人工腸液。將活化后長至對數(shù)期的菌株用無菌生理鹽水于12000 r/min，1 min洗滌3次，并用無菌生理鹽水調整至105CFU/mL，各取0.2 mL菌懸液分別加至以上不同濃度的1 mL人工腸液中，于37 ℃溫育4 h后取0.1 mL混合液涂布MRS固體培養(yǎng)基平板，每個樣品涂布3個平板，同時涂布未處理的對應菌株作為對照，37 ℃培養(yǎng)48 h后計算其存活率。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

從5個不同采集地點的酸菜樣品中共分離到32株菌，對這32株菌分別進行接觸酶試驗、革蘭氏染色和形態(tài)學觀察后進行去重復，選取其中革蘭氏染色均為陽性、接觸酶陰性反應和形態(tài)學差異較大的6株菌作為后續(xù)研究對象。6株菌的平板菌落形態(tài)及顯微形態(tài)見表1和圖1。

表1 分離菌株的形態(tài)學特征Table 1 The morphological characteristics of isolated strains

圖1 分離菌株的形態(tài)學特征Fig.1 The morphological characteristics of isolated strains

2.2 分離乳酸菌的分子生物學鑒定

對分離到的6株菌進行16S rDNA基因的擴增，將其擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結果見圖2。

圖2 分離菌株的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 The electrophoretic diagram of 16S rDNA PCR amplification products of isolated strains

由圖2可知，分離菌株的目的基因擴增條帶單一，無非特異性擴增，與預期大小一致，可進行測序。將分離菌株的16S rDNA測序結果在NCBI網(wǎng)站上進行序列比對，菌株XC-2為副布氏乳桿菌(Lactobacillusparabuchneri)，XC-3為哈爾濱乳桿菌(Lactobacillusharbinensis)，XC-5為短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)，XC-6為副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)，XC-18為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，XC-20為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)。

分離菌株的16S rDNA序列測序比對結果見表2。

表2 分離菌株的16S rDNA序列測序比對結果Table 2 The sequencing comparison results of 16S rDNA sequences of isolated strains

2.3 分離乳酸菌的生理生化鑒定

利用廣州環(huán)凱科技有限公司的乳酸菌生理生化試劑盒對XC-2、XC-3、XC-5、XC-6、XC-18和XC-20進行生理生化指標檢測，結果見表3。

表3 分離菌株的生理生化鑒定結果Table 3 The results of physiological and biochemical identification of isolated strains

續(xù) 表

由表3可知，除菌株XC-20不能水解七葉苷外，其他5株菌均可水解七葉苷；菌株XC-2、XC-5、XC-18可利用纖維二糖；菌株XC-2、XC-3、XC-5、XC-18可利用麥芽糖；菌株XC-6和XC-20可利用甘露醇；菌株XC-2、XC-3、XC-5、XC-20可利用水楊苷；6株菌均不能代謝山梨醇；除XC-20外，其他5株菌均可利用蔗糖；菌株XC-2和XC-6可利用棉子糖；菌株XC-2、XC-3、XC-5、XC-18可利用菊糖；菌株XC-2、XC-5和XC-6可利用乳糖。

2.4 分離菌株的生長曲線及產(chǎn)酸變化

分離菌株在37 ℃下均生長良好，生長趨勢見圖3。

圖3 分離菌株的生長曲線Fig.3 The growth curves of isolated strains

由圖3可知，XC-2和XC-3在42 h時已進入穩(wěn)定期，菌株XC-20在56 h進入穩(wěn)定期，XC-5、XC-6和XC-18的生長趨勢較一致。

圖4 分離菌株的產(chǎn)酸曲線Fig.4 The acid-producing curves of isolated strains

由圖4可知，6株菌的產(chǎn)酸趨勢基本一致，隨著發(fā)酵周期的延長持續(xù)產(chǎn)酸，到44 h時產(chǎn)酸趨于平穩(wěn)。

2.5 分離菌株的人工胃液耐受能力

人體正常胃液的pH在0.9～1.5之間波動，主要成分有HCl、胃蛋白酶原、脂肪酶、黏蛋白等[11]。胃液中的胃酸能夠抑制和殺死大部分進入胃部的細菌，乳酸菌是否能夠耐受胃液的強酸環(huán)境以及抵御其中酶類對其的消化是衡量其是否具備能夠在腸道存活的重要指標，分離菌株的人工胃液耐受能力結果見圖5。

圖5 分離菌株的人工胃液耐受性Fig.5 The tolerance to artificial gastric fluid of isolated strains

由圖5可知，分離到的6株菌均對人工胃液有一定的耐受能力，其中XC-18在37 ℃下經(jīng)人工胃液處理4 h后仍有70%以上的存活率，說明該菌株對人工胃液有較強的耐受性。

2.6 分離菌株的耐膽鹽能力

乳酸菌是否能在人體腸道內(nèi)定殖并發(fā)揮其益生功能，除了要對胃液具有一定耐受能力外，對膽鹽的耐受能力也是重要的考察因素之一。人體腸道內(nèi)的膽鹽濃度一般為0.3%～0.5%，本文中選取0.5，1，3，5 mg/L 4個濃度梯度考察分離菌株對膽鹽的耐受性，結果見圖6。

圖6 分離菌株的人工腸液耐受性Fig.6 The tolerance to artificial intestinal fluid of isolated strains

由圖6可知，分離到的菌株在膽鹽濃度為0.5 mg/L時均有50%以上的存活率，隨著膽鹽濃度的增加，存活率有不同程度的下降，其中菌株XC-18對膽鹽的耐受能力最強，當膽鹽濃度為0.5 mg/L時，存活率可達90%，當膽鹽濃度升高至5 mg/L時，存活率仍然可達到60%以上。

3 結論

利用MRS培養(yǎng)基從淅川自然發(fā)酵酸菜中分離到6株乳酸菌，分別對其進行形態(tài)學、生理生化和分子生物學鑒定，并對其生長曲線、產(chǎn)酸能力、人工胃液和人工腸液耐受性進行了研究。通過形態(tài)學和分子生物學鑒定，分離到的6株菌分別為副布氏乳桿菌(Lactobacillusparabuchneri)、哈爾濱乳桿菌(Lactobacillusharbinensis)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)，說明淅川自然發(fā)酵酸菜中的乳酸菌種類豐富，多樣性較好。其中植物乳桿菌和副干酪乳桿菌均在我國《可用于食品的菌種名單》[12]和美國食品藥品管理局“公認為安全的物質清單”[13]之列，是公認的可用于食品的乳酸菌菌株；通過人工消化液耐受能力的檢測，菌株XC-18在人工胃液和人工腸液處理后存活率在6株菌中最高，分別為72.4%和65.7%(膽鹽濃度為5 mg/mL時)，說明該菌株具有較強的耐受性，具有較大的益生菌應用潛力。在下一步工作中將對XC-18的抗氧化能力、降解膽固醇能力等其他益生特性進行研究，對其安全性進行評價，為其在發(fā)酵食品生產(chǎn)中的應用提供理論依據(jù)。