趙鑫，胡蝶，張素平，祁勇剛,3，吳勇超，高冰,3，柳志杰,3*

(1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，武漢 430068；2.湖北聚匯農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，湖北 荊門 431821；3.湖北省發(fā)酵蔬菜企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北 荊門 431821)

泡菜歷史悠久，從古至今在中國(guó)人的食譜中扮演了重要的角色。其由大白菜等生鮮蔬菜與中，低濃度鹽水浸泡腌制，經(jīng)乳酸菌為主的益生菌發(fā)酵，形成獨(dú)特風(fēng)味的腌漬食品[1-2]。因其酸咸適中、清香脆嫩、色澤誘人且富含有機(jī)酸、維生素、氨基酸等成分，獲得了世界各地人們的喜愛[3-4]。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，對(duì)泡菜的研究愈發(fā)廣泛，如篩選應(yīng)用發(fā)酵劑[5-6]、優(yōu)化發(fā)酵工藝[7-8]、分析香味成分等[9]。近幾年來(lái)，篩選出耐酸且兼具有益屬性的乳酸菌作為天然發(fā)酵劑已成為研究熱點(diǎn)。研究表明，一些乳酸菌具有清除活性氧，緩解氧化損失的作用[10]。羅強(qiáng)等[11]從20份自然發(fā)酵泡菜中篩選得到植物乳桿菌NR-11和LR-13、棒狀乳桿菌LR-43對(duì)人工模擬胃液有較強(qiáng)的耐受性，具有腸胃益生菌的潛力。梁小波等將分離篩選獲得的高抗氧化活性發(fā)酵乳桿菌ZN011接種發(fā)酵泡菜，縮短了2 d左右的發(fā)酵周期，改善了風(fēng)味。

本實(shí)驗(yàn)從傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中分離純化得到2株疑似乳酸菌，對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，分析產(chǎn)酸、耐酸及抗氧化活性等生物學(xué)特性，以期為具有耐酸、較高抗氧化能力的乳酸菌制劑及在發(fā)酵食品中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

泡菜：采用傳統(tǒng)方法制作發(fā)酵而成，取自湖北聚匯農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司泡菜車間，用無(wú)菌袋收集，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 MRS液體培養(yǎng)基

蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏8.0 g/L，酵母粉4.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫80 1.0 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.04 g/L。

1.1.2.2 MRS固體培養(yǎng)基

蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏8.0 g/L，酵母粉4.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫80 1.0 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.04 g/L，瓊脂粉15.0 g/L。

1.1.2.3 MRS鑒定培養(yǎng)基

蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏8.0 g/L，酵母粉4.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫80 1.0 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.04 g/L，瓊脂粉15.0 g/L，碳酸鈣0.02 g/L。

1.1.3 主要試劑

2×Taq Master Mix試劑(試劑中含有染料)：購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司；細(xì)菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492R(5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)：均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、硫酸亞鐵(FeSO4)、水楊酸(C7H6O3)、過(guò)氧化氫(H2O2)、二乙三胺五乙酸(C14H23N3O10)、三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、聯(lián)苯三酚(C6H6O3)、磷酸緩沖液(PBS)、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、三氯乙酸(Cl3CCOOH)、三氯化鐵(FeCl3)：均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

AR323CN 電子天平 奧豪斯儀器有限公司；ME54E微量天平、DELTA320 pH計(jì) 梅特勒-托利多有限公司；DK-S22恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；5424R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) Eppendorf公司；CR21N落地式高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachl公司；MS-H-ProT磁力攪拌器(大龍)；HCB-1300V垂直層流超凈工作臺(tái)(海爾)；MLS-3781L高壓蒸汽滅菌鍋 日本Panasonic公司；ZXSR-1270恒溫培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；DYY7C電泳儀 北京市六一儀器廠；TC-96/G/H(b)C PCR儀 杭州博日科技有限公司；95-0444-01凝膠成像儀 上海苑勝儀器設(shè)備有限公司；UV-1601 UV-Vis分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化

取泡菜發(fā)酵液樣品1 mL，無(wú)菌生理鹽水10倍梯度稀釋，取各梯度100 μL均勻涂布于MRS鑒定培養(yǎng)基上，貼封口膜置于37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)48 h。觀察菌落形態(tài)并挑選產(chǎn)生溶鈣圈的菌種，在MRS固體平板上純化直至出現(xiàn)單菌落[12-13]。對(duì)篩選的單一菌進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)[14]，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乳酸菌的16S rDNA鑒定

PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：25 μL 2×PCR預(yù)混液，1 μL菌液作為模板，2.5 μL引物27F，2.5 μL引物1492R，19 μL ddH2O。

PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30次循環(huán)，72 ℃終延伸5 min，4 ℃保溫備用。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行Blast同源性比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株16S rDNA序列，采用MEGA 6.0軟件中的鄰接法(neighbor joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 乳酸菌產(chǎn)酸能力測(cè)定

取分離純化的200 μL菌液接種至10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，4000 r/min離心10 min，棄上清液，無(wú)菌水重懸調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/mL(OD595 nm=1.0)。37 ℃培養(yǎng)0，4，8，16，20，24 h，測(cè)定發(fā)酵液的乳酸量[15]。

1.2.4 乳酸菌耐酸能力測(cè)定

用鹽酸調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基至不同的pH(2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0)。吸取1 mL菌液接種至上述不同pH的培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600 nm。

1.2.5 乳酸菌抗氧化性測(cè)定

1.2.5.1 制備乳酸菌細(xì)胞懸浮液和無(wú)細(xì)胞提取物

細(xì)胞懸浮液制備：取活化3代后的菌液，5000 r/min離心10 min，棄上清液，用無(wú)菌水洗滌3次，重懸調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/mL(OD595nm=1.0)。

無(wú)細(xì)胞提取物制備：對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行離心破碎處理，電鏡檢查無(wú)完整細(xì)胞，離心收集上清液。

1.2.5.2 DPPH清除能力測(cè)定

參考Lin等[16]的方法并略作改進(jìn)：取樣品各2 mL，加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH-無(wú)水乙醇溶液，充分混合并避光反應(yīng)30 min，9000 r/min離心10 min，取上清液在OD517 nm處測(cè)吸光度。按式(1)計(jì)算DPPH自由基清除能力。

DPPH清除能力(%)=[1-(A1-A10)/A0]×100%。

式(1)

式中：A1為樣品和DPPH-無(wú)水乙醇的吸光度；A10為無(wú)水乙醇代替DPPH-無(wú)水乙醇的吸光度；A0為同體積純水代替樣品的吸光度。

1.2.5.3 羥基自由基清除能力測(cè)定

參考He等[17]的方法并略作改進(jìn)：取樣品2 mL加入5 mmol/L硫酸亞鐵溶液、5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、3 mmol/L H2O2各1 mL，37 ℃水浴20 min，測(cè)定OD510 nm。按式(2)計(jì)算羥基自由基的清除能力。

羥基自由基清除能力(%)=[1-(A1-A10)/A0]×100%。

式(2)

式中：A1為樣品組的吸光度；A10為同體積純水代替H2O2溶液的吸光度；A0為同體積純水代替樣品的吸光度。

1.2.5.4 超氧陰離子清除能力測(cè)定

參考張江巍等[18]的方法：取樣品0.5 mL加入150 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 8.2)、1.2 mmol/L鄰苯三酚溶液、3 mmol/L二乙三胺五乙酸溶液各1 mL。25 ℃水浴10 min，測(cè)定OD325 nm。按式(3)計(jì)算超氧陰離子的清除能力。

超氧陰離子清除能力(%)=[1-(A11-A10)/(A01-A00)]×100%。

式(3)

式中：A11為含樣品和鄰苯三酚的吸光度；A10為含樣品，不含鄰苯三酚的吸光度；A01為不含樣品，含鄰苯三酚的吸光度；A00為不含樣品和鄰苯三酚的吸光度。

1.2.5.5 還原能力測(cè)定

參考劉洋等[19]的方法：取樣品0.5 mL加入0.2 mol/L PBS溶液(pH 6.6)、1%鐵氰化鉀溶液各0.5 mL混勻，50 ℃水浴20 min，迅速冷卻后加入10%三氯乙酸0.5 mL，4000 r/min離心5 min，取上清液、蒸餾水、0.1%三氯乙酸各1 mL混勻，靜置反應(yīng)10 min，測(cè)定OD700 nm。按式(4)計(jì)算還原能力。

還原能力(%)=(A1-A0)/A0×100%。

式(4)

式中：A1為樣品組的吸光度；A0為PBS緩沖液代替樣品的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比菌株的相似性，MEGA 7.0繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，Origin 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的生理生化實(shí)驗(yàn)

從泡菜發(fā)酵液中共分離出2株乳酸菌，將其命名為Z2、Z5。生理生化實(shí)驗(yàn)見表1，2株菌均為G+，過(guò)氧化氫酶、明膠液化、產(chǎn)硫化氫、吲哚實(shí)驗(yàn)均為陰性。

表1 乳酸菌的生理生化實(shí)驗(yàn)

2.2 乳酸菌的16S rDNA鑒定

采用試劑盒提取2株菌的DNA，PCR擴(kuò)增后電泳，結(jié)果見圖1。

圖1 乳酸菌PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR product electrophoretogram of lactic acid bacteria

由圖1可知，對(duì)菌株DNA采取16S rDNA PCR擴(kuò)增后，均得到條帶大小在1000～2000 bp左右的產(chǎn)物，表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)雜質(zhì)可進(jìn)行測(cè)序，符合預(yù)期長(zhǎng)度。將測(cè)序得到的結(jié)果提交到NCBI進(jìn)行Blast同源性比對(duì)搜索，結(jié)果見表2。Z2與Limosilactobacillusfermentum的相似度為99.05%，Z5與Lactiplantibacilluspingfangensis的相似度為99.16%。

表2 乳酸菌16S rDNA序列鑒定結(jié)果Table 2 The identification results of 16S rDNA sequence of lactic acid bacteria

采用MEGA 6.0軟件分析，鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap自展1000次檢驗(yàn)進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)置信區(qū)間，結(jié)果見圖2。菌株Z2與發(fā)酵乳桿菌聚為一支，菌株Z5與植物乳桿菌聚為一支，親緣關(guān)系較近。

圖2 基于16S rDNA序列的乳酸菌系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria based on 16S rDNA sequence

2.3 乳酸菌的產(chǎn)酸能力

產(chǎn)酸力是乳酸菌的重要特性之一。對(duì)獲得的2株乳酸菌在37 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行產(chǎn)酸能力測(cè)定，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，發(fā)酵24 h時(shí)，相對(duì)于發(fā)酵乳桿菌Z2，植物乳桿菌Z5的菌液pH明顯較低，酸度高，產(chǎn)酸能力明顯較強(qiáng)。在0～20 h內(nèi)，2株菌的產(chǎn)酸量都在逐漸增加，20～24 h內(nèi)，產(chǎn)酸量逐漸趨于平緩或下降。其中，菌株Z5的產(chǎn)酸速度最快，產(chǎn)酸量最高，達(dá)到1.393 g/L。這與趙山山等[20]從貴州泡菜中分離出的植物乳桿菌產(chǎn)酸量結(jié)果相近。

2.4 乳酸菌的耐酸能力

對(duì)2株乳酸菌的耐酸能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖4。

圖4 乳酸菌的耐酸性Fig.4 The acid tolerance ability of lactic acid bacteria

由圖4可知，隨著培養(yǎng)基酸度的增強(qiáng)，2株乳酸菌的生長(zhǎng)都受到抑制。在pH值<5.0時(shí)，菌體濃度下降幅度大，在pH值為4.0時(shí)，2株菌的生長(zhǎng)差異最為明顯，Z5的耐酸能力最強(qiáng)。

2.5 乳酸菌的抗氧化性

圖5 菌株對(duì)DPPH自由基的清除能力(a)、羥基自由基的清除能力(b)、超氧陰離子的清除能力(c)、還原能力的測(cè)定(d)

2.5.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

由圖5中a可知，菌株的完整細(xì)胞懸浮液對(duì)DPPH自由基的清除率平均在(50.615±0.329)%，最高的為Z2，清除率達(dá)到(59.294±0.294)%。菌株的無(wú)細(xì)胞提取物的清除率平均在(33.180±0.580)%，最高的為Z2，清除率達(dá)到(41.990±0.364)%。乳酸菌的細(xì)胞懸浮液和無(wú)細(xì)胞提取物的清除能力也有所差異，細(xì)胞懸浮液的清除能力均高于無(wú)細(xì)胞提取物。Z2對(duì)DPPH自由基的清除能力最高，即抗氧化性最高。

2.5.2 清除羥基自由基能力的測(cè)定

由圖5中b可知，兩株乳酸菌的無(wú)細(xì)胞提取物和細(xì)胞懸浮液都表現(xiàn)出一定的羥基自由基清除能力，但清除能力有所差異。Z2的細(xì)胞懸浮液清除效果最強(qiáng)，清除率達(dá)到(52.244±0.311)%。Z5的無(wú)細(xì)胞提取物清除能力較強(qiáng)于Z2，清除率達(dá)到(37.944±0.794)%。

2.5.3 超氧陰離子清除能力的測(cè)定

由圖5中c可知，細(xì)胞懸浮液對(duì)超氧陰離子的平均清除率為(10.912±0.589)%，其中Z2的清除率最高，達(dá)到(11.370±0.492)%。無(wú)細(xì)胞提取物的平均清除率為(6.901±0.507)%，Z2的清除率最高，可達(dá)(8.510±0.689)%?？傮w看來(lái)，Z2對(duì)超氧陰離子的清除能力較高于Z5，細(xì)胞懸浮液的清除能力較高于無(wú)細(xì)胞提取物，這與郭慧芬等[21]的研究結(jié)果一致。

2.5.4 還原能力的測(cè)定

由圖5中d可知，2株乳酸菌的還原能力均有一定的差異，細(xì)胞懸浮液的還原能力均高于無(wú)細(xì)胞提取物，Z2的細(xì)胞懸浮液還原能力較高，達(dá)到(13.518±0.660)%， Z5細(xì)胞懸浮液的還原能力為(13.181±0.299)%，Z5無(wú)細(xì)胞提取物的還原能力高于Z2，達(dá)到(10.794±1.174)%。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)從泡菜中分離出2株菌，經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rDNA序列對(duì)比，鑒定Z2為發(fā)酵乳桿菌(Limosilactobacillusfermentum)，Z5為植物乳桿菌(Lactiplantibacilluspingfangensis)。通過(guò)對(duì)菌株產(chǎn)乳酸量、鹽酸耐受性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2株菌的性質(zhì)較為優(yōu)良，其中Z5的乳酸量達(dá)到(1.393±0.060) g/L，耐酸能力最強(qiáng)，可在pH 2.0的條件下存活，是可進(jìn)一步研究與應(yīng)用的備選菌株。測(cè)定2株菌的體外抗氧化能力，比較發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞懸浮液對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子的清除率以及還原能力都明顯高于無(wú)細(xì)胞提取物，其中Z2的抗氧化活性強(qiáng)于Z5，還原能力大于13%，為具有耐酸、較高抗氧化能力的乳酸菌制劑及在發(fā)酵食品中的應(yīng)用提供了理論參考。