劉秋晨，李 娟，劉 恩，顧艷麗，王 巖，王效禹，劉 艷,，單春喬

(1 大連三儀動物藥品有限公司，遼寧 大連 116000；2 江蘇三儀科研質(zhì)量控制中心，江蘇 邳州 221300)

表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)是Cohen[1]在小鼠頜下腺中首次發(fā)現(xiàn)的，之后研究人員陸續(xù)從唾液腺、腎臟、乳腺、胎盤和十二指腸Brunner腺體等多個臟器中分離得到[2]，并最終確定EGF是一種由53個氨基酸殘基組成的耐熱單鏈低分子多肽[3]。EGF在細胞分裂增殖與凋亡[4]、肝肺損傷修復(fù)[5-6]、生殖細胞發(fā)育成熟[7]、消化道黏膜保護及損傷修復(fù)等方面都有重要作用，也與動物腸道結(jié)構(gòu)和功能的完整性密切相關(guān)。EGF是腸道內(nèi)環(huán)境平衡的調(diào)節(jié)因子和營養(yǎng)因子，具有促進胃腸上皮細胞增殖和分化的能力，并對腸細胞更新有影響[8]，而腸道上皮細胞的穩(wěn)態(tài)決定了腸道結(jié)構(gòu)和功能的完整性[9]。據(jù)報道，外源EGF可提升機體腸道中消化酶活力,抑制腸道有害菌定殖,從而加速上皮細胞修復(fù)、改善胃腸道疾病[10]，以提高飼料利用率和營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。用EGF喂飼感染腸致病性大腸桿菌的斷奶仔兔，發(fā)現(xiàn)仔兔小腸各段以及結(jié)腸的病原菌定居數(shù)量明顯減少，說明EGF可通過抑制致病菌的定殖而保護腸道[11]。雖然EGF在人用尤其是燒燙傷救治方面有著大量研究，但在畜禽領(lǐng)域相關(guān)研究較少。基于EGF在促進胃腸道上皮細胞增殖、分化及消化道黏膜發(fā)育等方面的作用，本試驗研究了外源添加EGF對肉雞腸道菌群的影響，驗證EGF在促進消化道發(fā)育過程中對腸道菌群微環(huán)境的影響，旨在探討無抗養(yǎng)殖背景下，EGF在抗生素替代方面的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材 料

EGF為白色粉末狀，由江蘇三儀科研質(zhì)量控制中心提供。1日齡AA肉雞，購自宿遷益客種禽有限公司。NucleoSpin 96 Soil DNA抽提試劑盒，購自德國Macherey-Nagel公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計，購自Thermo Fisher Scientific。

1.2 基礎(chǔ)飼糧與飼養(yǎng)管理

基礎(chǔ)飼糧參照NRC(1994年)和《中國飼料成分及營養(yǎng)價值表》(2018年第29版)配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。肉雞飼養(yǎng)于鐵絲籠中，整個飼養(yǎng)過程自由采食和飲水。試驗第1周時每天室溫保持32 ℃、光照24 h；之后室溫每周降低2 ℃，直至24 ℃，每日光照23 h。所有肉雞在7日齡和13日齡接種新城疫滅活疫苗，20日齡接種傳染性法式囊滅活疫苗。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

1.3 試驗設(shè)計

將72只1日齡AA肉雞隨機分成對照組(CK)、K組、E組和EK組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)6只。CK組肉雞飼喂基礎(chǔ)飼糧，K組肉雞飼喂添加250 mg/kg鹽酸金霉素的飼料，E組肉雞飼喂添加500 mg/kg EGF的飼料，EK組肉雞飼喂添加500 mg/kg EGF和250 mg/kg鹽酸金霉素的飼料。飼喂期為21 d。

1.4 樣本采集

于試驗結(jié)束當天(即肉雞21日齡)每個重復(fù)隨機選取1只雞，4組共取12只雞，屠宰后取盲腸部位，用滅菌棉線結(jié)扎后在結(jié)扎處外側(cè)剪斷。于超凈臺中剪開腸腔將內(nèi)容物擠到5 mL凍存管中，立即放入液氮罐，凍實后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 腸道微生物菌群分析

使用NucleoSpin 96 Soil DNA抽提試劑盒提取樣品中的DNA，用NanoDrop 2000檢測DNA的濃度和純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA質(zhì)量。采用細菌通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細菌16S rDNA V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為100 μL：2×TaqMix 50 μL，上下游引物各5 μL，模板DNA 10 μL，無酶水補足體系至100 μL。PCR程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)30；72 ℃總延伸5 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，回收目標條帶，純化后備用。最后基于Illumina Nova測序平臺進行檢測定量，構(gòu)建PCR-free文庫。

1.5.1 可操作分類單元劃分和分類地位鑒定 以 97%作為可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)序列相似度的劃分閾值，該閾值大致相當于分類學中物種(species)水平的序列差異，將豐度低于全體樣本測序總量0.001%的OTU去除，根據(jù)每個OTU在每個樣本中所包含的序列數(shù)，構(gòu)建OTU在各樣本中豐度的矩陣。采用Greengenes數(shù)據(jù)庫對OTU在門、綱、目、科、屬、種水平進行分類鑒定和統(tǒng)計。

1.5.2 腸道群落的多樣性及功能 計算Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)，利用Wil-coxon秩和檢驗進行差異分析，繪制稀釋曲線和等級聚類曲線。使用R軟件對Weighted的UniFrac距離矩陣分別進行NMDS分析，并用二維排序圖描述群落樣本的結(jié)構(gòu)分布。根據(jù)OTU劃分和分類地位鑒定結(jié)果，獲得每個樣本在門、綱、目、科、屬各分類水平的具體組成。利用PICRUSt算法進行基于KEGG數(shù)據(jù)庫的功能預(yù)測。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，并對試驗數(shù)據(jù)進行單因子方差分析(one-way ANOVA，LSD)。用GraphPad Prism 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉雞腸道菌群的稀釋曲線和等級聚類曲線

圖1-A顯示，隨著測序數(shù)的增加，各組樣品的稀釋曲線逐漸趨于平緩，大多數(shù)樣品在測序數(shù)達到50 000時稀釋曲線基本變平， OTU的量基本不再增加，說明測序已經(jīng)包含絕大多數(shù)樣本信息。

圖1 肉雞腸道菌群的稀釋曲線(A)和等級聚類曲線(B)Fig.1 Rarefaction curve(A) and rank abundance curves(B) of broiler intestinal flora

將樣本中的 OTUs 按相對豐度由大到小排序編號，以O(shè)TUs的編號為橫坐標，OTUs的相對豐度為縱坐標，再將這些點通過折線連接，繪制等級聚類曲線(rank abundance)。等級聚類曲線可直觀地反映樣本中菌種的豐富度和均勻度。菌種的豐富度由曲線在橫軸上的跨度來反映，菌種的豐富度越高，曲線在橫軸上的跨度越大；菌種的均勻程度由曲線在垂直方向上的平緩程度來反映，菌種分布越均勻，曲線越平緩。由圖1-B可知，隨著OTUs數(shù)量的增大，各曲線逐漸趨于平緩，菌種分布均勻。本研究樣本的測序量和覆蓋范圍大，且菌種豐富，樣品適合下一步的分析和研究。

2.2 EGF對肉雞腸道菌群數(shù)量的影響

基于Illumina Nova測序平臺測序，構(gòu)建PCR-free文庫，然后進行雙末端(Paired-End)測序，對測序結(jié)果進行拼接，平均每樣品測得88 184條tags，經(jīng)過質(zhì)控平均得到85 920條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量達64 453，質(zhì)控有效率達73.09%。以97%的相似性(Identity)為劃分閾值將序列聚類成為OTUs，共得到1 773個OTUs，如圖2所示。

重疊部分的數(shù)字代表組間共有的OTUs個數(shù)，非重疊部分的數(shù)字代表組內(nèi)特有OTUs個數(shù)The numbers in overlapping parts represent numbers of OTUs shared between groups,and the numbers in non-overlapping parts represent the number of unique OTUs in the group圖2 肉雞腸道菌群組間OTU分布差異韋恩圖Fig.2 Venn diagram of OTU distribution difference between broiler intestinal bacteria groups

由圖2可以看出，各組OTUs總數(shù)分別為：CK組833個，K組816個，E組1 107個，EK組1 164個。CK、K、EK和E組共有的 OTUs有319個，獨有的OTUs分別為157，112，200和164個。結(jié)果表明，無論是OUTs總數(shù)還是獨有的OTUs數(shù)量，E組的菌種數(shù)量較CK組、K組高，而與EK組的數(shù)量接近，說明EGF對豐富腸道菌群數(shù)量有一定促進作用。

2.3 EGF對肉雞腸道菌種組成及其豐度的影響

2.3.1 門水平上的細菌組成 如圖3所示，在門水平上占主導(dǎo)地位的微生物主要為厚壁菌門、變形菌門。從門水平上不同處理組菌群組成的相對豐度圖可清楚區(qū)分21日齡肉雞腸道的優(yōu)勢菌群，平均豐度排名前10的有：厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、疣微菌門、未確定菌門、脫硫桿菌門、梭桿菌門、藍細菌門和其他。本試驗發(fā)現(xiàn)，E組中厚壁菌門微生物含量最高，而K和CK組變形菌門微生物含量最高且兩組相當；相較于其他3組，E組腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)更好。

圖3 肉雞腸道菌群門水平細菌群落結(jié)構(gòu)及分布Fig.3 Bacterial community structure and distribution of broiler intestinal flora at the phylum level

2.3.2 屬水平上的細菌組成 在屬水平上選取最豐富的35種菌屬進行對比分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 肉雞腸道菌群屬水平細菌群落結(jié)構(gòu)及分布Fig.4 Structure and distribution of horizontal bacterial community in broiler intestinal flora

從圖4可知，E組豐度較高的細菌為：乳桿菌屬、擬桿菌屬、土孢桿菌屬和梭菌屬。與其他3組進行比較后發(fā)現(xiàn)，E組肉雞腸道菌群中的乳桿菌屬細菌數(shù)量顯著高于CK組(P<0.05)，極顯著高于K和EK組(P<0.01)。E組埃希氏菌屬志賀氏菌含量顯著低于EK和CK組(P<0.05)，極顯著低于K組(P<0.01)。

2.3.3 種水平上的細菌組成 如圖5所示，21日齡肉雞腸道菌群在種水平上排名前10的優(yōu)勢菌種為：大腸桿菌、約氏乳桿菌、唾液乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、腐生葡萄球菌、糞腸球菌、盲腸球菌、克雷伯氏菌、另枝菌屬CHKCI003、鼠乳桿菌。與其他3組相比，E組肉雞腸道中大腸桿菌數(shù)豐度顯著降低，乳酸菌豐度顯著升高。

圖5 肉雞腸道菌群種水平細菌群落結(jié)構(gòu)及分布Fig.5 Bacterial community structure and distribution of broiler intestinal flora at species level

2.3.4 Alpha多樣性 由圖6可知，4組肉雞腸道菌群的物種數(shù)量依次表現(xiàn)為EK>E>K>CK，菌種多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))表現(xiàn)為EK>E>CK>K，菌種豐富度指數(shù)(Chao指數(shù))表現(xiàn)為EK>E>K>CK。結(jié)果表明， E組的菌種數(shù)、菌種多樣性指數(shù)和菌種豐富度指數(shù)高于CK和K組，但無顯著性差異(P>0.05)。

圖6 肉雞腸道菌群Alpha 多樣性Fig.6 Alpha diversity analysis of broiler intestinal flora

2.4 肉雞腸道菌群功能預(yù)測

為驗證不同組別肉雞腸道菌群代謝潛力的差異，采用PICRUSt 算法對腸道微生物的功能進行預(yù)測，結(jié)果(圖7)獲取了6大類功能(不包含未分類的)：人類疾病、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、細胞工程、有機體系統(tǒng)、代謝作用。不同處理組的微生物功能也各有不同，CK組腸道微生物在遺傳信息處理方面的功能較豐富；EK組在有機體系統(tǒng)、代謝作用和細胞工程方面的功能較豐富；E組各類功能較為均衡；K組除未分類功能外，環(huán)境信息處理功能較為豐富。

圖7 肉雞腸道菌群功能預(yù)測熱圖Fig.7 Heat map of broiler intestinal flora function prediction

3 討 論

腸道是機體最重要的消化器官，擔負著營養(yǎng)吸收、物質(zhì)代謝的重要功能。除此之外，腸道也是最大的免疫器官，通過免疫刺激、生物拮抗、菌群定殖等[12-13]構(gòu)建了腸道免疫屏障。腸道中的微生物群落包括細菌、真菌、古細菌、原生動物和病毒，其中細菌最為豐富。梭菌、乳酸桿菌、擬桿菌、大腸桿菌、普雷沃氏菌、假單胞菌、鏈球菌等是雞腸道中最常見的細菌。有研究報道指出，新生雛雞腸道幾乎是無菌的，其腸道菌群的建立主要受到后天生存環(huán)境、飼料、用藥等情況的影響[14-15]。健康的腸道菌群在肉雞的飼料消化和營養(yǎng)吸收中具有重要作用，腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異會影響機體對飼料的轉(zhuǎn)化效率，直接影響畜禽的健康和生產(chǎn)性能。因此，正常的腸道菌群對于保持最佳健康狀況非常重要。實際養(yǎng)殖過程中，諸如舍內(nèi)環(huán)境、熱應(yīng)激和抗生素之類的因素都會引起腸道菌群變化，從而導(dǎo)致家禽健康狀況惡化和生產(chǎn)性能下降。

在仔豬上的研究顯示， EGF 可減少斷奶仔豬回腸和盲腸中大腸桿菌及腸球菌的數(shù)量[16]。研究表明， EGF 可抑制大鼠盲腸中大腸桿菌和需氧菌的定殖，維護腸道上皮屏障的完整性[17]；能夠降低空腸彎曲桿菌的定殖并抑制大腸埃希氏菌的易位[18]。Bedford等[19]證明，EGF可以有效改善斷奶仔豬的生長性能，降低抗生素的使用量。同時，EGF 也可以增加壞死性結(jié)腸炎大鼠腸道的長度，對壞死性腸炎的一系列病理變化產(chǎn)生修復(fù)作用[20]。然而在肉雞方面尚無飼喂EGF的相關(guān)研究。本研究主要探討了EGF在改善肉雞腸道菌群平衡方面的生理功能。測序得到的各組OTUs結(jié)果表明，飼喂EGF后肉雞腸道微生物種類數(shù)量較對照組有所增加，而抗生素組菌種數(shù)量有所下降，這與Torok等[21]、La-Ongkhum等[22]的研究結(jié)果一致。在門水平上，飼喂EGF后，肉雞腸道中厚壁菌門含量最高，而在抗生素組和空白對照組中變形菌門占比最高。厚壁菌門有助于宿主代謝，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，從而提升能量效率，是促進動物胃腸道微生物分解纖維素的優(yōu)勢菌群[23]。變形菌門被認為是腸道菌群失調(diào)的標志微生物，健康動物的腸道內(nèi)含有變形菌門的共生細菌，當這些細菌的數(shù)量較少時，不表現(xiàn)出致病性，但在某些腸道環(huán)境下其會成為引發(fā)腸道炎癥的微生物[24]。在種水平上，與其他3組相比，EGF組肉雞腸道中大腸桿菌數(shù)量顯著降低，乳酸菌(約氏乳桿菌、唾液乳桿菌、羅伊氏乳桿菌等)占比顯著增多。乳酸菌是腸道菌群有益菌的代表菌，乳酸菌以乳糖和葡萄糖為營養(yǎng)進行繁殖，通過發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，可以保持腸道內(nèi)的酸性環(huán)境，促進腸道蠕動、預(yù)防便秘和腹瀉，還能促進消化吸收，增強免疫細胞活力[25]。本研究結(jié)果表明，肉雞飼料中添加500 mg/kg的EGF有助于提高肉雞腸道內(nèi)菌群多樣性，能改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高以乳酸菌為代表的厚壁菌門菌種豐度，降低以大腸桿菌為代表的變形菌門菌種含量。