代衛(wèi)鋒，韓雪△，岳姣姣，葛國嵐

多發(fā)性抽動癥（Tourette syndrome，TS）為多發(fā)于兒童和青少年的精神疾病，表現(xiàn)為突然快速、不自主、非節(jié)律性的運(yùn)動或發(fā)聲，發(fā)病率約為1%［1］。目前，臨床常用藥氟哌啶醇、α激動劑等可有效降低TS患者抽動頻率，但存在吞咽困難、口干、視線模糊等不良反應(yīng)［2］。研究顯示，多巴胺（dopamine，DA）和5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）等異常表達(dá)是導(dǎo)致TS發(fā)病的主要原因，其中5-HT可通過調(diào)節(jié)DA等神經(jīng)遞質(zhì)，直接和（或）間接地參與TS病理進(jìn)程［3-4］。5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（5-HT transporter，5-HTT或SERT）為5-HT的轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白，可再攝取神經(jīng)突觸間隙中的5-HT，并對其具有滅活作用［5］。天麻素為中藥天麻的主要活性成分，具有抗驚厥、神經(jīng)保護(hù)和鎮(zhèn)靜等作用，對癲癇、帕金森病及認(rèn)知障礙等神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有較好的治療效果［6］。最近研究顯示，天麻素對TS模型動物治療有效，可通過降低SERT表達(dá)而間接減少DA釋放［7］。然而，天麻素調(diào)節(jié)SERT的表達(dá)及其改善TS抽動癥狀的分子機(jī)制并不清楚。本研究采用天麻素對TS大鼠進(jìn)行治療，并探討糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）磷酸化水平及SERT、5-HT、DA等因子水平與TS的關(guān)系及可能作用機(jī)制，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 40只SPF級6周齡Wistar大鼠購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，均為雄性，體質(zhì)量180~190 g。天麻素片（昆藥集團(tuán)股份有限公司），1-（2，5-二甲氧基-4-碘苯基）-2-氨基丙烷（DOI，美國Sigma公司），GSK-3β抑制劑CHIR-99021（美國MCE公司），5-HT、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）、DA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒及二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（上海生工生物公司），5-羥色胺2C受體（5HT2CR）、5-羥色胺2A受體（5HT2AR）、SERT、β-actin、酪氨酸羥化酶（TH）抗體及羊抗兔IgG抗體（美國Abcam公司），GSK-3β和p-S9-GSK-3β抗體（美國CST公司），冷凍切片機(jī)（德國Leica公司），酶標(biāo)儀、凝膠成像系統(tǒng)（上海天能生物公司），離心機(jī)（德國Eppendorf公司），半干轉(zhuǎn)膜儀（美國Scotsman公司），電泳儀（美國BioRad公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 TS模型制備 參照文獻(xiàn)［8-9］進(jìn)行，首先按照隨機(jī)數(shù)字表法抽取10只大鼠為正常組，余30只采用1 mg/kg DOI溶液（生理鹽水配制）腹腔注射，連續(xù)注射21 d，誘導(dǎo)TS大鼠模型。大鼠在造模首日注射DOI后2 h出現(xiàn)不連續(xù)的吸鼻、頭部快速抽動或舔食前爪等行為表明建模成功，30只大鼠均建模成功。

1.2.2 分組及給藥 天麻素給藥劑量：按照成人體質(zhì)量為60 kg、每天藥量為300 mg計(jì)算成人每日劑量為5 mg/kg，故根據(jù)人-大鼠體表系數(shù)法（大鼠的劑量=6.3×人劑量）換算得到大鼠天麻素劑量為31.5 mg/kg，本研究選擇30 mg/kg。將30只建模大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：TS模型組，注射DOI后2 h以生理鹽水灌胃；TS+天麻素（30 mg/kg灌胃）組，注射DOI后2 h以30 mg/kg天麻素灌胃；TS+天麻素+CHIR-99021組，注射DOI后2 h，先以2 mg/kg CHIR-99021腹腔注射［10］，再以30 mg/kg天麻素灌胃；正常組以生理鹽水灌胃，均連續(xù)給藥21 d，每日1次。

1.2.3 頭部抽動行為檢測 末次給藥后，立即由2名研究人員獨(dú)立觀察各組大鼠在30 min內(nèi)頭部抽動行為的次數(shù)，主要表現(xiàn)為軀干不參與的頭部高頻率抽動行為，并通過攝像機(jī)收集行為數(shù)據(jù)。

1.2.4 紋狀體5-HT、5-HIAA、DA水平檢測 末次給藥2 h后，麻醉處死大鼠?？焖俜蛛x紋狀體和黑質(zhì)，沖洗干凈后用鋁箔包裹，液氮速凍后保存于-80℃?zhèn)溆谩Ｈ〖y狀體組織，冰上勻漿90 s后（勻漿轉(zhuǎn)速2 500 r/min），分離上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測5-HT、5-HIAA及DA水平。

1.2.5 免疫組化法檢測黑質(zhì)中DA神經(jīng)元數(shù)量 取黑質(zhì)組織經(jīng)脫水等處理后冰凍切5μm片，經(jīng)蛋白酶消化、血清封閉后，分別與一抗TH抗體（1∶200）4℃過夜孵育、二抗抗體（1∶500）室溫孵育1 h、DAB孵育5 min顯色后終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染、鹽酸分化、乙醇脫水后封片，高倍光鏡（×400）下，隨機(jī)讀取5個視野，計(jì)數(shù)視野內(nèi)TH陽性神經(jīng)元數(shù)量，即為DA神經(jīng)元數(shù)量。

1.2.6 Western blot法檢測紋狀體中SERT、5-HT2AR、5-HT2CR及GSK-3β磷酸化水平 取紋狀體組織，加入蛋白裂解液冰上勻漿裂解細(xì)胞，4℃、12 000 r/min離心5 min，分離上清液得到總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取50μg蛋白100℃變性，加樣至SDS-PAGE中電泳分離各蛋白后，恒壓轉(zhuǎn)至PVDF膜上。將膜浸于5%脫脂奶粉中封閉2 h后，浸于一抗β-actin（1∶1 000）、SERT（1∶500）、5-HT2AR（1∶300）、5-HT2CR（1∶1 000）、GSK-3β（1∶1 000）及p-S9-GSK-3β（1∶1 000）稀釋液中4℃過夜孵育，洗膜后浸于二抗（1∶2 000）稀釋液中室溫孵育1 h，洗膜后將膜置于暗盒內(nèi)并加入ECL試劑顯影。采用TANON成像系統(tǒng)拍攝并分析各條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料均以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用Bonferroni-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠頭部抽動次數(shù)比較 正常組、TS模型組、TS+天麻素組、TS+天麻素+CHIR-99021組大鼠頭部抽動次數(shù)分別為0、（23.50±3.52）、（14.60±2.83）、（21.80±3.29）次（F=146.748，P＜0.01）。其中，與正常組比較，TS模型各組大鼠頭部抽動次數(shù)增多（P＜0.05）；與TS模型組比較，TS+天麻素組大鼠頭部抽動次數(shù)減少（P＜0.05）；而與TS+天麻素組比較，TS+天麻素+CHIR-99021組大鼠頭部抽動次數(shù)增多（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠紋狀體中5-HT、5-HIAA、DA水平比較 與正常組比較，TS模型組紋狀體中5-HT水平降低，DA水平升高（P＜0.05）；與TS模型組比較，TS+天麻素組紋狀體中5-HT水平升高，DA水平降低（P＜0.05）；與TS+天麻素組比較，TS+天麻素+CHIR-99021組紋狀體中5-HT水平降低，DA水平升高（P＜0.05）。各組紋狀體中5-HIAA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Tab.1 Levels of 5-HT,5-HIAA and DA in rat striatum in the four groups表1各組大鼠紋狀體中5-HT、5-HIAA、DA水平（n=10，μg/L，±s）

Tab.1 Levels of 5-HT,5-HIAA and DA in rat striatum in the four groups表1各組大鼠紋狀體中5-HT、5-HIAA、DA水平（n=10，μg/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與TS模型組比較，c與TS+天麻素組比較，P＜0.05；表2、3同。

組別正常組TS模型組TS+天麻素組TS+天麻素+CHIR-99021組F 5-HT 8.94±1.58 5.36±1.14a 7.58±1.35b 5.41±1.27ac 16.948＊＊5-HIAA 5.13±1.42 5.64±1.07 5.41±1.48 5.95±1.59 0.614 DA 106.59±9.54 175.61±11.06a 127.78±10.27ab 165.91±10.18ac 99.165＊＊

2.3 各組大鼠黑質(zhì)中DA神經(jīng)元數(shù)量比較 正常組、TS模型組、TS+天麻素組、TS+天麻素+CHIR-99021組大鼠黑質(zhì)中DA神經(jīng)元數(shù)量分別為（36.42±6.39）、（71.53±8.27）、（52.28±7.46）、（69.17±6.82）個/視野（F=50.747，P＜0.01）。其中，與正常組比較，TS模型各組黑質(zhì)中DA神經(jīng)元數(shù)量增多（P＜0.05）；與TS模型組比較，TS+天麻素組黑質(zhì)中DA神經(jīng)元數(shù)量減少（P＜0.05）；與TS+天麻素組比較，TS+天麻素+CHIR-99021組黑質(zhì)中DA神經(jīng)元數(shù)量增多（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Observation of DA neurons in substantia nigra of rats(immunohistochemistry,×400)圖1 各組大鼠黑質(zhì)DA神經(jīng)元數(shù)量變化（免疫組化染色，×400）

2.4 各組大鼠紋狀體中SERT、5-HT2AR、5-HT2CR水平比較 與正常組比較，TS模型組紋狀體中SERT水平增高（P＜0.05）；與TS模型組比較，TS+天麻素組紋狀體中SERT水平降低（P＜0.05）；與TS+天麻素組比較，TS+天麻素+CHIR-99021組紋狀體中SERT水平增高（P＜0.05）。各組5-HT2AR、5-HT2CR水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2、表2。

Fig.2 SERT,5-HT2AR and 5-HT2CR levels detected by Western blot assay in each group圖2 各組SERT、5-HT2AR、5-HT2CR水平Western blot檢測結(jié)果

Tab.2 Comparison of SERT,5-HT2AR and 5-HT2CR levels in striatum between the four groups表2各組大鼠紋狀體中SERT、5-HT2AR、5-HT2CR水平比較 （n=10，±s）

Tab.2 Comparison of SERT,5-HT2AR and 5-HT2CR levels in striatum between the four groups表2各組大鼠紋狀體中SERT、5-HT2AR、5-HT2CR水平比較 （n=10，±s）

組別正常組TS模型組TS+天麻素組TS+天麻素+CHIR-99021組F SERT 1.08±0.16 2.13±0.21a 1.52±0.13ab 1.96±0.17ac 76.915＊＊5-HT2AR 0.78±0.09 0.83±0.11 0.75±0.12 0.89±0.15 2.633 5-HT2CR 1.28±0.13 1.19±0.14 1.25±0.11 1.16±0.07 2.243

2.5 各組大鼠紋狀體中GSK-3β水平及其磷酸化水平比較 與正常組比較，TS模型組紋狀體中p-S9-GSK-3β、p-S9-GSK-3β/t-GSK-3β水平升高（P＜0.05）；與TS模型組比較，TS+天麻素組紋狀體中p-S9-GSK-3β、p-S9-GSK-3β/t-GSK-3β水 平 降 低（P＜0.05）；與TS+天麻素組比較，TS+天麻素+CHIR-99021組 紋 狀 體 中p-S9-GSK-3β、p-S9-GSK-3β/t-GSK-3β水平升高（P＜0.05）。各組t-GSK-3β水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3、表3。

Fig.3 p-S9-GSK-3β,t-GSK-3βexpression detected by Western blot assay in each group圖3 各組p-S9-GSK-3β、t-GSK-3β表達(dá)Western blot檢測結(jié)果

Tab.3 Comparison of p-S9-GSK-3βand t-GSK-3β levels in striatum between the four groups表3 各組大鼠紋狀體中p-S9-GSK-3β、t-GSK-3β水平比較 （n=10，±s）

Tab.3 Comparison of p-S9-GSK-3βand t-GSK-3β levels in striatum between the four groups表3 各組大鼠紋狀體中p-S9-GSK-3β、t-GSK-3β水平比較 （n=10，±s）

組別正常組TS模型組TS+天麻素組TS+天麻素+CHIR-99021組F p-S9-GSK-3β/β-actin 0.17±0.05 0.83±0.14a 0.34±0.12ab 0.79±0.16ac t-GSK-3β/β-actin 1.58±0.20 1.63±0.19 1.52±0.17 1.61±0.23 p-S9-GSK-3β/t-GSK-3β 0.12±0.03 0.50±0.09a 0.23±0.06ab 0.48±0.05ac 69.410＊＊0.583 93.135＊＊

3 討論

DOI是誘導(dǎo)TS模型的常用藥物之一，通過選擇性激動5-HT2A和5-HT2C受體誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)頭部抽動等類似人TS的行為，且具有良好穩(wěn)定性，其誘導(dǎo)的動物模型常用于藥理機(jī)制研究［9］。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，TS根本病機(jī)為肝風(fēng)內(nèi)動、脾虛痰聚，因此平肝熄風(fēng)、健脾清肝是其治療策略［11］。天麻為治療小兒TS方劑的高頻中藥之一，其活性成分天麻素為抗癲癇和TS癥狀的主要中藥單體［12］。本研究結(jié)果顯示，天麻素可有效抑制TS大鼠的頭部抽動，該結(jié)果同既往研究一致［8］。

神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)紊亂在TS發(fā)病中具有重要作用，5-HT為神經(jīng)系統(tǒng)中抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其清除受到SERT介導(dǎo)的再攝取和單胺氧化酶A（MAO-α）介導(dǎo)的酶解作用的調(diào)控，且以再攝取機(jī)制為主［13］。5-HIAA為5-HT的酶解代謝產(chǎn)物，可反映機(jī)體內(nèi)5-HT酶解水平。研究顯示，天麻素改善TS大鼠異常抽動行為與減少多巴胺D2受體（D2Rs）、SERT表達(dá)并增加多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（DAT）表達(dá)，減少DA的釋放有關(guān)［10］。研究顯示，沉默SERT可明顯在突觸水平上減少5-HT的再攝取，增加5-HT表達(dá)水平和傳遞效率，降低大鼠沖動性活動水平［14］。本研究結(jié)果顯示，天麻素可抑制TS大鼠紋狀體中SERT的表達(dá)，增加5-HT水平，但對5-HIAA水平的影響不大，表明天麻素可抑制SERT，增加5-HT水平，提示天麻素可能通過抑制依賴SERT的5-HT再攝取過程而不是酶解過程，抑制5-HT的清除，從而升高5-HT水平。另外，5-HT水平變化可能激活或抑制5-HT受體活性，進(jìn)而影響紋狀體中DA的釋放［15］。5-HT受體也可通過對黑質(zhì)-紋狀體區(qū)DA的釋放進(jìn)行調(diào)節(jié)，參與癲癇等神經(jīng)障礙性疾病的發(fā)生［16］。本研究顯示，天麻素可顯著降低TS大鼠黑質(zhì)中DA神經(jīng)元數(shù)量和紋狀體中DA水平，而對5-HT2A受體、5-HT2C受體水平無明顯影響，表明天麻素可降低TS大鼠DA水平，推測天麻素可能具有抑制SERT表達(dá)和（或）抑制5-HT受體活性的作用，通過阻斷其對黑質(zhì)-紋狀體DA系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，抑制DA的釋放，降低紋狀體DA水平，進(jìn)而減輕TS大鼠頭部抽動行為。

GSK-3β在體內(nèi)以N端第9位絲氨酸殘基磷酸化（p-S9-GSK-3β）的抑制形式和非磷酸化（t-GSK-3β）的活性形式存在，可調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞定位和與靶基因DNA的結(jié)合，調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育過程［17］。當(dāng)p-S9-GSK-3β水平升高時，GSK-3β活性將受到抑制。研究顯示，GSK-3β抑制性磷酸化程度的增加與高劑量鋅攝入對記憶鞏固的損害有關(guān)［18］。Ragu Varman等［19］研究顯示，GSK-3β可通過其磷酸化調(diào)節(jié)SERT蛋白的功能和轉(zhuǎn)運(yùn)。另外，SERT在TS患者中高表達(dá)，通過抑制5-HT水平，參與疾病的發(fā)生和發(fā)展［20］。因此，推測GSK-3β在TS中通過調(diào)節(jié)SERT表達(dá)發(fā)揮作用，可能作為TS的治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，TS模型組p-S9-GSK-3β水平和SERT表達(dá)均高于正常組，而天麻素干預(yù)則可顯著降低TS大鼠紋狀體中p-S9-GSK-3β和SERT水平，但對t-GSK-3β水平無明顯影響，表明天麻素對GSK-3β活性具有促進(jìn)作用，提示其可能是通過增加GSK-3β活性，進(jìn)而降低SERT表達(dá)。本研究在天麻素的基礎(chǔ)上給予GSK-3β抑制劑CHIR-99021，結(jié)果顯示，CHIR-99021可增加p-S9-GSK-3β水平，同時SERT的表達(dá)顯著增高，且紋狀體中5-HT水平降低，DA水平增高，表明GSK-3β抑制劑可部分逆轉(zhuǎn)天麻素對SERT、5-HT及DA水平的調(diào)節(jié)作用，提示天麻素可能通過GSK-3β的磷酸化調(diào)節(jié)SERT表達(dá)，影響其介導(dǎo)的5-HT再攝取過程，進(jìn)而調(diào)節(jié)紋狀體中DA的釋放。

綜上所述，天麻素可通過抑制GSK-3β的磷酸化調(diào)節(jié)SERT表達(dá)，影響其介導(dǎo)的5-HT再攝取過程，進(jìn)而抑制紋狀體中DA的釋放，改善TS大鼠頭部抽動行為。然而也有研究認(rèn)為，天麻素可能通過作用于Toll樣受體（TLR）/核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）信號、TLR/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號或核因子E2相關(guān)因子2（Nrf-2）/血紅素加氧酶-1（HO-1）/高遷移率族蛋白B1（HMGB1）/NF-кB途徑介導(dǎo)的氧化應(yīng)激或炎癥過程，抑制神經(jīng)炎癥，進(jìn)而起到對TS大鼠行為的改善作用［8，21］。因此，天麻素改善TS癥狀的分子機(jī)制仍有待探索，不排除可能通過多途徑發(fā)揮作用。