錢麒鈺，袁改利，馬珊珊，羅莉梅，徐玉

非小細胞肺癌（NSCLC）為一種高度惡性的難治性腫瘤。NSCLC的高轉移性及放化療耐藥性的產生是導致NSCLC患者生存期變短的重要原因［1］。減少NSCLC轉移，提高放化療治療效果，對促進患者生存及改善預后有重要意義。腫瘤上皮細胞間充質轉分化（EMT）表型改變引起的耐藥基因如Zeste基因同源蛋白2（EZH2）表達異常，是促進癌細胞轉移、耐藥性增強的關鍵因素［2-4］。miR-101與EZH2之間有靶向調控關系［5］，且miR-101/EZH2軸已被證實是參與子宮內膜癌、結腸癌等腫瘤細胞EMT表型改變、耐藥性產生的關鍵信號通路［6］，但干預調控miR-101/EZH2軸對NSCLC細胞影響的相關研究較少。

槲皮素為天然黃酮類成分，現(xiàn)代藥理學發(fā)現(xiàn)，其對乳腺癌、胃癌、胰腺癌等癌細胞轉移有抑制作用［7］，且其對NSCLC細胞EMT表型改變也有抑制作用［8］。但槲皮素是否可通過抑制EMT表型改變來改善NSCLC對放化療的敏感性尚未可知。本研究通過體外培養(yǎng)NSCLC細胞，從miR-101/EZH2軸方面對此進行探究驗證，以期為槲皮素用于治療肺癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人NSCLC細胞系A549細胞株購自上海奧陸生物科技有限公司；槲皮素購自北京索萊寶科技有限公司；EMT誘導劑轉化生長因子（TGF）-β1（重組人TGF-β1蛋白水解加工復合物）購自美國PEPROTECH公司；吉西他濱（Gb）購自北京伊塔生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自上海經(jīng)科化學科技有限公司；miR-101抑制物（miR-101-inhibitor）及其陰性對照試劑（miR-NC）均由南京金斯瑞生物科技有限公司設計合成；EZH2、TGF-β1、果蠅母親DPP同源物4（SMAD4）、磷酸化SMAD4（p-SMAD4）、E鈣黏蛋白（Ecadherin）、N鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、內參β-actin兔抗人抗體和辣根過氧化物酶羊抗兔二抗均購自美國abcam公司；SpectraMax iD3酶標儀購自美谷分子儀器（上海）有限公司；7500實時熒光定量PCR（qPCR）儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 細胞復蘇及培養(yǎng) A549細胞株常規(guī)復蘇后，取適量細胞，DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。參照文獻［9］，按Gb濃度遞增法培養(yǎng)獲得A549耐Gb高濃度（200 nmoL/L）細胞株，若A549/Gb細胞能夠在含200 nmol/L Gb培養(yǎng)液培養(yǎng)中穩(wěn)定生長和傳代，則視為耐藥細胞株造模成功。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖情況 將A549、A549/Gb細胞按5×104個/孔的密度接種于6孔板內，向培養(yǎng)液中加入終濃度為0、4、8、16、32、64、128、256μmol/L的槲皮素，干預培養(yǎng)48 h后，加入CCK-8溶液10μL繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀上于450 nm波長下檢測光密度（OD）值，根據(jù)OD值計算細胞生存率（%）=實驗組OD值/空白組OD值×100%。繪制生長曲線，計算半數(shù)抑制濃度（IC50），選取IC50的槲皮素濃度作為A549、A549/Gb細胞的干預濃度。

1.4 細胞分組及處理 取對數(shù)期A549細胞，以5×104個/孔的密度接種于6孔板內，并設置為空白組（A549細胞入正常培養(yǎng)基培養(yǎng)）、A549+EMT誘導劑［10］組（4μg/L TGF-β1處理）、A549+槲皮素組（64μmol/L槲皮素處理）、槲皮素+EMT誘導劑組（64μmol/L槲皮素+4μg/L TGF-β1處理），每組6個復孔。取對數(shù)期A549細胞及A549/Gb細胞，以5×104個/孔的密度接種于6孔板內，并設置為A549組、A549/Gb組、A549/Gb+槲皮素組（128μmol/L槲皮素處理）、A549/Gb+EMT誘導劑組（4μg/L TGF-β1處理）、miR-101-inhibitor組（A549/Gb細胞轉染miR-101-inhibitor）、miR-NC組（A549/Gb細胞轉染miR-NC）、槲皮素+miR-101-inhibitor組（A549/Gb細胞轉染miR-101-inhibitor+128μmol/L槲皮素），每組設置6個復孔。各組干預培養(yǎng)48 h后，收集細胞進行后續(xù)研究。

1.5 qPCR檢測各組細胞miR-101表達水平 取各組干預培養(yǎng)后的細胞，加入細胞裂解液勻漿粉碎后，RNA提取試劑盒提取總RNA，并逆轉錄得到cDNA，以cDNA為模板（10×cDNA模板1μL），加入上、下游引物各0.5μL，H2O 8μL，2×SYBR mix 10μL，行PCR反應。反應條件：95℃預變性14 min；95℃變性40 s，60℃退火45 s，72℃延伸20 min，50個循環(huán)。以U6為內參，用2-ΔΔCt法計算miR-101表達水平。各引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成，見表1。

Tab.1 Primer sequence表1 引物序列

1.6 Western blot法檢測EZH2、TGF-β1/SMAD4和EMT標志蛋白E-cadherin、N-cadherin及Vimentin表達 取各組干預培養(yǎng)后的細胞，洗滌后裂解、勻漿粉碎獲得細胞勻漿液，蛋白提取試劑盒及BCA法提取并測定勻漿液中蛋白濃度后，取25μg蛋白，行SDS-PAGE、PVDF轉膜，加入1∶800的EZH2、TGF-β1、SMAD4、p-SMAD4、E-cadherin、N-cadherin及Vimentin兔抗人一抗，及1∶1 000β-actin兔抗人內參抗體，4℃孵育過夜，次日加入1∶1 500的辣根過氧化物酶羊抗兔二抗室溫孵育2.5 h，增強化學發(fā)光法顯影曝光，化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)拍照，Image-J軟件分析相對灰度值。

1.7 細胞對Gb的耐藥性檢測 取各組細胞，按1×105個/孔的密度接種于6孔板中，各組均加入不同濃度（0、5、10、20、40、80、100、200 nmol/L）的Gb培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8溶液10μL繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在酶標儀上于450 nm波長下檢測OD值，根據(jù)OD值繪制生長曲線，計算IC50及耐藥指數(shù)（IR），IR=實驗組IC50/A549細胞IC50。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用Graphpad Prism 6.0進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 槲皮素對A549細胞及A549/Gb細胞生存率的影響 隨著槲皮素濃度的升高，A549細胞及A549/Gb細胞生存率均逐漸降低。當槲皮素濃度為64、128μmol/L時，A549及A549/Gb細胞存活在50%左右，選用64、128μmol/L的槲皮素為A549及A549/Gb細胞的干預濃度，見圖1。

Fig.1 Effects of different concentrations of quercetin on the survival rates of A549 cells and A549/Gb cells圖1 不同濃度槲皮素對A549細胞及A549/Gb細胞生存率的影響

2.2 槲皮素對A549細胞EMT逆轉作用及耐藥性的影響 與空白組相比，A549+槲皮素組細胞Ecadherin蛋白表達水平升高，N-cadherin及Vimentin蛋白表達水平、IC50及IR降低（P＜0.05）；與A549+槲皮素組相比，A549+EMT誘導劑組和槲皮素+EMT誘導劑組細胞E-cadherin蛋白表達水平降低、Ncadherin及Vimentin蛋白表達水平、IC50及IR升高（P＜0.05），見圖2、表2。

Fig.2 Immunoblotting of E-cadherin,N-cadherin and Vimentin protein expression in cells of each group圖2 各組細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平免疫印跡圖

2.3 槲皮素對A549細胞miR-101及EZH2、TGF-β1、p-SMAD4/SMAD4蛋白表達水平的影響 與空白組相比，A549+槲皮素組細胞miR-101表達升高，EZH2、TGF-β1及p-SMAD4/SMAD4蛋白表達水平均降低（P＜0.05）；A549+EMT誘導劑組miR-101表達降低，EZH2、TGF-β1及p-SMAD4/SMAD4蛋白表達水平均升高（P＜0.05）。與A549+槲皮素組相比，槲皮素+EMT誘導劑組細胞miR-101表達降低，EZH2、TGF-β1及p-SMAD4/SMAD4蛋白表達水平均升高（P＜0.05），見圖3、表3。

Tab.2 Comparison of E-cadherin,N-cadherin and Vimentin protein expression levels,IC50 and IR between the four groups表2 各組細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平及IC50、IR比較 （±s）

Tab.2 Comparison of E-cadherin,N-cadherin and Vimentin protein expression levels,IC50 and IR between the four groups表2 各組細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平及IC50、IR比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與A549+槲皮素組比較，c與A549+EMT誘導劑組比較，P＜0.05。

組別空白組A549+槲皮素組A549+EMT誘導劑組槲皮素+EMT誘導劑組F n6 6 6 6 E-cadherin 0.99±0.09 1.93±0.19a 0.66±0.05ab 0.99±0.09bc 131.310＊＊N-cadherin 1.01±0.10 0.54±0.04a 1.69±0.18ab 1.01±0.09bc 103.228＊＊Vimentin 1.04±0.09 0.47±0.03a 1.75±0.20ab 1.10±0.10bc 111.539＊＊IC50（nmol/L）6.77±0.61 1.04±0.10a 49.38±0.47ab 6.98±0.53bc 13 617.58＊＊IR 1.00±0.00 0.15±0.01a 7.29±0.72ab 1.04±0.11bc 494.242＊＊

Fig.3 EZH2,TGF-β1,p-SMAD4/SMAD4 protein expression levels detected by Western blot assay in each group圖3 各組細胞EZH2、TGF-β1、p-SMAD4/SMAD4蛋白表達水平免疫印跡圖

Tab.3 Comparison of miR-101 and EZH2,TGF-β1,p-SMAD4/SMAD4 protein expression levels between the four groups表3各組細胞miR-101及EZH2、TGF-β1、p-SMAD4/SMAD4蛋白表達水平比較 （n=6，±s）

Tab.3 Comparison of miR-101 and EZH2,TGF-β1,p-SMAD4/SMAD4 protein expression levels between the four groups表3各組細胞miR-101及EZH2、TGF-β1、p-SMAD4/SMAD4蛋白表達水平比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與A549+槲皮素組比較，c與A549+EMT誘導劑組比較，P＜0.05。

組別空白組A549+槲皮素組A549+EMT誘導劑組槲皮素+EMT誘導劑組F miR-101 1.08±0.09 1.95±0.19a 0.56±0.03ab 1.19±0.11bc 137.972＊＊EZH2 1.04±0.09 0.44±0.05a 1.87±0.17ab 1.11±0.10bc 166.675＊＊TGF-β1 1.17±0.11 0.24±0.20a 1.88±0.17ab 1.19±0.08bc 124.430＊＊p-SMAD4/SMAD4 1.00±0.10 0.55±0.05a 1.69±0.22ab 1.02±0.09bc 76.765＊＊

2.4 抑制miR-101后槲皮素對A549/Gb細胞EMT及耐藥性的影響 與A549組相比，A549/Gb組細胞E-cadherin表達降低，N-cadherin及Vimentin、IC50及IR指數(shù)升高（P＜0.05）。與A549/Gb組相比，A549/Gb+槲皮素組E-cadherin表達升高，N-cadherin及Vimentin表達、IC50及IR降低（P＜0.05），A549/Gb+EMT誘導劑組及miR-101-inhibitor組E-cadherin表達降低，N-cadherin及Vimentin、IC50及IR升高（P＜0.05）。與A549/Gb+槲皮素組相比，槲皮素+miR-101-inhibitor組及miR-NC組細胞E-cadherin表達降低，N-cadherin及Vimentin表達、IC50及IR升高（P＜0.05），見圖4、表4。

Fig.4 Immunoblotting results of E-cadherin,N-cadherin and Vimentin expression in cells of each group圖4 各組細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達免疫印跡圖

2.5 抑制miR-101后槲皮素對miR-101及EZH2、TGF-β1、p-SMAD4/SMAD4蛋白表達水平影響 與A549組相比，A549/Gb組細胞miR-101表達降低，EZH2、TGF-β1及p-SMAD4/SMAD4蛋白表達水平均升高（P＜0.05）。與A549/Gb組細胞相比，A549/Gb+槲皮素組細胞miR-101表達升高，EZH2、TGF-β1及p-SMAD4/SMAD4蛋白表達水平均降低（P＜0.05）；A549/Gb+EMT誘導劑組及miR-101-inhibitor組細胞miR-101表達降低，EZH2、TGF-β1及p-SMAD4/SMAD4蛋白表達水平均升高（P＜0.05）。與A549/Gb+槲皮素組相比，槲皮素+miR-101-inhibitor組及miR-NC組細胞miR-101表達降低，EZH2、TGF-β1及p-SMAD4/SMAD4蛋白表達水平均升高（P＜0.05），見表5、圖5。

Tab.4 Comparison of E-cadherin,N-cadherin and Vimentin protein expression levels,IC50 and IR after miR-101 inhibition between the seven groups表4 抑制miR-101后各組細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平及IC50、IR比較 （±s）

Tab.4 Comparison of E-cadherin,N-cadherin and Vimentin protein expression levels,IC50 and IR after miR-101 inhibition between the seven groups表4 抑制miR-101后各組細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平及IC50、IR比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與A549組比較，b與A549/Gb組比較，c與A549/Gb+槲皮素組比較，P＜0.05。

組別A549組A549/Gb組A549/Gb+槲皮素組A549/Gb+EMT誘導劑組miR-101-inhibitor組槲皮素+miR-101-inhibitor組miR-NC組F n6 6 6 6 6 6 6 E-cadherin 1.00±0.09 0.39±0.03a 1.43±0.14ab 0.16±0.04abc 0.10±0.01abc 0.41±0.04ac 0.40±0.03ac 298.561＊＊N-cadherin 1.01±0.10 2.41±0.24a 0.44±0.04ab 2.99±0.19abc 2.91±0.20abc 2.40±0.16ac 2.44±0.19ac 192.489＊＊Vimentin 1.04±0.09 2.33±0.19a 0.57±0.05ab 2.85±0.20abc 2.80±0.21abc 2.30±0.19ac 2.33±0.18ac 162.612＊＊IC50（nmol/L）6.70±0.60 99.33±2.97a 26.32±0.49ab 169.38±4.77abc 166.77±4.83abc 98.18±2.50ac 97.90±2.63ac 2368.450＊＊IR 1.00±0.00 14.89±1.42a 3.95±0.20ab 25.29±1.62abc 24.84±1.60abc 14.74±1.39ac 14.60±1.34ac 329.579＊＊

Tab.5 Comparison of miR-101 and EZH2,TGF-β1,p-SMAD4/SMAD4 protein expression levels after miR-101 inhibition between the seven groups表5 抑制miR-101后各組細胞miR-101及EZH2、TGF-β1、p-SMAD4/SMAD4蛋白表達水平比較 （±s）

Tab.5 Comparison of miR-101 and EZH2,TGF-β1,p-SMAD4/SMAD4 protein expression levels after miR-101 inhibition between the seven groups表5 抑制miR-101后各組細胞miR-101及EZH2、TGF-β1、p-SMAD4/SMAD4蛋白表達水平比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與A549組比較，b與A549/Gb組比較，c與A549/Gb+槲皮素組比較，P＜0.05。

組別A549組A549/Gb組A549/Gb+槲皮素組A549/Gb+EMT誘導劑組miR-101-inhibitor組槲皮素+miR-101-inhibitor組miR-NC組F n6 6 6 6 6 6 6 miR-101 1.08±0.09 0.36±0.03a 1.76±0.17ab 0.10±0.01abc 0.11±0.01abc 0.34±0.03ac 0.30±0.02ac 404.736＊＊EZH2 1.04±0.09 2.27±0.19a 0.64±0.06ab 2.74±0.20abc 2.70±0.21abc 2.21±0.19ac 2.25±0.22ac 128.908＊＊TGF-β1 1.01±0.09 2.44±0.24a 0.38±0.03ab 2.99±0.28abc 2.94±0.24abc 2.40±0.21ac 2.42±0.22ac 141.142＊＊p-SMAD4/SMAD4 1.17±0.08 2.09±0.20a 0.75±0.07ab 2.62±0.19abc 2.64±0.20abc 2.01±0.18ac 2.06±0.14ac 116.861＊＊

Fig.5 Western blot assay of EZH2,TGF-β1,p-SMAD4/SMAD4 protein expression in each group圖5 各組細胞EZH2、TGF-β1、p-SMAD4/SMAD4蛋白表達水平免疫印跡圖

3 討論

NSCLC占肺癌的85%［1］。EMT作為引起NSCLC耐藥性產生的關鍵因素也逐漸受到臨床的關注。研究認為，EMT可賦予NSCLC細胞更高的侵襲能力，從而限制癌細胞的化療療效［11］。Assani等［12］發(fā)現(xiàn)EMT調節(jié)可改變肺癌和乳腺癌細胞對化療的抵抗性，用EMT誘導劑促進EMT特性增加的同時，可降低化療藥物治療的敏感性；反之，抑制EMT進程，可提高癌細胞對化療藥物的敏感性，證實EMT是癌細胞耐藥性產生的關鍵因素。本研究用EMT誘導劑進一步增強A549及A549/Gb細胞EMT特性（Ecadherin降低，N-cadherin及Vimentin表達升高）后，A549及A549/Gb細胞表現(xiàn)出更強的耐藥性，IC50及IR進一步升高，證實EMT增強可促進癌細胞耐藥性產生。槲皮素對NSCLC細胞EMT進程有抑制作用，且槲皮素可增強NSCLC細胞對X線輻射及紫杉醇化療等治療敏感度［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素降低A549及A549/Gb細胞EMT進程的同時，其對Gb的耐藥性也明顯降低，而槲皮素與EMT誘導劑聯(lián)合應用后，槲皮素抑制A549細胞耐藥性作用被顯著削弱，證實槲皮素降低A549細胞對Gb的耐藥性作用可能與抑制EMT進程有關。

EZH2不僅可直接結合E-cadherin并抑制其轉錄而促進EMT進程［15］，還可通過激活TGF-β/SMAD4通路，進一步促進EMT進程，產生更強的耐藥性［16］。另外EZH2還是重要的耐藥基因，研究證實，EZH2可直接調控或結合Schlafen家族成員11（SLFN11）基因的結合位點，使其降解及抑制化學抗性基因作用減弱、癌細胞DNA損傷及修復作用增強，而產生耐藥性［17］。Murai等［18］認為腫瘤細胞缺乏SLFN11基因是引起癌細胞對DNA合成抑制劑如Gb、阿糖胞苷等化療藥物敏感性降低的關鍵原因，用EZH2組蛋白抑制劑降低EZH2，重新激活SLFN11，是提高化療藥物殺滅癌細胞效果的重要措施。本研究發(fā)現(xiàn)，A549及A549/Gb細胞EMT特性及耐藥性升高的過程中，EZH2、EMT活化途徑TGF-β/SMAD4也隨之升高，證實EZH2參與EMT及耐藥性產生過程。

miRNA在EMT及耐藥性產生過程中發(fā)揮重要作用。EMT活化可引起多種miRNA的異常表達，介導耐藥性產生，miRNA中的miR-101在多種癌細胞中表達下調，且其低表達與癌細胞EMT升高及耐藥性產生關系密切［19］。Jiang等［20］發(fā)現(xiàn)，miR-101可靶向抑制EZH2表達，降低結腸癌細胞EMT進程。本研究發(fā)現(xiàn)，A549及A549/Gb細胞EMT特性及耐藥性升高的過程中，miR-101表達降低，單獨下調miR-101表達或加入EMT誘導劑后，EZH2表達升高，A549及A549/Gb細胞耐藥性及EMT特性均升高，證實miR-101/EZH2軸也參與細胞EMT介導的耐藥性產生過程。槲皮素降低A549及A549/Gb細胞耐藥性及EMT進程作用的同時，miR-101表達升高，EZH2表達降低，提示槲皮素逆轉EMT介導的耐藥性產生作用可能與上調miR-101、抑制EZH2有關。下調miR-101或誘導EMT均可逆轉槲皮素的上述作用。

綜上所述，槲皮素可通過上調miR-101、抑制EZH2表達，改善EMT介導的NSCLC細胞耐藥性產生。這為闡明槲皮素抗肺癌細胞耐藥性產生的靶向調控機制提供了一定參考。肺癌耐藥性及EMT發(fā)生機制復雜，涉及多個miRNA及多條通路共同調節(jié)。槲皮素緩解肺癌細胞EMT，阻斷耐藥性產生的其他機制有待進一步探究。