蘇靜克，蘇靜華，韓 寧，田蕭羽，黨瑞杰，馮 晉，耿燕秋

骨質(zhì)疏松癥是一種常見的代謝性骨病，多發(fā)于老年人和絕經(jīng)后女性，骨質(zhì)疏松患者的支持性骨小梁數(shù)目減少、質(zhì)量下降，極易發(fā)生骨折。隨著我國人口老齡化的不斷加深，老齡性骨質(zhì)疏松癥的患病率呈上升的趨勢，防治老齡性骨質(zhì)疏松對于提高老年人的生活質(zhì)量具有重要意義。目前治療骨質(zhì)疏松的藥物主要有雌激素替代物，選擇性激素受體調(diào)節(jié)劑，二膦酸鹽和降鈣素等。由于這些藥物的臨床效果有限，而且諸如閉經(jīng)、子宮內(nèi)膜癌、皮疹、房顫等副作用限制了其臨床應(yīng)用。因此，迫切需要尋找對于防治骨質(zhì)疏松安全且有效的替代藥物。精脒(Spermidine)是一種廣泛分布于自然界的多胺類化合物。既往動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， Spermidine能延長小鼠壽命并緩解老年性心肌肥大，通過激活A(yù)MPK緩解非酒精性脂肪肝病，減緩老齡果蠅的記憶下降。臨床研究也表明，隨著年齡增長，體內(nèi)的Spermidine水平呈下降趨勢；而且增加含Spermidine豐富食物的攝入能降低因心血管疾病和腫瘤導(dǎo)致的死亡。但Spermidine能否緩解老齡性骨質(zhì)疏松臨床研究較少。本研究擬探討Spermidine對老齡小鼠股骨微結(jié)構(gòu)的影響，為臨床上防治老年性骨質(zhì)疏松提供新靶點(diǎn)及新藥物。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器 選取21月齡雄性SPF級C57BL/6J老齡小鼠20只，體質(zhì)量27～33 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。Spermidine購自美國Sigma公司； 骨源性堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)試劑盒(美國MyBioSource公司)；LabMaster 呼吸代謝分析系統(tǒng)(德國 TSE 公司)；AU5800型全自動生化分析儀(美國BeckMan公司)；2104 Envision多功能酶標(biāo)儀(美國PerkinElmer公司)；micro-CT(瑞士SCANCO公司)。

1.2 動物分組及干預(yù) 小鼠在解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心清潔級環(huán)境中喂養(yǎng)，環(huán)境溫度(24±1)℃，相對濕度(65±5)%，光照12 h/d。所有動物單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。動物購回后首先適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，然后按體重大小排序，奇數(shù)納入對照組(Vehicle，=10)，偶數(shù)納入實(shí)驗(yàn)組(Spermidine，=10)。Spermidine組老齡小鼠在飲水中3 mmol/L的spermidine，劑量參照文獻(xiàn)[7]，干預(yù)時間為12周。

1.3 體質(zhì)量測量與生化指標(biāo)檢測 每周測量1次各組小鼠的體質(zhì)量。干預(yù)結(jié)束前24 h，將兩組小鼠置于呼吸代謝籠中，禁食但不禁水，然后收集全部尿液。1500 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min，吸取上清液放入液氮中保存。干預(yù)結(jié)束時，對老齡小鼠按60 mg/kg的劑量腹腔注射1%戊巴比妥進(jìn)行麻醉，剪毛、消毒皮膚、開胸，直視下心臟取血，快速將血液注入黃帽真空促凝采血管，待血液凝固后析出血清，置于液氮中保存。使用全自動生化分析儀檢測鈣、磷濃度，采用ELISA法檢測血清中骨源性ALP的濃度。

1.4 micro-CT分析股骨微結(jié)構(gòu) 取各只小鼠的右側(cè)股骨，清理表面皮膚，剝離附著的肌肉組織，浸入至少20倍體積的4%多聚甲醛液中固定，置于4 ℃環(huán)境中保存。老齡小鼠股骨的掃描參數(shù)為：電壓80 kV，電流115 μA，分辨率9 μm。選取遠(yuǎn)心端股骨生長板最低點(diǎn)0.15 mm厚度的骨質(zhì)進(jìn)行三維重建并使用工作站軟件對感興趣的區(qū)域(DOI)進(jìn)行測量分析，分析指標(biāo)包括：骨小梁相對骨體積(trabecular bone volume per tissue volume, Tb.BV/TV)，骨小梁數(shù)目(trabecular number, Tb.N)，骨小梁間隙(trabecular separation, Tb.Sp)，骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)，骨密度(bone mineral density, BMD)，皮質(zhì)骨厚度(cortical thickness, Ct.Th)，骨外膜周長(periosteal perimeter, Ps.Pm)和骨內(nèi)膜周長(endosteal perimeter, Es.Pm)。

2 結(jié) 果

2.1 Spermidine對老齡小鼠體重的影響 與Vehicle組相比，Spermidine干預(yù)全程不影響老齡小鼠的體重，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 Spermidine對老齡小鼠體質(zhì)量的影響

2.2 Spermidine對老齡小鼠骨代謝相關(guān)指標(biāo)的影響 與Vehicle組相比，Spermidine干預(yù)全程不影響尿鈣、尿磷和血磷水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但Spermidine干預(yù)可使老齡小鼠血鈣與血ALP水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05，表2)。

表2 Spermidine對老齡骨代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

2.3 Spermidine對老齡小鼠股骨微結(jié)構(gòu)的影響 使用micro-CT對各組老齡小鼠股骨進(jìn)行掃描重建(圖1A)并對其微結(jié)構(gòu)進(jìn)行測量分析(圖1B)，結(jié)果顯示：與Vehicle組老齡小鼠相比，Spermidine干預(yù)明顯提高老齡小鼠的Tb.BV/TV、Tb.N、Tb.Th和BMD，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)；顯著降低老齡小鼠Tb.Sp(<0.05)；而對Ct.Th、Ps.Pm和Es.Pm無影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A.股骨水平面三維重建；B.Tb.BV/TV, 骨小梁相對體積；Tb.N, 骨小梁數(shù)目；Tb.Sp, 骨小梁間隙；Tb.Th, 骨小梁厚度；BMD, 骨密度；Ct.Th, 皮質(zhì)骨厚度；Ps.Pm, 骨外膜周長；Es.Pm, 骨內(nèi)膜周長,與Vehicle組比較，①P<0.05圖1 Spermidine對老齡小鼠股骨微結(jié)構(gòu)的影響

3 討 論

老齡性骨質(zhì)疏松是一種衰老退行性疾病，骨形成和骨分解作用均降低，即骨轉(zhuǎn)換率降低。本研究以老齡小鼠為研究對象，探討Spermidine干預(yù)對老齡小鼠骨代謝和股骨微結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Spermidine可升高老齡小鼠血鈣與血ALP水平，增加骨小梁的數(shù)目并提高骨小梁的質(zhì)量。正常血鈣、血磷濃度的維持在很大程度上依賴于血液與骨組織之間鈣、磷的相互交換，血鈣、血磷升高往往提示骨合成處于活躍狀態(tài)，而尿鈣、尿磷濃度升高則預(yù)示著骨分解作用增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，Spermidine干預(yù)能升高血鈣水平，但對老齡鼠尿中鈣和磷的水平均無影響，提示Spermidine能促進(jìn)骨合成，但骨分解代謝無影響。骨合成初期，成骨細(xì)胞分泌的膠原纖維交織成網(wǎng)狀。骨合成晚期，礦物鹽沉積在膠原纖維網(wǎng)上形成礦物鹽晶體。ALP可升高骨組織內(nèi)礦物鹽濃度，促進(jìn)骨組織礦化。因此，血ALP水平升高提示新骨礦化活躍。本研究發(fā)現(xiàn)，Spermidine干預(yù)能提高老齡鼠血清中ALP的水平，這從另一個角度證實(shí)其能促進(jìn)骨合成。骨代謝平衡的保持依賴于成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成作用和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨分解作用，有研究顯示，Spermidine和精胺組成的多胺混合物能通過抑制破骨細(xì)胞活性增加去卵巢小鼠的骨量，造成這些研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同的原因可能是因?yàn)樵撗芯渴褂昧伺c本研究不同的實(shí)驗(yàn)動物模型。有研究表明，限制飲食導(dǎo)致的體重降低會伴隨因鈣、磷攝入不足引起的骨質(zhì)量下降，本實(shí)驗(yàn)中Spermidine促進(jìn)骨合成但并不影響老齡小鼠的體質(zhì)量。

骨折是由于骨強(qiáng)度降低，骨組織抵抗骨折風(fēng)險(xiǎn)能力下降導(dǎo)致的結(jié)果，而骨強(qiáng)度又取決于骨組織礦物鹽的含量和骨質(zhì)量。在micro-CT結(jié)果中，BMD值可反應(yīng)骨組織礦物鹽的含量。本研究結(jié)果顯示，Spermidine干預(yù)可提高老齡小鼠股骨BMD。骨質(zhì)量的評價指標(biāo)主要包括：Tb.BV/TV，Tb.N，Tb.Sp，Tb.Th，Ct.Th，Ps.Pm和Es.Pm等，其中Tb.Sp是預(yù)測老齡性骨折發(fā)生的關(guān)鍵指標(biāo)，Tb.Sp增大與脆性骨折密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Spermidine干預(yù)可降低老齡小鼠股骨的Tb.Sp，提高老齡小鼠股骨骨礦物鹽的含量。但Spermidine干預(yù)對反應(yīng)皮質(zhì)骨質(zhì)量的指標(biāo)Ct.Th，Ps.Pm和Es.Pm均無影響，這可能是由于皮質(zhì)骨比松質(zhì)骨的骨轉(zhuǎn)換率更低，對外界的刺激不敏感造成的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Spermidine能夠促進(jìn)骨合成、緩解老齡小鼠的骨質(zhì)疏松，因此提高老年人體內(nèi)的Spermidine水平可能是治療老齡性骨質(zhì)疏松癥的一種潛在治療手段。目前治療骨質(zhì)疏松的雙膦酸鹽類和降鈣素類藥物主要是通過抑制骨分解發(fā)揮作用，對骨轉(zhuǎn)換率低的骨質(zhì)疏松治療效果不佳。因此，通過促進(jìn)骨合成發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松作用的藥物可能更具有市場前景，還將進(jìn)行更深入地研究。