丁靈濤，劉東方，黃建忠

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心， 福建 福州 350108)

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone, PQQ)是繼煙酰胺和核黃素之后發(fā)現(xiàn)的第3種輔酶[1-2]，可以在氧化還原反應(yīng)中參與電子傳遞[3]，具有特殊的生物活性和生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，PQQ催化氧化還原反應(yīng)能力極強(qiáng)[4]，可以清除自由基[5-7]，修復(fù)氧化損傷的神經(jīng)細(xì)胞[8]，刺激神經(jīng)因子增長(zhǎng)[9]，促進(jìn)線粒體合成[10]，提高生物體生長(zhǎng)和代謝水平[11]。匡煒等[12]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)利用PQQ對(duì)水稻種子進(jìn)行浸種處理后直播，并在始穗期葉面噴灑PQQ，可顯著提高結(jié)實(shí)率；李震等[13]研究發(fā)現(xiàn)灌根和施用一定量的PQQ，可以顯著改良土壤理化性質(zhì)；焦子偉等[14]通過(guò)試驗(yàn)證明PQQ處理可以促進(jìn)玉米生長(zhǎng)。因此，PQQ在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)和化妝品等領(lǐng)域有極為廣泛的應(yīng)用前景。

目前，合成PQQ的方法主要有化學(xué)合成[15]和生物合成[16]兩種方法。其中，化學(xué)合成法存在工藝路線復(fù)雜、生產(chǎn)效率較低、副產(chǎn)物較多、下游純化成本較高等問(wèn)題。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)PQQ則有成本低、反應(yīng)條件溫和、發(fā)酵過(guò)程添加物簡(jiǎn)單、易于分離純化等諸多優(yōu)勢(shì)，成為工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)選策略。研究表明，用于合成PQQ的菌株多為革蘭氏陰性菌[17-19]，尤其以甲基營(yíng)養(yǎng)菌的合成能力最強(qiáng)，雖然現(xiàn)階段有關(guān)PQQ合成的代謝途徑已基本闡明[20]，但通過(guò)代謝工程手段改造原始菌株依然存在不小的困難。因此，目前提高PQQ產(chǎn)量的方法以篩選高產(chǎn)菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化為主，比如柯崇榕[21]通過(guò)高濃度甲醇誘變選育出了1株P(guān)QQ高產(chǎn)菌株；張靜等[22]以HyphomicrobiumdenitrificansCGMCC 1.12893為出發(fā)菌，通過(guò)ARTP誘變篩選到1株P(guān)QQ高產(chǎn)突變菌株，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后將產(chǎn)量提高了3.4倍。

然而，這些高產(chǎn)突變菌株實(shí)際發(fā)酵周期很長(zhǎng)，勢(shì)必影響實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)總量，究其原因無(wú)非是菌株延滯期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間較長(zhǎng)、PQQ生產(chǎn)啟動(dòng)緩慢等主要因素。本研究以脫氮生絲微菌 FJNU-R8(HyphomicrobiumdenitrificansFJNU-R8)為出發(fā)菌株，仔細(xì)探究了不同的碳氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)和PQQ合成的影響，同時(shí)分析了菌株生長(zhǎng)和PQQ合成的相互聯(lián)系，以期為實(shí)際發(fā)酵策略調(diào)整提供理論上的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1菌株 本試驗(yàn)所選用的菌株為脫氮生絲微菌FJNU-R8，由本課題組從污水中篩選并誘變選育后獲得，保藏于工業(yè)微生物教育部研究中心。

1.1.2培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：4 g·L-1(NH4)2SO4、3 g·L-1KH2PO4、3 g·L-1Na2HPO4、1.6 g·L-1MgSO4·7H2O、25 mg·L-1CaCl2、5 mg·L-1ZnSO4、0.5 mg·L-1FeSO4、5.0 g·L-1CH3OH、0.4 mL·L-1微量元素和1 mL·L-1維生素；發(fā)酵培養(yǎng)基：2 g·L-1(NH4)2SO4、3 g·L-1KH2PO4、3 g·L-1Na2HPO4、1.6 g·L-1MgSO4·7H2O、25 mg·L-1CaCl2、5 mg·L-1ZnSO4、0.5 mg·L-1FeSO4、20.0 g·L-1CH3OH、0.4 mL·L-1微量元素和1 mL·L-1維生素；微量元素：15 mg·L-1NaCl、5 mg·L-1CuSO4·5H2O、5 mg·L-1MnSO4·4H2O、0.3 mg·L-1KI、0.1 g·L-1COCl2·6H2O、3 g·L-1H3BO3；維生素配方：2 g·L-1核黃素、4 g·L-1鹽酸吡哆素、4 mg·L-1鹽酸硫胺素、2 g·L-1葉酸、400 mg·L-1煙酸、20 mg·L-1對(duì)氨基苯甲酸、40 mg·L-1泛酸鈣、2 mg·L-1生物素、20 mg·L-1肌醇。所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3儀器與設(shè)備 雙層恒溫?fù)u床ZWB-3212B購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司；高效液相色譜儀e2695購(gòu)自沃特世科技(上海)有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-1800購(gòu)自日本島津公司；貝克曼J-26冷凍離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)貝克曼有限公司；科瑞峰超純水系統(tǒng)SP-D1-20L購(gòu)自四川德立世科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1搖瓶培養(yǎng)條件 從-80℃冰箱中取出保種管，在平板上稀釋涂布，培養(yǎng)7～8 d。挑取單菌落在平板上培養(yǎng)3～4 d，全部洗下并接種于100 mL/500 mL的液體種子培養(yǎng)基中，于220 r·min-1、30℃條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，按3.5%(V/V)接種量轉(zhuǎn)接至擋板搖瓶中，振蕩培養(yǎng)[23]。

1.2.2不同碳氮源搖瓶培養(yǎng)基成分 探究單一碳源和氮源對(duì)菌株OD650和PQQ產(chǎn)量的影響。(1)碳源包括：甲醇、乙醇、甘油、葡萄糖，以碳原子濃度0.625 mol·L-1(合甲醇濃度20 g·L-1)為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)添加量；(2)氮源包括：硫酸銨、硝酸銨、氨水、蛋白胨，以氮原子濃度0.030 mol·L-1(合硫酸銨濃度2 g·L-1)為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)添加量。

1.2.3不同復(fù)合碳源和氮源配比設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)不同配比復(fù)合碳源和氮源，(1)復(fù)合碳源∶甲醇和甘油配比為20∶80、40∶60、60∶40、80∶20；(2)復(fù)合氮源∶硫酸銨和蛋白胨配比為20∶80、40∶60，60∶40，80∶20。

1.2.4復(fù)合碳源和氮源不同添加量的設(shè)計(jì) (1)基于甲醇∶甘油(20∶80)的復(fù)合碳源，設(shè)計(jì)該配比下總碳源不同的添加量(5、10、20、30、40 g·L-1；等比換算甲醇濃度)；(2)基于蛋白胨∶硫酸銨(40∶60)的復(fù)合氮源，設(shè)計(jì)該配比下總氮源不同的添加量(1、2、3、4、5 g·L-1；等比換算硫酸銨濃度)。

1.3 測(cè)定方法

取樣時(shí)間點(diǎn)：48 h前每隔6 h取一次樣，48 h后每隔24 h取1次樣；每次取樣均測(cè)OD650，36 h后的樣品采用高效液相色譜儀測(cè)PQQ的含量。(1)生物量測(cè)定方法：使用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)650 nm下測(cè)定搖瓶菌液吸光光度值OD650，控制OD650范圍在0.2～0.8以內(nèi)。(2)PQQ含量測(cè)定方法：采用高效液相色譜儀對(duì)PQQ含量進(jìn)行檢測(cè)[24]。將發(fā)酵液10 000 r·min-1、離心3 min，取上清液用0.22 μm的水系膜過(guò)濾。HPLC條件為色譜柱UItimate XB C18 4.6 mm×250 mm(5 μm)。檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm、柱溫40℃、流動(dòng)相為V(水+1‰ TFA)∶V(乙腈+1‰ TFA)=85∶15、流速為0.5 mL·min-1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一碳源和單一氮源對(duì)菌株OD650和PQQ產(chǎn)量的影響

2.1.1單一碳源對(duì)菌株OD650和PQQ產(chǎn)量的影響 由圖1、2可知，以乙醇或葡萄糖為單一碳源時(shí)，菌株幾乎不會(huì)生長(zhǎng)；以甲醇為單一碳源時(shí)，菌株在40 h生長(zhǎng)至穩(wěn)定期并保持4左右的OD650，隨后大量合成PQQ，在118 h時(shí)PQQ產(chǎn)量為43 mg·L-1；以甘油為單一碳源時(shí)，菌株在長(zhǎng)達(dá)50 h延滯期后開(kāi)始生長(zhǎng)，并在118 h OD650達(dá)到9.8，但是不生產(chǎn)PQQ。說(shuō)明甘油的利用需要菌株更長(zhǎng)的準(zhǔn)備時(shí)間，然后優(yōu)先利用碳源于細(xì)胞碳骨架的構(gòu)建以增加OD650。綜合甘油為碳源時(shí)菌株的OD650最高和甲醇為碳源時(shí)菌株P(guān)QQ產(chǎn)量最高，設(shè)計(jì)以甲醇和甘油復(fù)配的復(fù)合碳源。

圖1 單一碳源對(duì)菌株OD650的影響Fig.1 Effect of the sole carbon source on the OD650 of strain

圖2 單一碳源對(duì)菌株P(guān)QQ產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of the sole carbon source on the PQQ yield of strain

2.1.2單一氮源對(duì)菌株OD650和PQQ產(chǎn)量的影響 由圖3、4可知，以氨水為單一氮源時(shí)，菌株幾乎不會(huì)生長(zhǎng)；以硫酸銨或硝酸銨為單一氮源時(shí)，菌株在50 h生長(zhǎng)至穩(wěn)定期并保持OD650，隨后在118 h時(shí)，PQQ產(chǎn)量分別為29.8、17.0 mg·L-1；以蛋白胨為單一氮源時(shí)，菌株前期生長(zhǎng)速度更快并在70 h生長(zhǎng)至OD650(7.3)的穩(wěn)定期，但是幾乎沒(méi)有PQQ的合成。因此，設(shè)計(jì)以硫酸銨和蛋白胨混合的復(fù)合氮源，以期提高前期菌株的生長(zhǎng)速度，同時(shí)兼顧PQQ的產(chǎn)量。

圖3 單一氮源對(duì)菌株OD650的影響Fig.3 Effect of the sole nitrogen source on the OD650 of strain

圖4 單一氮源對(duì)菌株P(guān)QQ產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of the sole nitrogen source on the PQQ yield of strain

2.2 不同配比復(fù)合碳源和復(fù)合氮源對(duì)菌株OD650和PQQ產(chǎn)量的影響

2.2.1不同配比復(fù)合碳源對(duì)菌株OD650值的影響 由圖5、6可知，PQQ合成菌株在不同配比的復(fù)合碳源培養(yǎng)基中的前期生長(zhǎng)速度均高于以甲醇或甘油為單一碳源的培養(yǎng)基，且菌株的最終OD650高于以甲醇為單一碳源的培養(yǎng)基，說(shuō)明甘油的添加確實(shí)可以提高OD650，甘油的比例越高，最終OD650也越高。但只有以甲醇為單一碳源時(shí)，可以在120 h檢測(cè)到PQQ產(chǎn)量為53 mg·L-1；在其他復(fù)合碳源的培養(yǎng)基中，僅有甲醇∶甘油(20∶80)的復(fù)合碳源檢測(cè)出5 mg·L-1的PQQ產(chǎn)量。上述結(jié)果表明，復(fù)合碳源可以有效提高OD650，但是干擾了PQQ合成；而以甲醇為單一碳源時(shí)，OD650最低，但是PQQ產(chǎn)量最高。為了探討是否因?yàn)楦视偷募尤雽?dǎo)致菌株優(yōu)先利用碳源用于自身碳骨架的構(gòu)建(更高的OD650)，造成PQQ合成途徑碳源供給不足，后續(xù)試驗(yàn)以甲醇∶甘油為20∶80的比例出發(fā)探討復(fù)合碳源不同添加量的影響。

圖5 不同配比復(fù)合碳源對(duì)OD650的影響Fig.5 Effects of different ratios of composite carbon sources on OD650

圖6 不同配比復(fù)合碳源對(duì)PQQ產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of different ratios of composite carbon sources on the PQQ yield

2.2.2不同配比復(fù)合氮源對(duì)菌株OD650和PQQ產(chǎn)量的影響 由圖7、8可知，PQQ合成菌株在不同復(fù)合氮源培養(yǎng)基中的前期生長(zhǎng)速度均高于以硫酸銨或蛋白胨為單一氮源時(shí)的生長(zhǎng)速度。其中蛋白胨∶硫酸銨為60∶40或80∶20時(shí)，生產(chǎn)菌株在120 h時(shí)的OD650分別為8.6和8.5，遠(yuǎn)高于同時(shí)期以硫酸銨為單一氮源時(shí)的OD650(4.3)。從PQQ的合成能力分析，120 h時(shí)蛋白胨∶硫酸銨為40∶60的PQQ產(chǎn)量為65 mg·L-1，而同時(shí)期下以硫酸銨為單一氮源的PQQ產(chǎn)量?jī)H為42 mg·L-1，其余氮源培養(yǎng)基的PQQ產(chǎn)量均低于上述兩個(gè)條件。從生長(zhǎng)曲線和PQQ合成產(chǎn)量出發(fā)，探討蛋白胨∶硫酸銨為40∶60配比時(shí)不同添加量的影響。

圖7 不同配比復(fù)合氮源對(duì)OD650的影響Fig.7 Effects of different ratios of composite nitrogen sources on OD650

圖8 不同配比復(fù)合氮源對(duì)PQQ產(chǎn)量的影響Fig.8 Effects of different ratios of composite nitrogen sources on the PQQ yield

2.3 復(fù)合碳源和復(fù)合氮源不同添加量對(duì)菌株OD650和PQQ的影響

2.3.1復(fù)合碳源(甲醇∶甘油=20∶80)不同添加量對(duì)菌株OD650和PQQ產(chǎn)量的影響 由圖9、10可知，以甲醇∶甘油為20∶80的復(fù)合碳源時(shí)，在30 h時(shí)，兩個(gè)低濃度添加量(5、10 g·L-1)生長(zhǎng)明顯延滯，156 h時(shí)OD650僅為1.8和3.6，對(duì)應(yīng)的PQQ的產(chǎn)量為17和15 mg·L-1。高濃度添加量(20、30、40 g·L-1)條件下，培養(yǎng)40 h左右生長(zhǎng)減緩，大概經(jīng)過(guò)30 h后繼續(xù)生長(zhǎng)，添加濃度越高，最終的OD650也越高。濃度40 g·L-1條件下156 h時(shí)OD650可達(dá)10.8，對(duì)應(yīng)的PQQ產(chǎn)量?jī)H為8 mg·L-1。上述結(jié)果表明，添加甘油的復(fù)合碳源有利于PQQ生產(chǎn)菌株OD650的增加，且復(fù)合碳源的添加量越高， OD650也越高；復(fù)合碳源添加量的變化并不能有效提高PQQ產(chǎn)量，說(shuō)明不是由于碳源不足導(dǎo)致PQQ合成的降低，而是甘油的進(jìn)入影響了PQQ合成途徑，而且甘油添加濃度越高，對(duì)PQQ合成的干擾越大。此外，研究發(fā)現(xiàn)OD650基本穩(wěn)定的菌株P(guān)QQ產(chǎn)量高，推測(cè)菌株中后期穩(wěn)定的OD650更有利于PQQ的合成。

圖9 復(fù)合碳源不同添加量對(duì)OD650的影響Fig.9 Effect of different amount of composite carbon sources on OD650

圖10 復(fù)合碳源不同添加量對(duì)PQQ產(chǎn)量的影響Fig.10 Effect of different amount of composite carbon sources on the PQQ yield

圖11 復(fù)合氮源不同添加量對(duì)OD650的影響Fig.11 Effect of different amount of composite nitrogen sources on OD650

2.3.2復(fù)合氮源(蛋白胨∶硫酸銨=40∶60)不同添加量對(duì)菌株OD650和PQQ產(chǎn)量的影響 由圖11、12可知，在以蛋白胨∶硫酸銨為40∶60的復(fù)合氮源條件下，復(fù)合氮源不同添加量似乎對(duì)菌株的生長(zhǎng)和PQQ的合成影響很小。濃度1 g·L-1條件下，156 h的OD650為7.3，PQQ產(chǎn)量為11 mg·L-1；其余條件下156 h的OD650為5.5左右，PQQ產(chǎn)量為45 mg·L-1左右。由此推測(cè)，在碳源一定的情況下，只要維持基本氮源量，復(fù)合氮源的添加量不是影響菌株生長(zhǎng)和PQQ合成的關(guān)鍵因素。此外，研究發(fā)現(xiàn)OD650波動(dòng)明顯的菌株P(guān)QQ產(chǎn)量最低，推測(cè)菌株中后期穩(wěn)定的OD650更有利于PQQ的合成。

圖12 復(fù)合氮源不同添加量對(duì)PQQ產(chǎn)量的影響Fig.12 Effect of different amount of composite nitrogen sources on the PQQ yield

3 討論與結(jié)論

PQQ作為氧化還原酶的輔因子，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。目前，PQQ的合成以甲基營(yíng)養(yǎng)菌發(fā)酵為主，其產(chǎn)量的提高多依靠誘變篩選高性能菌株，缺乏基因工程的介入從而改造菌株實(shí)現(xiàn)PQQ產(chǎn)量的大幅提高，究其原因在于這類菌株體內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，很多相關(guān)的代謝途徑至今尚不明確，此外對(duì)其限制修飾系統(tǒng)[25]也鮮有研究，從而導(dǎo)致基因操作難度大幅度上升。雖然現(xiàn)在已經(jīng)有很多條件優(yōu)化[16]來(lái)進(jìn)一步提高PQQ的產(chǎn)量，卻難以實(shí)現(xiàn)大幅度的提升。

本研究從最基礎(chǔ)的碳氮源出發(fā)，探討了不同配比碳源和氮源對(duì)生絲微菌FJNU-R8生長(zhǎng)和PQQ合成的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，以甲醇為單一碳源時(shí)PQQ產(chǎn)量最高，但是最終OD650只有4.4，這個(gè)結(jié)果印證了PQQ是甲醇脫氫酶的輔酶，即在利用甲醇時(shí)需要大量的甲醇脫氫酶將甲醇轉(zhuǎn)化為甲醛，進(jìn)而進(jìn)入代謝途徑用于菌株物質(zhì)和能量的合成，因此菌株需要在較早時(shí)期積累PQQ。添加甘油后的復(fù)合碳源可以顯著提高最終OD650，但是檢測(cè)出PQQ的產(chǎn)量遠(yuǎn)低于以甲醇為單一碳源時(shí)的PQQ產(chǎn)量，這可能是由于甘油的添加影響了感知甲醇的雙組分系統(tǒng)[26-27]的信號(hào)傳遞，從而下調(diào)了甲醇脫氫酶甚至PQQ合成基因簇的表達(dá)。以硫酸銨為單一氮源時(shí)PQQ產(chǎn)量最高，但是最終OD650僅為4.2；添加蛋白胨的復(fù)合氮源可以提高菌株生長(zhǎng)速度和最終OD650，當(dāng)?shù)鞍纂恕昧蛩徜@為40∶60時(shí)還可以提高PQQ產(chǎn)量。PQQ的合成與生長(zhǎng)的關(guān)系為部分偶聯(lián)型，在中后期保持穩(wěn)定的OD650更有利于積累PQQ。

本研究發(fā)現(xiàn)甘油的添加可能干擾PQQ的合成，但并非完全阻遏PQQ生產(chǎn)，因此可以只考慮復(fù)合碳源提高總OD650，然后選用流加甲醇為單一碳源的方式積累PQQ。值得思考的是，混有甘油的復(fù)合碳源利用速度較慢，如何提高甘油的快速利用達(dá)到前期快速積累OD650仍需要進(jìn)一步探究。此外，復(fù)合碳源和復(fù)合氮源添加量的變化差異很大，如何調(diào)整合適的碳氮比使菌株前期專注于生長(zhǎng)，中后期專注于PQQ合成值得進(jìn)一步討論。在未來(lái)試驗(yàn)中，可以進(jìn)一步篩選合適的復(fù)合碳源和氮源并探討相應(yīng)的添加方式以期獲得更好的發(fā)酵策略，并在發(fā)酵中后期維持發(fā)酵總OD650從而實(shí)現(xiàn)PQQ產(chǎn)量的提高。