莫燦婷,唐 霽,謝漢興,蔣琰瑜,劉凱琪,謝萬著,唐紅珍

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

肥胖是由于機體脂肪過度堆積引起的慢性代謝性炎癥，又稱肥胖慢性炎癥[1]。白細胞介素-6(Interleukin- 6，IL-6)及M1型巨噬細胞與肥胖慢性炎癥的發(fā)生密切相關(guān)，臨床研究結(jié)果顯示，肥胖患者血清IL-6等炎癥因子明顯升高，使高血壓、動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)病風(fēng)險較正常人偏高[2]。此外，在動物實驗研究中發(fā)現(xiàn)，M1型巨噬細胞表面標志物iNOS可誘導(dǎo)胰島素抵抗，并引發(fā)肥胖[3]。肥胖慢性炎癥的發(fā)病分子機制十分復(fù)雜，目前尚未完全闡明。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)針刺可有效降低肥胖大鼠體質(zhì)量及血清IL-6含量[4]，本實驗通過針刺對肥胖大鼠脂肪組織iNOS及IL-6表達的影響，探討針刺改善肥胖慢性炎癥狀態(tài)的分子機制，為臨床治療肥胖提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

雄性SPF級SD大鼠共30只，體質(zhì)量(180±10)g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號:SCXK(湘)2019-0004。

1.2 主要實驗儀器及試劑

華佗牌φ0.20 mm×25 mm的一次性無菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，180322);TG16W型微量高速離心機( 湖南吉爾森科技發(fā)展有限公司);FluorChem E超靈敏全自動成像分析系統(tǒng)(德國，Leica Histocore公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(Biosharp公司，BL521A);HE染色試劑盒、山羊抗兔、Anti-iNOS及IL-6等蛋白抗體(索萊寶公司)。

2 方法

2.1 模型制備及分組

將30只SD雄性大鼠隨機分為兩組，正常組8只，造模組22只，分別予普通飼料、高脂飼料喂養(yǎng)，均不限量自由攝食飲水，以造模組大鼠體質(zhì)量超出同期正常組大鼠平均體質(zhì)量的20%為造模成功。隨后遴選出16只體質(zhì)量達標的肥胖大鼠，并隨機分為模型組、針刺組，每組各8只。

2.2 各組干預(yù)方法

實驗采用本課題組前期研發(fā)的固定器固定大鼠，正常組、模型組按照針刺組要求進行等時固定；針刺組《大鼠穴位圖譜》予以“關(guān)元、中脘，雙側(cè)足三里、天樞、豐隆和陰陵泉”等穴位針刺，選穴定位根據(jù)《大鼠穴位圖譜》[5]，采用華佗牌φ0.20 mm×25 mm的一次性無菌針灸針，行捻轉(zhuǎn)補法1 min，隔10 min行針1次，留針30 min，1次/d，6 d為1個療程，每個療程間隔1 d，共4個療程，每7 d測量1次體質(zhì)量。

2.3 各組大鼠內(nèi)臟脂肪濕重

麻醉處死大鼠后，迅速分離其腎周脂肪、腸周脂肪及附睪脂肪等內(nèi)臟脂肪，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重，計算其內(nèi)臟脂肪濕重。

2.4 各組大鼠附睪脂肪組織的HE染色

剪取一部分附睪脂肪組織放入10%中性福爾馬林固定12 h后，包埋成蠟塊，切片，按照HE染色試劑盒說明書進行染色，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，用中性樹膠封片，晾干，在顯微鏡下放大40倍后拍照，并計算完整脂肪細胞的面積。

2.5 附睪脂肪組織iNOS及IL-6的Western Blot檢測

取每只大鼠附睪脂肪組織樣本20 mg，加入組織裂解液后勻漿，離心后取上清，按BCA蛋白濃度測定試劑盒步驟，檢測蛋白濃度，以 GAPDH 為內(nèi)參，采用SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，分別孵育I抗(iNOS、IL-6的稀釋比例分別為1∶2 000、1∶4 000)，Ⅱ抗(1∶20 000)。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，F(xiàn)luor Chem E全自動成像分析系統(tǒng)分析條帶，計算灰度值。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 針刺治療對肥胖大鼠體質(zhì)量及內(nèi)臟脂肪濕重的影響

針刺治療后，與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量及內(nèi)臟脂肪濕重顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，針刺組大鼠體質(zhì)量及內(nèi)臟脂肪濕重顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1～2。

表1 各組大鼠治療后的平均體質(zhì)量

表2 各組大鼠內(nèi)臟脂肪濕重

3.2 針刺對肥胖大鼠脂肪細胞的影響

各組大鼠附睪周圍脂肪組織HE染色結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠的脂肪細胞平均面積明顯增大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，血管、纖維等結(jié)締組織增多，與模型組比較，針刺組脂肪細胞平均面積顯著減小，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3、圖1。

表3 各組大鼠附睪脂肪細胞平均面積

3.3 針刺對肥胖大鼠附睪脂肪組織中iNOS及IL-6蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠附睪脂肪組織中iNOS及IL-6蛋白的表達均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與模型組比較，針刺組大鼠附睪脂肪組織中iNOS及IL-6蛋白的表達均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖2。

表4 各組大鼠附睪脂肪組織iNOS/GAPDH、IL-6/GAPDH的比值

4 討論

脂肪組織，由成熟脂肪細胞、非脂肪細胞、結(jié)締組織基質(zhì)、血管及神經(jīng)細胞組成，是人體能量平衡的重要調(diào)節(jié)器，具有分泌IL-6等多種促炎性因子及抗炎性因子的功能[6]?，F(xiàn)有研究表明，炎性因子大量分泌、巨噬細胞浸潤和脂肪組織重塑等是肥胖慢性炎癥的幾大主要特征[7-8]。脂肪組織長期的炎癥狀態(tài)，會使脂肪組織的血管、纖維等結(jié)締組織適應(yīng)性增多，導(dǎo)致脂肪組織重塑甚至纖維化，損壞脂肪組織的正常生理功能，進一步加劇肥胖的發(fā)生，并形成惡性循環(huán)的局面[9]。巨噬細胞主要分M1型及M2型，其中，Ml型巨噬細胞可分泌促炎性細胞因子IL-6[10]，并參與誘導(dǎo)肥胖慢性炎癥的發(fā)生。此外，有研究表明慢性炎癥參與機體胰島素抵抗的發(fā)生。孔祥等[11]發(fā)現(xiàn)脂肪組織的炎癥會促進細胞的凋亡，大量招募單核巨噬細胞，吞噬壞死的蛋白質(zhì)及細胞器，形成“冠狀結(jié)構(gòu)”(Crown-likestructures,CLS)，在這一過程中M1型巨噬細胞的表達顯著增加，又進一步促進IL-6的分泌，并抑制胰島素信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致機體的糖脂代謝障礙。王翠娟等[12]發(fā)現(xiàn)腹型肥胖患者的IL-6水平升高導(dǎo)致胰島素穩(wěn)態(tài)失衡，使機體處于糖脂代謝紊亂的狀態(tài)。郜敏等[13]體外實驗研究發(fā)現(xiàn)高糖條件可誘導(dǎo)MI型巨噬細胞標志物iNOS的表達升高，予胰島素作用后又可下調(diào)其表達水平，這一結(jié)果提示M1型巨噬細胞可能是促進胰島素抵抗的重要危險因子。本實驗研究結(jié)果顯示，肥胖大鼠脂肪細胞增大、血管和纖維等結(jié)締組織增多，iNOS及IL-6的蛋白表達升高，可見其脂肪組織存在慢性炎癥，經(jīng)針刺治療后，能顯著減少脂肪細胞堆積、下調(diào)iNOS及IL-6的蛋白表達，有效降低肥胖機體內(nèi)臟脂肪濕重及體質(zhì)量，這一結(jié)果與張思依等[14]的研究結(jié)果相似。此外，課題組前期的實驗結(jié)果顯示針刺能顯著降低肥胖大鼠血清胰島素及IL-6等炎癥因子的水平[4,15]。因此綜上述研究結(jié)果可初步證實，針刺能有效降低肥胖大鼠的體質(zhì)量，改善脂肪組織血管、纖維等結(jié)締組織增生及脂肪細胞增大的現(xiàn)象，其機制可能與針刺下調(diào)脂肪組織中M1型巨噬細胞及IL-6的蛋白表達、抑制脂肪組織慢性炎癥和改善胰島素抵抗以促進機體糖脂的正常代謝有關(guān)。

中醫(yī)認為“肥人多痰濕”，機體的水液代謝障礙是導(dǎo)致痰濕形成的主要原因，本實驗研究針刺組方中，關(guān)元有下丹田之稱，既是足三陰經(jīng)及任脈之會，也是小腸之募，可培補元氣，增強小腸分清泌濁的功能，足三里、陰陵泉是脾胃之合穴及下合穴，可增強脾胃的運化功能，合絡(luò)穴豐隆則更顯祛濕化痰之功；天樞為大腸之募，可增強大腸主津傳化糟粕的功能。以上諸穴合用，既可固本培元，又可健脾和胃，促進機體水液的正常代謝，可有效地防止痰濕積聚而導(dǎo)致肥胖。本研究發(fā)現(xiàn)，針刺能有效調(diào)節(jié)M1型巨噬細胞、IL-6的過度表達，改善肥胖機體的慢性炎癥，恢復(fù)機體的正常代謝功能，減少脂質(zhì)積累，以達到治療肥胖的目的。 結(jié)合前文的研究結(jié)果提示，從控制肥胖慢性炎癥的新視角改善胰島素抵抗，可為臨床治療肥胖癥提供新靶點。但關(guān)于針刺如何通過調(diào)節(jié)M1型巨噬細胞及IL-6的表達以抑制肥胖機體的慢性炎癥，改善胰島素抵抗的信號分子機制尚未明確，仍需在今后進一步深入研究。