李鵬飛，任俊華，蘇 滑，楊來福

(1.開封市中心醫(yī)院，河南 開封 475000;2.鄭州大學第五附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000;3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453100)

腦卒中是一種驟然起病的腦循環(huán)障礙性疾病，已成為全世界第二大致死性疾病，且近年來在我國發(fā)病率逐漸上升[1]。資料顯示[2]，超過60 %的腦卒中患者存在認知障礙，嚴重影響功能恢復及日常生活。研究表明[3-4]，腦卒中病理損傷后病灶周圍血管新生是形成新腦血管腦絡的基礎，且是決定缺血性神經(jīng)元存活的關鍵因素，有利于挽救缺血半暗帶，與認知障礙程度密切相關。目前溶栓是臨床治療腦卒中的主要方式，但僅適用于時間窗內(nèi)患者，且副作用較大，因此探尋更為安全、有效的治療方式成為研究熱點。中醫(yī)傳統(tǒng)針刺治療承載著深厚的理論及實踐經(jīng)驗，已逐漸應用于腦卒中治療，且效果良好，但關于其發(fā)揮作用的具體機制尚在探索階段[5-6]。本研究通過建立腦卒中大鼠模型，觀察百會、神庭電針干預對其認知功能及血管新生的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 65只清潔級SD雄性大鼠，6周齡，體質(zhì)量190～210 g，購自北京華益健康藥物研究中心，生產(chǎn)許可證號：SYXK(京)2019-0035。自由進食、飲水，溫度24～26 ℃，自然光照，適應性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)/一氧化氮(Nitricoxide，NO)通路抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)(上海恒遠生化試劑有限公司)；CD31免疫組化試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；兔抗鼠eNOS、p-eNOS和NO一抗，山羊抗兔IgG二抗(美國Santa cruz公司)；6805-D電針儀(汕頭市醫(yī)用設備廠有限公司)；水迷宮裝置(北京碩林苑科技有限公司)；激光多普勒血流儀(上海玉研科學儀器有限公司)；RM2235病理切片機[徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司]；Synergy-HD顯微鏡(日本Toshiba公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組 采用改良Longa線栓法[7]。55只大鼠50 mg/kg ，2 %戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，剪開左側頸部，鈍性分離肌群，游離頸總、內(nèi)和外動脈，結扎頸總動脈近心端、頸外動脈，夾閉頸內(nèi)動脈遠端，頸總動脈附近1 cm切口，插入尼龍線至頸內(nèi)動脈，深度20 mm，扎緊動脈殘端，常規(guī)縫合。大鼠清醒后單籠飼養(yǎng)，以Longa神經(jīng)功能評價方法評價其神經(jīng)功能:1分(提尾時左側前肢屈曲且不能伸展);2分(爬行時出現(xiàn)追尾表現(xiàn)或向左側劃圈);3分(爬行困難，向左側傾倒)提示建模成功;剔除0分(無明顯神經(jīng)功能缺失表現(xiàn))和4分(意識喪失，不能爬行)。剩余10只大鼠將阻塞線插入頸內(nèi)動脈深度約5 mm，剩余步驟同上，設為假手術組。40只大鼠造模成功，隨機分為腦卒中組、電針組、L-NAME組和電針+L-NAME組，各10只。

1.2.2 干預方式 膠帶粘牢大鼠前后肢。

1.2.2.1 電針組 采用百會、神庭電針干預，建模后24 h參照《實驗針灸學》[8]確定百會及神庭穴位置，選用30號15 mm毫針，以30 °斜向刺入皮膚，深度2 mm左右，隨后采用電針儀，電壓峰值6 V，疏密波，頻率1/20 Hz，當針體輕抖時即為得氣。20 min/次，1次/d，連續(xù)14 d。建模后1 h、12 h和36 h行生理鹽水腹腔注射，每次5 mg/kg

1.2.2.2 L-NAME組 在建模后1 h、12 h和36 h行L-NAME腹腔注射，每次5 mg/kg。

1.2.2.3 電針+L-NAME組 采用百會、神庭電針聯(lián)合L-NAME干預，操作同電針組與L-NAME組。

1.2.2.4 假手術組與腦卒中組 實施非穴刺激，取雙側肋下非穴、非經(jīng)位置：低于肋部且高于髂嵴15 mm，其余針刺操作同電針組。在建模后1 h、12 h和36 h行生理鹽水腹腔注射，每次5 mg/kg。

1.2.3 Morris水迷宮實驗 末次干預后4 h開展Morris水迷宮實驗。采用大鼠通用型圓形水迷宮裝置，水池120 cm×60 cm，水深25 cm，水溫23 ℃。將水池分為4個象限，第3象限中心放置高23 cm、直徑10 cm的圓形平臺。任選1象限面向池壁放入大鼠，記錄其60 s內(nèi)找到平臺的時間(逃避潛伏期)，超過60 s未找到平臺，記錄潛伏期為60 s，訓練2次/d，每次間隔20 min，共持續(xù)5 d。第6天撤走平臺，將大鼠從原先象限對側入水，記錄逃避潛伏期、目標象限停留時間和穿越原平臺次數(shù)。

1.2.4 檢測缺血局部腦血流量 戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，以俯臥位將其固定于腦立體定位儀上，前囟右旁開口約3 mm，后移3 mm鉆孔，直徑1 mm，暴露腦組織。采用醫(yī)用耳腦型膠將激光多普勒血流儀光纖探頭固定于腦立體定位儀上，與病灶側腦皮質(zhì)接觸，檢測中動脈供血區(qū)血流量，獲取腦血流速度。

1.2.5 組織取材 Morris水迷宮實驗及缺血局部腦血流檢測完成后，頸椎脫臼處死大鼠，剪開右心耳，心尖灌注100 mL預冷PBS，至肺、肝變白，右心房流出澄清液體，斷頭，取出完整腦組織，預冷生理鹽水沖洗表面血液，其中5只沖掉表面血跡后濾紙吸干，用于檢測腦組織含水量，其余5只按照《大鼠腦立體定位圖譜》中定位方式切取患側海馬組織及腦皮質(zhì)組織[9]，濾紙吸干，海馬組織固定于4 %多聚甲醛中用于HE染色，腦皮質(zhì)組織分為2份，1份固定于4 %多聚甲醛中用于免疫組織化學染色，1份保存于液氮中用于Western blot檢測。

1.2.6 檢測腦組織含水量 取完整腦組織，天平稱重量，并記為濕重；隨后電熱恒溫干燥箱烘干腦組織至重量不再發(fā)生變化，天平稱重并記為干重。計算含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100 %。

1.2.7 HE染色觀察患側海馬區(qū)病理變化 取4 %多聚甲醛固定的腦組織，酒精梯度脫水、包埋，病理切片機制作成連續(xù)切片，厚度4 μm，二甲苯脫蠟、酒精水化，常規(guī)HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡觀察患側海馬區(qū)病理變化。

1.2.8 免疫組織化學染色觀察缺血周邊區(qū)域新生血管密度 取4%多聚甲醛固定48 h的患側腦皮質(zhì)組織，石蠟包埋，視交叉前緣切片(厚度8 μm)，采用CD31免疫組化試劑盒行染色標記，DAB顯色試劑盒顯色15 min，蘇木精復染，經(jīng)二甲苯透明后封片。顯微鏡下觀察，隨機選取缺血周邊區(qū)域5個不相鄰視野，計算機圖像分析系統(tǒng)計數(shù)陽性細胞(細胞被染成棕黃色或黃色)，反映新生血管密度。

1.2.9 Western blot檢測腦組織eNOS、p-eNOS及NO蛋白相對表達量 取液氮保存的患側腦皮質(zhì)組織40 mg，充分研磨后轉移至離心管，RIPA裂解液冰上裂解，30 min后10 000 r/min，離心半徑8 cm離心15 min，BCA試劑盒定量蛋白后，將40 μg待檢測樣本混合2倍體積上樣緩沖液，沸水浴使蛋白變性，10 000 r/min，離心半徑8 cm離心15 min，取上清，恒壓下行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉至硝酸纖維素膜，封閉液封閉2 h，與兔抗大鼠11 000 eNOS、p-eNOS及NO一抗(1∶1 000)混合，4 ℃搖床孵育過夜，TBST充分洗滌，與山羊抗兔IgG二抗(1:5 000)混合后室溫孵育1 h，加入ECL化學顯色劑，暗室顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析灰度值，以eNOS、p-eNOS及NO/GADPH灰度值表示其蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 各組認知功能比較

L-NAME組、腦卒中組、電針+L-NAME組、電針組和假手術組逃避潛伏期依次縮短，目標象限停留時間依次延長，穿越原平臺次數(shù)依次增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組認知功能比較

2.2 各組患側中動脈供血區(qū)腦血流速度、腦組織含水量比較

L-NAME組、腦卒中組、電針+L-NAME組、電針組和假手術組腦血流速度依次加快，腦組織含水量依次減少(P<0.05)。見表2。

表2 各組患側中動脈供血區(qū)腦血流速度、腦組織含水量比較

2.3 HE染色觀察各組海馬區(qū)病理變化

假手術組神經(jīng)元排列整齊，形態(tài)正常、核膜完整、核仁清晰和染色質(zhì)均勻分布；腦卒中組神經(jīng)元數(shù)量減少、排列紊亂和間隙變大，細胞核固縮、胞漿深染，可觀察到變性壞死神經(jīng)元；L-NAME組病理改變較腦卒中組更為嚴重；電針組、電針+L-NAME組干預后神經(jīng)元數(shù)量增加，核膜及核仁較清晰，損傷程度減輕，電針組較電針+L-NAME組改善效果更為明顯。見圖1。

2.4 各組新生血管密度比較

假手術組、L-NAME組、腦卒中組、電針+L-NAME組和電針組新生血管密度依次增加(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組新生血管密度比較

2.5 各組腦皮質(zhì)NO蛋白相對表達量、p-eNOS/eNOS比較

假手術組、L-NAME組、腦卒中組、電針+L-NAME組和電針組NO蛋白相對表達量、p-eNOS/eNOS依次升高(P<0.05)。見表4、圖3。

表4 各組腦皮質(zhì)NO蛋白相對表達量、p-eNOS/eNOS比較

3 討論

腦卒中是一種腦血管阻塞或破裂導致血循障礙引起腦組織損傷的急性腦血管疾病。血管新生是指毛細血管自血管側支出芽、再塑，包括血管擴張、增加內(nèi)皮通透性、溶解基底膜及內(nèi)皮細胞增生、遷移和形成管腔等多個連續(xù)環(huán)節(jié)，是腦卒中后神經(jīng)功能恢復的關鍵[10]。研究認為[11]，盡管腦卒中后梗死區(qū)域可觀察到血管新生，但該代償機制難以滿足腦缺血所致腦損傷恢復的需要。因此，探究腦卒中后血管再生誘導方式，促進缺血半暗帶側支循環(huán)建立，并尋找對應靶點對于改善腦卒中預后至關重要。

腦卒中后認知功能障礙屬于中醫(yī)“呆病”“癡癥”等范疇，以思維、判斷、記憶和執(zhí)行能力受損為主要表現(xiàn)，病位于腦，病機為腦脈痹阻、腦髓失養(yǎng)[12]。文獻指出[13]，督脈在經(jīng)絡聯(lián)系上屬腦，在病理表現(xiàn)上和腦部認知功能密切相關，具有神、形共調(diào)的功效。百會穴屬督脈，與任脈交互，統(tǒng)督諸陽，可升可降，能補能瀉，補神益智、疏通腦絡和協(xié)調(diào)百脈。神為天部之氣，庭為聚散之所，神庭穴亦屬督脈，且是督脈、太陽和足陽明3條經(jīng)脈之會，有報道指出該穴可平喘降逆、寧神醒腦，是諸多醫(yī)家治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病時的要穴之一[14]。本研究結果中，與腦卒中組比較，電針組逃避潛伏期縮短，目標象限停留時間延長，穿越原平臺次數(shù)增加，腦血流速度加快，腦組織含水量減少，海馬區(qū)病理變化減輕，且新生血管密度增加，提示電針百會、神庭穴可改善大鼠認知功能、腦血流速度、腦水腫和病理變化，促進血管新生。Liu等[15]研究顯示，百會、神庭電針干預腦卒中大鼠可預防缺血再灌注損傷，并減少缺血周圍區(qū)域神經(jīng)元凋亡。Wen等[16]認為，百會、神庭電針持續(xù)14 d干預缺血性腦卒中大鼠后，其腦梗死體積縮小，且可通過激活海馬、扣帶回、前緣皮層和感覺皮層等認知相關區(qū)域改善學習記憶能力，提示該治療方式在治療腦卒中時具有積極作用。

NO是血管內(nèi)皮細胞分泌的血管生成必需調(diào)節(jié)因子，對內(nèi)皮細胞遷移、增殖具有誘導作用，且可通過調(diào)節(jié)多種血管生成因子從而影響血管新生，促進毛細血管管腔形成，其異常表達與血管再狹窄、動脈粥樣硬化、高血壓和腦卒中等心腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關。eNOS是NO生成過程中的關鍵性調(diào)節(jié)酶，兩者激活是腦缺血后適應的延遲保護效應，是自我保護機制之一。Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)，通過改善eNOS的解偶聯(lián)和激活eNOS/NO可改善缺血再灌注誘導的腦內(nèi)皮通透性增強，從而修復血腦屏障，提示該通路在腦卒中進程中的作用。此外，有動物實驗結果表明[18]，Akt/eNOS被激活后，中腦動脈阻塞大鼠模型神經(jīng)功能、認知功能均有所改善，神經(jīng)元凋亡減少，且血管生成增加，暗示該通路可能是治療腦卒中的潛在靶點之一。本研究結果顯示，采用eNOS/NO抑制劑L-NAME干預后，大鼠認知功能、腦組織含水量、腦血流速度、新生血管密度及病理變化等改善效果均降低，且假手術組、L-NAME組、腦卒中組、電針+L-NAME組和電針組NO蛋白相對表達量、p-eNOS/eNOS依次升高，提示百會、神庭電針干預對腦卒中的治療效果可能通過調(diào)控p-eNOS、NO蛋白表達實現(xiàn)。

綜上所述，百會、神庭電針干預可改善腦卒中大鼠認知功能、腦水腫，加快腦血流速度，促進血管新生，改善病理變化，推測其作用機制與促進血管新生相關因子p-eNOS、NO表達有關。