高大玉，張均雩，李 倩，顧冰潔，王小琴，袁 海，沈敏寧，陳興國

0 引 言

痛風是單鈉尿酸鹽(monosodium urate, MSU)晶體在關節(jié)內及其周圍形成和沉積，引起關節(jié)急性紅腫、疼痛，常反復發(fā)作，并引起嚴重的炎癥反應和不可逆的骨侵蝕[1]。研究發(fā)現，高尿酸血癥與痛風密切相關，其不僅是痛風發(fā)作的病因，也是痛風發(fā)作的重要標志[2]。臨床工作中發(fā)現，有部分痛風性關節(jié)炎患者急性發(fā)作期血尿酸(serum uric acid, SUA)水平較慢性緩解期降低，甚至降低到正常范圍內(≤420 μmol/L)[3-7]。研究發(fā)現,急性痛風性關節(jié)炎時SUA的降低與尿酸排泄增加有關[5, 8]。有學者認為,腎上腺糖皮質激素及炎癥因子C反應蛋白(CRP)、白細胞介素6(IL-6)的增加可能參與降尿酸過程[5]。上述研究結論提示在痛風急性發(fā)作時，機體自身可能通過啟動生理機制增加腎排泄，從而達到自我調節(jié)尿酸濃度的目的，但具體機制尚未闡明。

痛風急性發(fā)作期患者血清中外泌體表達明顯增加。由此推測，外泌體可能參與了尿酸代謝的調控。URAT1是一種重要的尿酸重吸收轉運蛋白。本研究通過提取痛風發(fā)作期、緩解期以及正常人的血清外泌體，并分別作用于轉染URAT1基因的人胚胎腎細胞株(Human Embryonic Kidney 293，HEK 293)，通過檢測URAT1的表達變化，探討外泌體對尿酸重吸收的調控機制，及導致痛風患者急性發(fā)作期血尿酸下降的可能原因。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取并收集2021年1月至2021年6月南京市第一醫(yī)院風濕免疫科就診的17例痛風患者和17例健康體檢者臨床資料和血清標本。痛風患者均為男性，年齡22～86歲，中位年齡58.5歲。所有患者均符合2015年EULAR/ACR提出的痛風分類標準診斷[9]。分別在痛風患者的急性發(fā)作期(急性發(fā)作組)和慢性緩解期(慢性緩解組)收集臨床資料及血清。同時選取17名健康體檢人員作為對照組。各組患者人口及臨床特征差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。痛風性關節(jié)炎急性發(fā)作患者納入標準：有典型的關節(jié)紅、腫、熱、痛的臨床表現，未接受非甾體消炎藥、激素、秋水仙堿及降尿酸藥物治療，患者發(fā)作時炎癥指標血沉(ESR)明顯升高，且SUA明顯低于其慢性緩解期(≥60 μmol/L)的患者。排除標準：合并心腦血管、內分泌疾病、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病及其他風濕疾病；嚴重腎功能不全(腎小球濾過率GFR<30 mL/min，血清肌酐水平> 2.0 mg/dL)；肝炎或肝功能不全(丙氨酸氨基轉移酶或天冬氨酸氨基轉移酶水平>2.0×正常上限)；傳染病病史等。研究經南京市第一醫(yī)院倫理審查委員會批準(批件號：KY20210628-03)，所有受試均知情同意。

表1 不同分期痛風患者臨床特點比較

1.2外泌體提取收集所有患者空腹外周血，室溫下以2000×g轉速離心10 min，分離血清，并在-80 ℃下保存。將外周血清以2000×g和4 ℃離心20 min去除死細胞，再以10 000×g和4 ℃離心30 min去除細胞碎片。將上清液轉移到另一個干凈的離心管中，在120 000×g和4℃條件下進行60 min的超離心。丟棄上清液后用PBS重懸沉積的外泌體，然后在120 000×g和4℃條件下超離60 min。純化后的外泌體用PBS重懸以供進一步研究或在-80 ℃保存。

1.3外泌體的鑒定采用免疫印跡法鑒定外泌體的特異性蛋白標記物CD63(美國Cell Signaling Technology)。利用納米顆粒跟蹤分析儀(ZetaView PMX 110)對外泌體的大小和數量進行納米顆粒跟蹤分析(上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司)。并使用JEM-1010電子顯微鏡(JEOL)對外泌體的形態(tài)進行拍照，由南京醫(yī)科大學分析測試中心操作鑒定，實驗儀器為透射電子顯微鏡JEOL JEM-1010。

1.4URAT1過表達腎細胞株的制備

1.4.1 質粒的構建URAT1慢病毒在上海吉凱基因化學技術有限公司處購買，具體信息見圖1。

基因名稱：SLC22A12(NM_144585)，物種：Human，載體名稱：GV492，熒光標記：EGFP，克隆位點：Age I，元件順序：Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin

1.4.2URAT1目的基因轉染HEK293細胞將HEK293細胞接種到6孔板(板1)中培養(yǎng)；另用一塊6孔板(板2)以相同細胞密度接種一孔用于第2天計數。各孔加入2 mL培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，胰酶消化用于計數孔內細胞，得到板1每孔細胞數。將板1中的細胞分為2組，每3孔為一組，各對應一種慢病毒，按感染復數=5將目的基因慢病毒和對照慢病毒分別加入到2組HEK293細胞中，混勻后培養(yǎng)48 h。感染48 h后，EDTA消化病毒感染過的細胞，將各組中的3孔細胞合并收集, 轉移至新的6孔板中培養(yǎng)，其中每塊新的6孔板留出一孔用于陰性對照(即不加嘌呤霉素培養(yǎng))。根據HEK293細胞嘌呤霉素最低致死濃度測定的結果，用含0.6 g/L嘌呤霉素的培養(yǎng)基。連續(xù)加藥培養(yǎng)12 d，待細胞長滿后，使用光學顯微鏡觀察轉染穩(wěn)定后2種細胞的形態(tài)。

1.4.3轉染URAT1后的合格細胞株熒光鑒定在URAT1穩(wěn)轉株及空載體穩(wěn)轉株細胞生長至融合率約為80%后，取出細胞，用PBS洗3次，每次5 min。4%多聚甲醇覆蓋細胞，室溫靜置15 min后，用PBS洗3次，每次5 min。5 mg/L DAPI室溫避光染色5 min，用PBS洗3次，每次5 min。加入PBS覆蓋細胞，使用熒光顯微鏡觀察并在相同曝光條件下拍攝細胞照片。

1.4.4Westernblot檢測URAT1的蛋白表達水平利用RIPA裂解液提取全細胞蛋白，超聲破碎后以13 000×g、4 ℃條件下離心10 min, 取上清, 使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定樣品總蛋白濃度。蛋白質(30 μg)通過10% SDS-PAGE進行分離，并轉移到硝化纖維膜。5%的脫脂牛奶室溫下2 h封閉后,加入事先按說明書比例配制的對應一抗，4 ℃ 搖床過夜,室溫用TBST洗膜3次，每次10 min。加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗兔抗(1∶20 000稀釋)或鼠抗(1∶5000稀釋)，室溫下孵育2 h。TBST洗膜3次，每次10 min。將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合，滴上發(fā)光液，在成像系統(tǒng)中顯像，用圖象處理系統(tǒng)Image J分析目標條帶光密度值。主要用于免疫印跡分析的抗體包括：GAPDH兔一抗：南京翼飛雪生物科技有限公司，URAT1兔一抗：賽默飛世爾科技(中國)有限公司，HRP-標記二抗兔IgG：碧云天生物科技。

1.4.5實時熒光定量(qRT-PCR)檢測URAT1的mRNA表達水平使用TRIzol提取HEK293細胞的總RNA。RNA反轉錄獲得 cDNA(HiScript? Q Select RT SuperMix for qPCR),使用qRT-PCR儀(Applied Biosystems life technologies)和AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)在如下熱循環(huán)條件下進行qPCR：10 s 95 ℃，緊隨其后10 s 95 ℃，30 s 60 ℃，然后95 ℃ 15 s，60 ℃持續(xù)60 s，95 ℃ 15 s獲得熔化曲線。用2-ΔΔCt方法定量相對基因表達。數據以GAPDH mRNA水平為標準。引物為:URAT1，正向5′ TCTCCACGTTGTGCTGGTTC-3′，反向5′-GGATGTCCACGACACCAATGA-3′;和GAPDH,正向5′GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′和反向5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.5尿酸攝取實驗

1.5.1 外泌體刺激細胞將5×104個的HEK293 URAT1+細胞接種到12孔板中。待細胞增長至70%～80%時，分別加入急性發(fā)作期、慢性緩解期的外泌體10 μg/mL共培養(yǎng)6 h，并作一組未加入外泌體的空白對照。更換培養(yǎng)基，分別于第30、60、90、120、180分鐘時收取細胞，通過qRT-PCR檢測其URAT1 mRNA的表達情況。

1.5.2細胞攝取尿酸實驗在預實驗中，經過尿酸濃度梯度(400-500-600-700-800 μmol/L)后，發(fā)現加入800 μmol/LUA刺激細胞后，細胞反應結果較好；同時，800 μmol/L是常規(guī)患者血液濃度的可達到濃度高值。因此，選擇800 μmol/L作為最終實驗濃度。在與未經外泌體或經慢性緩解期、急性發(fā)作期外泌體共培養(yǎng)6 h后，加入高濃度800 μmol/L無菌尿酸溶液刺激細胞，于60 min收集細胞上清液，檢測尿酸濃度，測得尿酸的濃度差，計算不同狀態(tài)下HEK293 URAT1+細胞的尿酸攝取率。

2 結 果

2.1 外泌體鑒定結果

2.1.1 透射電子顯微鏡通過透射電子顯微鏡可觀察到杯狀或圓形囊泡狀結構，直徑為130～150 nm，符合典型外泌體的形態(tài)和大小，確認已成功提取外泌體。同時可以發(fā)現，慢性緩解期患者外泌體直徑略大于正常人和急性發(fā)作期患者見圖2。

a:正常人；b:慢性緩解期；c:急性發(fā)作期；標尺：200 nm圖 2 外泌體透射電鏡顯微鏡鑒定結果Figure 2 Identification of exosomes by TEM

2.1.2免疫印跡檢測通過在蛋白水平對外泌體表面特異性標記物CD63檢測，發(fā)現正常人、慢性緩解期患者、急性發(fā)作期患者的外泌體濃度逐漸升高，這與痛風疾病活動的變化相符。

2.1.3納米顆粒跟蹤分析通過納米顆粒跟蹤分析(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)檢測，見表2，發(fā)現正常人的外泌體粒徑最小(P<0.05)，慢性緩解期與急性發(fā)作期外泌體的粒徑差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而就顆粒濃度而言，急性發(fā)作期的外泌體濃度最高，慢性緩解期的濃度次之，正常人的最低(P<0.01)，見圖3，表2。

表2 外泌體NTA計數及粒徑分析表

1:急性發(fā)作期；2：慢性緩解期；3：正常人a:血清外泌體蛋白Western Blot檢測膜蛋白CD63表達；b:粒徑大小分析;c:顆粒濃度分析*P<0.05、**P<0.01圖 3 外泌體鑒定結果Figure 3 Identification of exosomes

2.2HEK293細胞穩(wěn)定表達URAT1滿布綠色熒光證實URAT1基因成功轉染至細胞中(圖4a,b)，且顯示視野范圍內無明顯未轉染細胞，提示轉染效率較高，HEK293 URAT1+細胞模型構建成功。見圖4。并從mRNA水平和蛋白水平分別驗證URAT1表達情況。結果顯示，轉染了URAT1基因的HEK293細胞在mRNA水平和蛋白水平均高表達了URAT1，明顯高于未轉染細胞及轉染陰性對照細胞。見圖5。

a：熒光顯微鏡白光；b：熒光顯微鏡DAPI；c：熒光顯微鏡GFP圖 4 熒光顯微鏡觀察HEK293細胞中URAT1質粒Figure 4 Observation of URAT1+ plasmid in HEK293 cells

1:HEK293細胞;2:HEK293轉染陰性對照;3:HEK293轉染URAT1

2.3尿酸攝取結果

2.3.1 經外泌體刺激后的細胞URAT1表達情況過表達URAT1的HEK293細胞在與外泌體共培養(yǎng)后，與未加入外泌體的細胞相比，急性發(fā)作期組URAT1 mRNA表達水平明顯降低(P<0.01)，慢性緩解期組略有下降(P<0.05)。

2.3.2與尿酸共培養(yǎng)后HEK293URAT1+細胞對尿酸的攝取率在過表達URAT1的HEK293細胞中，尿酸攝取率在不同外泌體共培養(yǎng)狀態(tài)下具有明顯差異。未加外泌體組尿酸攝取率為(6.03±0.62)×10-4，加入急性發(fā)作組為(2.15±0.43)×10-4，與未加外泌體相比明顯降低(P<0.01)；加入慢性緩解組也有所降低，但不如急性發(fā)作期明顯(P<0.05)，且急性發(fā)作期與慢性緩解期間差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3 討 論

本研究旨在探索痛風性關節(jié)炎急性發(fā)作期部分患者血尿酸下降的可能的原因。在這項研究中，構建了過表達尿酸重吸收蛋白URAT1的細胞模型，即HEK293 URAT1+細胞，并給予痛風性關節(jié)炎不同時期外泌體刺激，發(fā)現細胞攝取尿酸的能力下降。

尿酸的排泄減少是發(fā)生高尿酸血癥的原因[10]。人體中，2/3的尿酸經腎排泄，另1/3的尿酸經腸道排泄[11]。人體尿酸排泄的中心是尿酸重吸收和分泌之間的動態(tài)平衡。而這一過程主要通過各種尿酸轉運蛋白的參與完成，包括尿酸重吸收蛋白以及尿酸分泌蛋白、多藥耐藥蛋白4(MRP4)、Na+-磷酸鹽轉運蛋白(NPT1/NPT4)、ATP結合盒轉運蛋白2(ABCG2)等[11]。其中URAT1是一種主要的尿酸重吸收轉運蛋白，位于腎近端小管上皮細胞的頂端膜上，在維持尿酸穩(wěn)態(tài)中起著關鍵作用[12]。

診斷為高尿酸血癥的患者在急性痛風發(fā)作時，SUA水平有時會下降甚至在正常范圍內[5-8]。這一現象已被廣泛認識，同時也對于痛風的診斷造成一定影響。雖然研究發(fā)現痛風急性發(fā)作期SUA下降可能與腎尿酸排泄增加有關[8]；但造成這種現象的機制并不明確。本研究討論痛風性關節(jié)炎急性發(fā)作時SUA水平的降低是否與尿酸轉運蛋白的表達量有關，以及外泌體是否在尿酸轉運蛋白的表達中起作用。

本研究通過超速離心后得到的沉淀，經TEM鑒定后確認了為外泌體。通過對重懸后的外泌體進行納米顆粒跟蹤分析(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)，結合Stockes-Einstein方程式計算并得出的外泌體顆粒流體力學直徑和濃度。經NTA檢測回報，正常人的外泌體直徑最小，慢性緩解期痛風患者外泌體的直徑與急性發(fā)作期的相差較??；而急性發(fā)作期外泌體濃度最高，慢性緩解期次之，正常人的最低。由此我們初步得出結論，外泌體的濃度與痛風性關節(jié)炎疾病活動相關。

為解不同時期外泌體對尿酸轉運蛋白URAT1的影響，本研究將URAT1轉染進入HEK293細胞，得到穩(wěn)定表達URAT1的細胞，再經不同時期外泌體共培養(yǎng)后，發(fā)現在與急性發(fā)作期外泌體共培養(yǎng)后，與未加入外泌體的細胞相比，URAT1 mRNA表達水平明顯降低。這提示我們，外泌體可能通過某種機制靶向URAT1影響其表達。

過表達URAT1 的HEK293細胞在未經外泌體或經與慢性緩解期、急性發(fā)作期外泌體共培養(yǎng)6 h后，加入800 μmol/L高濃度UA刺激細胞，第60分鐘后尿酸濃度具有明顯差異，即尿酸攝取有差異。與未加外泌體相比，加入急性發(fā)作期外泌體組尿酸攝取明顯降低，慢性緩解期外泌體組亦有所下降，但無前者明顯。尿酸攝取降低的原因可能是外泌體內攜帶的某些具有調控能力的物質，作用于URAT1，從而使得結果呈現出攝取尿酸降低的趨勢。而對于慢性緩解期外泌體降低尿酸攝取的能力比急性發(fā)作期外泌體稍低，其原因可能是由于慢性緩解期的患者處于一種長期的高尿酸刺激的情況下，機體在減少尿酸攝取的同時也有了一定的耐受能力。

外泌體是細胞通過內體途徑分泌到細胞外的具有生物活性的脂質雙層納米囊泡，直徑為40～160 nm，可攜帶多種蛋白質、mRNA、miRNA等，在腫瘤、免疫、代謝性疾病中發(fā)揮著重要的調控作用[13]。

目前國內外尚未關于外泌體是否對痛風/尿酸有影響及兩者相關性的研究，亦未查閱到外泌體與尿酸轉運蛋白兩者相關性的研究，本研究在一定程度上提供了新的痛風研究思路及方向。而且，隨著藥物載體系統(tǒng)的研究發(fā)展，外泌體作為載體已成為藥物輸送領域的新型治療工具[14]，這為臨床上尋找新的安全有效的降尿酸藥物提供了可能。

本研究尚有一些不足之處。首先，因為研究需要，所挑選血清樣本的要求較為嚴格，故本研究收集樣本較少，有待進一步增加樣本量研究；其次，因為小鼠痛風模型的缺乏，我們并未進行體內動物實驗，有待進行在體實驗以證明我們的研究結果。

在本研究中，我們發(fā)現了外泌體可能調控了尿酸轉運蛋白URAT1的功能，在之后的實驗中，我們將進一步明確其分子機制，確定外泌體中具體發(fā)揮調控作用的物質，比如通過基因芯片篩選出差異表達的miRNA、預測其下游可能的靶基因等，深入探索痛風急性發(fā)作期血尿酸下降的原因。