龍瓊先 伍季 彭勇 張旭乾 劉欣雅

(南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 1.病理科；2.泌尿外科；3.婦產(chǎn)科，四川 南充 637000)

前列腺癌是目前全球男性發(fā)病率第二高的惡性腫瘤，居男性癌癥死因的第五位，2018年全球前列腺癌新發(fā)病例約127.6萬例，約35.9萬例患者死于前列腺癌[1]。目前研究顯示在初診為前列腺癌的患者中轉(zhuǎn)移性前列腺癌(mPC)患者大約占54%，其五年生存率相比非轉(zhuǎn)移性前列腺癌低了兩倍，同時mPC對藥物耐藥逐年增加，使優(yōu)化其治療方案顯得更為重要。原鈣黏蛋白9(Protocadherin 9, PCDH9)屬于非聚集型原鈣粘蛋白家族，和已證實的抑癌基因 PCDH8、PCDH17、PCDH20同位于染色體13q21，可介導(dǎo)細(xì)胞間的粘附作用，以及調(diào)節(jié)多種效應(yīng)分子，其表達(dá)缺失可引起腫瘤增殖甚至轉(zhuǎn)移[2]。有研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中存在PCDH9缺失，可以作為一個新的潛在前列腺癌抑制基因[3]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)PCDH9在膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、肝癌組織中表達(dá)下降，且與患者的預(yù)后相關(guān)。但PCDH9在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用機制仍不清。細(xì)胞周期是指細(xì)胞從第一次分裂結(jié)束產(chǎn)生新細(xì)胞到第二次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，如果細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，細(xì)胞的增殖將失控，進(jìn)而促進(jìn)癌的形成。為此，本研究探討前列腺癌中PCDH9表達(dá)缺失與細(xì)胞周期調(diào)控基因CyclinD1和C-myc的相關(guān)性，分析前列腺癌中PCDH9表達(dá)缺失在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集南充市中心醫(yī)院2018～2020年間存檔的92例前列腺癌、36例良性前列腺的石蠟包埋組織，所有病例組織常規(guī)HE染色后都經(jīng)過2位以上的病理學(xué)專家診斷。前列腺癌患者年齡48～87歲,平均(64.33±5.46)歲。按照2016版與前列腺癌預(yù)后相關(guān)的WHO/ISUP分級分組系統(tǒng)將前列腺癌分為1～5個組別：1組8例，2組15例，3組17例，4組21例，5組31例。術(shù)前前列腺癌特異性抗原(Prostate-specific antigen,PSA) ≤20 ng/mL 23例，>20 ng/mL 69例。所有患者均行手術(shù)切除治療，患者術(shù)前未接受放、化療或抗雄激素等治療。

1.2 主要試劑 PDDH9兔抗人抗體購自Abcam公司，CyclinD1和C-myc抗體均購自福州邁新生物公司；免疫組化檢測試劑盒和DAB 顯色劑均購自福州邁新生物公司。

1.3 免疫組化染色 取石蠟包埋組織蠟塊連續(xù)3 μm厚切片，常規(guī)脫蠟至水。Multimer標(biāo)記兩步法檢測，由全自動多功能病理檢測系統(tǒng)(Benchmark GX，羅氏公司)按步驟操作。基本條件設(shè)定為：抗原修復(fù)30 min，用緩沖液沖洗，加入UV DAB inhibitor(Ultraview Universal DAB Detection Kit，羅氏公司)，37℃ 4 min。緩沖液沖洗，加一抗(PCDH9、CyclinD1和c-myc)，37℃ 30 min。緩沖液沖洗，加UV HRP multimer(Ultraview Universal DAB Detection Kit，羅氏公司)，37℃ 8 min。緩沖液沖洗，加入等體積的DAB和DAB H2O2(Ultraview Universal DAB Detection Kit，羅氏公司)，37℃ 8 min。緩沖液沖洗，加入UV copper(DAB試劑盒內(nèi))，37℃ 4 min。緩沖液沖洗，蘇木精Ⅱ核復(fù)染，37℃ 8 min。用緩沖液沖洗，加入bluing reagent，37℃ 4 min，緩沖液沖洗，封片。用PBS代替一抗作陰性對照。

組織切片由兩名病理學(xué)醫(yī)師重復(fù)觀察，隨機選取5個高倍鏡視野，按陽性細(xì)胞數(shù)比例分級，無細(xì)胞著色評定為0分，細(xì)胞著色≤10%評定為1分，細(xì)胞著色10%～25% 評定為2分，細(xì)胞著色26%～50%評定為3分，細(xì)胞著色51%～100%評定為4分；組織切片無色評定為0分，淡黃色評定為1分，棕黃色評定為2分，棕褐色評定為3分。兩者積分相加≤2分為陰性；反之為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。樣本率的比較應(yīng)用卡方檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCDH9、CyclinD1和C-myc在列腺癌組織和良性前列腺組織中的表達(dá) PCDH9染色陽性呈棕黃色或棕褐色顆粒，主要定位于細(xì)胞漿。PCDH9蛋白在前列腺癌組織中低表達(dá)，陽性率為72.8%(67/92)，顯著低于良性前列腺癌組織的陽性率 (100%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(2=12.157，P=0.000)(見圖1A、圖1B)。細(xì)胞周期調(diào)控基因CyclinD1在前列腺癌組織中的陽性表達(dá)率為68.5%(63/92)，C-myc在前列腺癌組織中的陽性表達(dá)率為64.1%(59/92)，與良性前列腺組織相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1C、圖1D。

圖1 免疫組化檢測結(jié)果(200×)

2.2 前列腺癌組織中PCDH9、CyclinD1和C-myc表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 分析前列腺癌組織中PCDH9、CyclinD1和C-myc表達(dá)與患者年齡、WHO/ISUP分級分組、脈管神經(jīng)侵犯、PSA水平及臨床分期的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同WHO/ISUP分級分組、PSA水平、臨床分期的前列腺癌患者PCDH9陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，高WHO/ISUP分級分組、PSA>20 ng/mL及Ⅲ+Ⅳ期前列腺癌患者PCDH9陽性率明顯降低，而PCDH9表達(dá)與患者年齡、脈管神經(jīng)侵犯無關(guān)(P>0.05)。前列腺癌患者CyclinD1和C-myc表達(dá)與WHO/ISUP分級分組、脈管侵犯、PSA水平及臨床分期等相關(guān)(P<0.05)，但不同年齡組及有無神經(jīng)侵犯組間的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 前列腺癌組織中PCDH9、CyclinD1和c-myc表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 PCDH9 與CyclinD1 、C-myc在前列腺癌中表達(dá)的相關(guān)性 63例CyclinD1陽性表達(dá)的前列腺癌組織中有25例存在PCDH9蛋白的表達(dá)缺失，25例PCDH9表達(dá)缺失的病例顯示有C-myc蛋白的過表達(dá)。同時Spearman檢驗分析前列腺癌組織中PCDH9的表達(dá)與CyclinD1 、C-myc的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.414、-0.457，P<0.01 )，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 前列腺癌PCDH9表達(dá)缺失與CyclinD1和c-myc過表達(dá)的關(guān)系

3 討論

近年來，已經(jīng)有證據(jù)證明原鈣粘蛋白的一亞型——非聚集型原鈣粘蛋白 (δ-PCDHs)在人類腫瘤發(fā)生過程中也扮演著重要角色，δ-PCDHs表達(dá)下降或缺失是導(dǎo)致惡性腫瘤的原因之一[4]。PCDH9是一種抑瘤基因，它編碼一種在多種組織類型中表達(dá)的蛋白質(zhì)[5]。先前的研究表明，由于基因拷貝數(shù)的改變，非結(jié)節(jié)套細(xì)胞淋巴瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中PCDH9的表達(dá)被下調(diào)[6-7]，而PCDH9的外源表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。在肝細(xì)胞肝癌中，PCDH9通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0 /G1期來抑制肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖[8]。另一項研究表明，miR-200a-3p在卵巢癌中表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)的 miR-200a-3p 通過靶向PCDH9促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖[9]。本研究發(fā)現(xiàn)和良性前列腺組織相比，前列腺癌組織中PCDH9的表達(dá)有下調(diào)，其表達(dá)缺失率為27.2%，且與前列腺癌的分級分組、臨床分期和PSA水平等預(yù)后指標(biāo)有密切關(guān)系。最近研究顯示前列腺癌細(xì)胞中PCDH9的下調(diào)導(dǎo)致AKT磷酸化和活性增加， PCDH9在轉(zhuǎn)錄后受piR-001773和piR-017184調(diào)控，進(jìn)一步揭示了前列腺癌中PCDH9表達(dá)下調(diào)的意義[10]。究其腫瘤組織中PCDH9表達(dá)缺失的原因，有研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中不僅存在PCDH9的雜合性缺失，而且還存在DNA甲基化[11]；而在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中miR-215-5p可以通過結(jié)合其啟動子和 3′UTR 來抑制 PCDH9 表達(dá)[12]。除了 miRNA 靶向 PCDH9 mRNA 影響蛋白表達(dá)，蛋白-蛋白互作也可能造成PCDH9 表達(dá)缺失。

幾乎所有腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征都是細(xì)胞周期紊亂導(dǎo)致的失控性生長[13]。CyclinD1即細(xì)胞周期蛋白之一，是目前公認(rèn)的原癌基因及細(xì)胞周期重要的調(diào)節(jié)因子。作為細(xì)胞周期G1期重要的調(diào)控因子，其在G1/S期轉(zhuǎn)換中起著正性調(diào)節(jié)的作用，促進(jìn)DNA的合成，加快細(xì)胞由G1期進(jìn)人S期，從而導(dǎo)致細(xì)胞失控性生長，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[14]。CyclinD1在正常組織中表達(dá)量很少甚至不表達(dá)，而在多數(shù)惡性腫瘤中過度表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌中CyclinD1的表達(dá)明顯高于卵巢良性腫瘤，其表達(dá)與腫瘤的分級、FIGO分期、T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且CyclinD1陽性表達(dá)組的LVD計數(shù)高于CyclinD1陰性表達(dá)組[15]。本研究中發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中CyclinD1的表達(dá)明顯高于前列腺良性腫瘤，且隨腫瘤分級分組、臨床分期的增高而增高，與前列腺癌的預(yù)后有著密切關(guān)系。研究也發(fā)現(xiàn)CyclinD1在尿路上皮癌中的表達(dá)與其預(yù)后有關(guān)，其高表達(dá)增加復(fù)發(fā)風(fēng)險，可以作為尿路上皮癌復(fù)發(fā)/進(jìn)展的預(yù)后標(biāo)志物[16]。但近來的研究顯示CyclinD1的表達(dá)在不同腫瘤中的預(yù)后意義不盡相同，一項研究發(fā)現(xiàn)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中CyclinD1 的mRNA水平隨著腫瘤等級的增加和復(fù)發(fā)率的升高而降低，高CyclinD1水平的患者似乎有一個更有利的預(yù)后[17]。吳躍龍等[18]應(yīng)用免疫組化方法檢測62例前列腺癌原發(fā)灶癌組織及癌旁正常組織中CyclinD1蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)癌灶組織中CyclinD1蛋白染色陽性占41.9%。C-myc基因是一個在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和細(xì)胞周期中起重要作用的核內(nèi)癌基因，位于染色體8q24[19]。C-MYC已經(jīng)被證明在多種人類癌癥組織中呈高表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[20]。當(dāng)染色體易位或信號通路基因突變等情況發(fā)生時，C-myc會發(fā)生不依賴于生長因子刺激的擴(kuò)增，導(dǎo)致不受控制的細(xì)胞增殖和腫瘤產(chǎn)生[21]。本研究實驗結(jié)果顯示C-myc在前列腺癌組織的表達(dá)明顯高于前列腺良性組織，且其表達(dá)率隨著Gleason評分及TNM分期的增高而增高，與謝鳴等[22]的研究結(jié)果一致。

本實驗中進(jìn)一步分析前列腺癌組織PCDH9的表達(dá)下調(diào)與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1和C-myc過表達(dá)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PCDH9的表達(dá)缺失率隨著CyclinD1和C-myc過表達(dá)率增高而增高，PCDH9的表達(dá)缺失病例常有CyclinD1和C-myc的過表達(dá)，提示前列腺癌組織中PCDH9的表達(dá)缺失可能會引起腫瘤細(xì)胞周期紊亂，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的失控性生長?；謴?fù) PCDH9 的表達(dá)降低了腫瘤細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并引起 G0/G1細(xì)胞周期停滯；同時上調(diào) Bax 蛋白表達(dá)，但使 Bcl-2和cyclinD1表達(dá)下調(diào)[23]。一項研究發(fā)現(xiàn)PCDH9、BAG-1S蛋白表達(dá)可預(yù)示非小細(xì)胞肺癌新輔助化療預(yù)后狀況，其中PCDH9陽性表達(dá)越高，BAG-1S陽性表達(dá)越低，疾病預(yù)后越佳[24]。本研究發(fā)現(xiàn)具有PCDH9表達(dá)缺失、CyclinD1和C-myc過表達(dá)的病例，其臨床分期、病理分級高于無PCDH9表達(dá)缺失、CyclinD1和C-myc低表達(dá)的病例，進(jìn)一步提示前列腺癌組織中PCDH9的表達(dá)缺失與腫瘤的進(jìn)展有密切關(guān)系，PCDH9可能成為反映腫瘤生物學(xué)行為的參考指標(biāo)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能存在PCDH9的表達(dá)缺失，其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。