王卉卉 張煒宇 李愛英 劉穎

(1.南京市江寧醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,江蘇 南京 211100；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院普外科,江蘇 南京 210009)

胃癌作為一種早期癥狀不明確的惡性腫瘤，患者在治療后還會(huì)有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，也是造成死亡的主要因素，大多數(shù)情況下都是在50～60歲之間發(fā)生[1-2]。胃癌患者患病初期不具有明顯癥狀，病情處于潛伏期時(shí)，患者為對身體的微小反應(yīng)未重視，以至于失去診斷的最佳時(shí)期，發(fā)現(xiàn)時(shí)通常已經(jīng)處于發(fā)展?fàn)顟B(tài)，開始向周圍組織轉(zhuǎn)移[3]。胃癌臨床治療基于外科，通過化學(xué)療法、放射療法、生物學(xué)療法等綜合治療來進(jìn)行輔助，但效果不理想易復(fù)發(fā)[4]。近幾年研究表明，作為調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分化的重要因素，胃癌的浸潤及轉(zhuǎn)移受到TGF-β1的表達(dá)的間接影響。TGF-β1參與了許多生理學(xué)和病理學(xué)過程，可引起細(xì)胞外矩陣和基底膜的分解，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和遷徙能力[5-6]。JAK2/STAT3信號(hào)傳輸路徑與血液腫瘤、乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤的病因有關(guān)，JAK2/STAT3信號(hào)傳遞路徑異?；钴S，抑制這一通路將成為腫瘤治療的新目標(biāo)[7-8]。STAT3在惡性腫瘤中主要表現(xiàn)為持續(xù)的酪氨酸氧化狀態(tài)，下游靶基因失調(diào)由STAT3過度活化造成，引起不被控制的細(xì)胞增殖，阻礙腫瘤細(xì)胞的凋亡[9]。癌細(xì)胞增值腫瘤微血管生成，參與腫瘤的免疫回避，并抑制免疫功能，致使癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移致其他臟器。本研究探討TGF-β1通過JAK2/STAT3信號(hào)對胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 Trizol試劑(浙江AMEKO)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(武漢賽維爾)，RT-PCR試劑盒、流式細(xì)胞(上海優(yōu)予，BCA蛋白濃度測定試劑盒、RPMI-1640培養(yǎng)基(上海一研)。

1.2 細(xì)胞處理及分組 準(zhǔn)備含10%牛胎血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中加入處理后的BGC-823細(xì)胞和1%氰基鏈霉素，2～3 d的傳代培養(yǎng)，在37℃,CO25%的條件下培養(yǎng)，細(xì)胞生長至80%～90%，離心5 min，調(diào)整細(xì)胞濃度1×104/ mL，24 h后按1∶5接種到培養(yǎng)瓶。棄去培養(yǎng)基，加入由10%FBS/F12配制成的0 μg/L(0 μg/L組)、1.0 μg/L(1.0 μg/L組)、10 μg/L(10 μg/L組)、50 μg/L(50 μg/L組)四種濃度的 TGF-β1反應(yīng)12 h。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 選擇不同濃度TGF-β1處理后的BGC-823細(xì)胞，做成細(xì)胞涂抹標(biāo)本，二甲苯脫蠟時(shí)間15 min，用乙醇駝色，用蘇木素-伊紅(HE)染色，染色后乙醇脫水，每張涂片隨機(jī)選擇視野，置于顯微鏡(400×)下觀察BGC-823細(xì)胞形態(tài)。

1.4 RT-PCR法檢測細(xì)胞中JAK2/STAT3的表達(dá) Trizol法提取經(jīng)過處理的BGC-823細(xì)胞的總RNA，將提取出的總RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，此過程遵照說明書進(jìn)行，用DNA熒光染料SYBR GreenⅠ對JAK2/STAT3表達(dá)水平進(jìn)行檢測，內(nèi)參為β-actin。在60℃環(huán)境下10 min、95℃ 和720℃環(huán)境下各 30 s、95℃環(huán)境下5 min，循環(huán)次數(shù)以40為準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)次數(shù)至少3次，取基因相對表達(dá)量進(jìn)行分析，引物序列,見表1。

表1 PCR引物序列

1.5 Westernblot檢測細(xì)胞中JAK2/STAT3蛋白 裂解經(jīng)過處理的BGC-823細(xì)胞，提取組織中的總蛋白質(zhì)濃度，用100 V SDS-PAGE電泳總蛋白質(zhì)，用Bradford法定量蛋白質(zhì)樣本，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，10%山羊血清封閉0.5 h。4℃一抗過夜孵育，二抗室溫孵育1 h，室溫洗膜3次，GAPDH做內(nèi)參，用Quantity one 4.0軟件分析JAK2/STAT3蛋白表達(dá)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測BGC-823調(diào)亡情況 將TGF-β1梳理后的BGC-823細(xì)胞置入孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，濃度為2×106細(xì)胞/ mL，培養(yǎng)時(shí)間為24 h，培養(yǎng)完成后采用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，再用70%乙醇固定，4℃環(huán)境下靜置1 d，離心5 min，棄去上清液，用PBS洗滌5 min,重復(fù)三次，室溫37℃，避開光照進(jìn)行染色，時(shí)長30 min,用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡程度。

1.7 細(xì)胞克隆測定BGC-823細(xì)胞存活率 不同濃度TGF-β1處理的細(xì)胞種植到含 10 mL 培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，37℃環(huán)境下培養(yǎng)，孵育 14 d 細(xì)胞克隆成功，用 4% 多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，加入結(jié)晶紫染色液，染色時(shí)長 20 min，計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)，對各組細(xì)胞存活率進(jìn)行計(jì)算。[克隆形成率(%)=(形成的細(xì)胞克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%]

2 結(jié)果

2.1 HE染色 0 μg/L組中，細(xì)胞核呈橢圓形，形狀規(guī)則，且細(xì)胞排列松散，隨著TGF-β1濃度增加，細(xì)胞開始逐漸增多，細(xì)胞多為圓形，多個(gè)細(xì)胞聚集，出現(xiàn)巨核細(xì)胞或多核細(xì)胞，50 μg/L組與其他組相比細(xì)胞數(shù)量最多(P<0.05)，見圖1。

圖1 HE染色結(jié)果

2.2 BGC-823細(xì)胞中JAK2與STAT3的表達(dá)情況 RT-PCR法用于檢測經(jīng)0、1.0 、10、50 μg/L的TGF-β1處理后細(xì)胞中JAK2與STAT3的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)0 μg/L組JAK2、STAT3表達(dá)最低，隨著TGF-β1的濃度增加JAK2、STAT3表達(dá)也增加，JAK2依次為0.618±0.114、0.637±0.177、0.919±0.351、1.268±0.278，STAT3依次為0.624±0.121、0.647±0.162、0.981±0.174、1.297±0.264(均P<0.05)，見圖2。

圖2 各組細(xì)胞胃癌JAK2與STAT3mRNA的表達(dá)情況

2.3 JAK2與STAT3蛋白表達(dá) 0 μg/L組JAK2與STAT3蛋白表達(dá)最低(P<0.05)，50 μg/L組JAK2與STAT3蛋白表達(dá)最高(P<0.05)，隨著TGF-β1濃度增加JAK2與STAT3蛋白也明顯上升，蛋白表達(dá)與濃度成正比(均P<0.05)，見圖3。

圖3 各組細(xì)胞胃癌JAK2與STAT3蛋白的表達(dá)情況

2.4 BGC-823細(xì)胞凋亡變化 流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同濃度TGF-β1處理后，0μg/L組細(xì)胞凋亡最多，50μg/L組細(xì)胞凋亡最少，隨濃度增加依次減少，凋亡率分別為2.48±0.21、2.31±0.19±0.11、0.818±0.08(均P<0.05)，見圖4。

圖4 BGC-823細(xì)胞凋亡變化

2.5 細(xì)胞克隆測定細(xì)胞BGC-823細(xì)胞的克隆能力 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)在0 μg/L組BGC-823的單克隆群數(shù)最少(P<0.05)，而50 μg/L組細(xì)胞單克隆群數(shù)顯著增加(P<0.05)，隨著TGF-β1濃度增加BGC-823單克隆形成率有上升趨勢(均P<0.05)，見圖5。

圖5 BGC-823細(xì)胞的克隆能力

3 討論

胃癌是常見的臨床消化系統(tǒng)腫瘤，近年來發(fā)病率有所下降，但發(fā)病率和死亡率依然占世界全身性惡性腫瘤的8%和10%[1]。胃癌的早期診斷能減緩病情進(jìn)展，加之有效的治療方法也是改善患者預(yù)后的重要手段，據(jù)統(tǒng)計(jì)，早期胃癌如果能得到針對性治療，可將患者5年生存率提升至90%或以上[11]。但即使是發(fā)達(dá)國家，被確診的患者50%以上都進(jìn)入了疾病發(fā)展期，手術(shù)完全消除病變和轉(zhuǎn)移的可能性在50%以下[12]。胃癌的病因是相當(dāng)復(fù)雜的病理學(xué)過程，包括多個(gè)基因和分子信號(hào)傳輸路徑，與胃癌有關(guān)的許多因子被發(fā)現(xiàn)了，但對胃癌的目標(biāo)療法起決定性的作用并不多[13]。根據(jù)病因和目標(biāo)療法的研究基礎(chǔ)。JAK2/STAT3信號(hào)通路和TGF -β1以及一些炎癥關(guān)聯(lián)因子慢慢地被用于胃癌的治療[14]。

通過觀察HE染色、細(xì)胞凋亡變化、克隆能力發(fā)現(xiàn)0 μg/L組細(xì)胞核呈橢圓形，形狀較規(guī)則，細(xì)胞排列松散，隨著TGF-β1濃度增加，細(xì)胞開始逐漸增多，呈圓形型排列緊密，多個(gè)細(xì)胞聚集，有巨核細(xì)胞或多核細(xì)胞出現(xiàn)，50 μg/L組與其他組相比細(xì)胞數(shù)量最多。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同濃度TGF-β1處理后，0 μg/L組細(xì)胞凋亡最多，50 μg/L組細(xì)胞凋亡最少，隨濃度增加依次減少，細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)在0 μg/L組BGC-823的單克隆群數(shù)最少，而50 μg/L組細(xì)胞單克隆群數(shù)顯著增加，隨著TGF-β1濃度增加BGC-823單克隆形成率有上升趨勢。研究顯示，TGF -β1是具有25 kd分子量的二本鏈多肽，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化，并且促進(jìn)細(xì)胞外矩陣合成的作用[15]。有研究表明，TGF -β1在很多的腫瘤中出現(xiàn)過表達(dá)，并且在腫瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)行的誘導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用，TGF-β1活性得到抑制可使腫瘤體積減少[16]。有研究顯示，TGF-β1及其關(guān)聯(lián)TGF-β信號(hào)傳輸路徑，在胰臟癌等其他惡性腫瘤的發(fā)張過程中也有TGF-β1參與[17]，國內(nèi)外的多的研究顯示，TGF-β1/ 2可作為惡性腫瘤的預(yù)后指標(biāo)使用[18]。相關(guān)研究顯示，TGF-β1的負(fù)調(diào)節(jié)可以對向腫瘤關(guān)聯(lián)成纖維細(xì)胞的分化產(chǎn)生抑制作用，并且可以阻礙腫瘤增生的微小環(huán)境的形成[19]，這與本文研究相符。

通過檢測JAK2/STAT3表達(dá)情況和蛋白變化發(fā)現(xiàn)，RT-PCR法用于檢測經(jīng)0、1.0、10、50 μg/L的TGF-β1處理后細(xì)胞中JAK2與STAT3的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)0 μg/L組JAK2、STAT3表達(dá)最低，隨著TGF-β1的濃度增加JAK2、STAT3表達(dá)也增加。Westernblot檢測結(jié)果顯示0 μg/L組JAK2與STAT3蛋白表達(dá)最低，50 μg/L組JAK2與STAT3蛋白表達(dá)最高，隨著TGF-β1濃度增加JAK2與STAT3蛋白也明顯上升，蛋白表達(dá)與濃度成正比。有研究證實(shí)，STAT3蛋白是一種異?；钴S的轉(zhuǎn)錄因子[20]，通過與JAK2激酶反應(yīng)增加活性使自己磷酸化，特定靶基因因受到磷酸化的STAT3影響，開始轉(zhuǎn)錄功能，并誘導(dǎo)相關(guān)蛋白，影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡[21-22]。有研究顯示，JAK2 / STAT3是VEGF基因的直接轉(zhuǎn)錄活性化因子，根據(jù)p53的作用機(jī)制調(diào)節(jié)HIF-1活性[23]。有研究顯示，JAK2/STAT3可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞VEGF的形成，促進(jìn)血管新生血管內(nèi)皮細(xì)胞游走和細(xì)胞管結(jié)構(gòu)的形成。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，TGF-β1通過活化JAK2/STAT3信號(hào)傳輸路徑，可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。