盧艷敏，裴素儉，劉海鵬，馬惠欽

(1. 衡水學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，多足動(dòng)物研究所，河北 衡水 053000；2. 河北省濕地生態(tài)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 衡水 053000)

伊森石蜈蚣亞屬Ezembius由美國學(xué)者Chamberlin[1]在1919年提出，他認(rèn)為其是石蜈蚣科Lithobiidae石蜈蚣屬Lithobius的一個(gè)亞屬.伊森石蜈蚣亞屬目前已描述約60種/亞種，大部分來自亞洲.該亞屬棲息范圍很廣，從北極和亞北極到北極熱帶和亞熱帶森林，到中亞大草原和過度放牧的石質(zhì)地區(qū)，再到喜馬拉雅山地森林，從海岸到5 500 m高山 (喜馬拉雅)均有分布[2].伊森石蜈蚣亞屬的主要特征是：觸角20節(jié)左右，單眼通常5～21個(gè)，基胸板齒通常為2+2，副齒一般剛毛狀，有時(shí)粗壯.所有背板后角無三角形突起，第1～13對(duì)步足的跗節(jié)分為2節(jié).雌性生殖肢有(2+2)～(3+3)(很少有4+4)生殖棘，第Ⅲ節(jié)末端爪簡(jiǎn)單，2分或3分[2].目前，中國已經(jīng)描述25種[3-11].本研究首次在寧夏發(fā)現(xiàn)伊森石蜈蚣亞屬1新種，擬通過形態(tài)描述以及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析確定其分類地位，旨在為石蜈蚣目的系統(tǒng)研究補(bǔ)充數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集、制備與觀察

標(biāo)本采自于落葉層或石塊下面，采用鑷子夾取法采集.在野外采集到的標(biāo)本放在50%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的乙醇中浸泡，回到駐地后更換為75%的乙醇，最后在實(shí)驗(yàn)室再更換1次75%的乙醇長(zhǎng)期保存，用于提取DNA的標(biāo)本保存于95%的乙醇中(-20 ℃).利用Zeiss SteREO Discovery.V20體視顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照.顏色描述以75%乙醇浸泡的標(biāo)本為準(zhǔn)，體長(zhǎng)是指頭板前緣到最后背板后緣的距離.本文使用的解剖學(xué)術(shù)語依據(jù)Bonato[12]總結(jié).形態(tài)測(cè)量數(shù)據(jù)單位為mm.所有標(biāo)本均保存于衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院多足動(dòng)物研究所.

1.2 分子系統(tǒng)學(xué)分析

1.2.1 DNA的提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

取石蜈蚣標(biāo)本兩側(cè)步足，使用TIANamp血液/組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取總DNA，擴(kuò)增COI部分片段(689 bp).PCR擴(kuò)增使用引物為L(zhǎng)CO1490和HCO2198[13](由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成).

PCR反應(yīng)體系為2×PCR mix (abm) 12.5 μL，LCO 1490(10 μmol/L)/HCO 2198(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL.PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性 30 s，44 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.

用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物.將條帶清晰的PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序.使用seqman軟件對(duì)雙向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，然后以Fasta格式輸出.

1.2.2 分子系統(tǒng)學(xué)分析

以單眼石蜈蚣科Henicopidae中2種(Lamyctesemarginatus和Anopsobiusneozelanicus)作為外群，用MEGA7.0中的Muscle進(jìn)行序列比對(duì)[14]，并基于K2P模型進(jìn)行遺傳距離分析.使用ModelFinder[15]選擇最適替代模型；用MrBayes3.2.6構(gòu)建Bayesian系統(tǒng)發(fā)育樹[16]，替代模型為GTR+F+I+G4.分子系統(tǒng)學(xué)分析所用序列均來源于GenBank(表1).

表1 所用物種基因序列的GenBank登錄號(hào)Tab.1 GenBank accession numbers of the sequence

續(xù)表1Continued Tab.1

2 結(jié)果

2.1 賀蘭石蜈蚣，新種 Lithobius (Ezembius) helanensis sp.nov.(圖1-2)

模式標(biāo)本：正?！?，體長(zhǎng)29.5，頭長(zhǎng)2.6，頭寬2.8；寧夏石嘴山(106°23′26″ E，39°59′23″ N)，海拔1 122 m，2018-08-08，馬惠欽采；副模119 ♀♀，98♂♂，馬惠欽、裴素儉采，其他采集信息同正模.

詞源學(xué)：新種以采集地賀蘭山區(qū)命名.

鑒別特征：新種Lithobius(Ezembius)helanensissp. nov.與東北石蜈蚣Lithobius(Ezembius)mandschreiensis[17]相似，但可通過以下特征與后者區(qū)別：1)頭部每側(cè)單眼大小不一，近背側(cè)和后側(cè)單眼較大，近腹側(cè)和前側(cè)單眼較小，最后1個(gè)單眼最大，靠近托氏器單眼較小，托氏器與鄰近單眼近似等大，而后者單眼等大，托氏器與多數(shù)單眼等大；2)第14、15步足背側(cè)刺式均為10322，而后者分別為10311與10310；3)第15步足具后副爪，而后者無副爪.

描述：體長(zhǎng)17.6～29.8；頭長(zhǎng)2.24～2.61；頭寬2.28～2.84.

顏色：觸角基部呈栗褐色，端部3～6節(jié)由栗褐色漸變?yōu)辄S褐色.頭板深褐色，背板比頭板顏色較淺，褐色到黃褐色.腹板黃褐色略帶白色.身體兩側(cè)灰白色.顎足黃褐色，末端深褐色；第1～13對(duì)步足，基本同腹板，第14～15對(duì)步足黃褐色.

觸角：觸角19～28節(jié)，多數(shù)為21+21，觸角第1節(jié)基部長(zhǎng)寬近似相等，其余各節(jié)為長(zhǎng)大于寬，末節(jié)長(zhǎng)明顯大于寬的2.1～4.1倍.觸角基部剛毛稀疏，從基部向末端漸增密，至第6節(jié)剛毛密度不再增加，且觸角剛毛內(nèi)側(cè)較外側(cè)稠密.

頭板：頭寬略大于頭長(zhǎng)，頭板向背側(cè)隆起，表面有致密網(wǎng)紋和微凹.額溝明顯.頭殼側(cè)緣起于單眼群到頭板后緣中間偏前的位置.頭板后緣全緣，比側(cè)緣寬，明顯變厚，中間向前微凹.后緣光滑無剛毛，側(cè)緣和頭板表面著生長(zhǎng)短不一的稀疏剛毛.

單眼和托氏器：?jiǎn)窝勖總?cè)9～16個(gè)，多數(shù)12～14個(gè)，多數(shù)為4列排布，少數(shù)為3列排布，極少數(shù)為5列排布.單眼橢圓形到圓形，半透明狀，大小不一，眼底具有黑色素.近背側(cè)和后側(cè)單眼較大，近腹側(cè)和前側(cè)單眼較小，最后1個(gè)單眼最大.托氏器圓形，位于單眼群前端腹側(cè)，與鄰近單眼基本等大，比最大的單眼小.

基胸板：顎足基胸板近似梯形，齒緣較窄，兩側(cè)向腹側(cè)隆起，中央溝明顯，呈V型，具有致密網(wǎng)紋，表面粗糙有小凹陷.基胸板前緣具三角形齒，末端稍尖，齒式多數(shù)為2+2，少數(shù)為2+3，極少數(shù)為3+3，個(gè)別為4+5、3+4.副齒位于最外齒外側(cè)肩部腹側(cè)，基部粗壯，端部尖細(xì)，基部基本無突起.齒緣附近著生長(zhǎng)短不一的稀疏剛毛，副齒外側(cè)剛毛較長(zhǎng)較密，剛毛數(shù)量向后方逐漸減少.

背板(T)和腹板(S)：各背板稍向背側(cè)隆起，表面光滑無皺縮，有致密網(wǎng)紋.側(cè)緣完整，T1后緣連續(xù)且中部明顯變寬，TT1、3、5后緣向前微前凹；TT8、10、12、14、15背板后緣前凹，其他后緣平滑.背板后角無突起.各背板前緣和側(cè)緣著生長(zhǎng)短不一的稀疏剛毛；TT1～10后緣無剛毛，TT11～15后緣具有較長(zhǎng)剛毛.各腹板前寬后窄，形似倒梯形，表面光滑有微凹，具有致密網(wǎng)紋，表面著生稀疏剛毛，SS1～14前端剛毛數(shù)量較多，S15剛毛分布均勻；SS1～12接近兩后角處各有1條斜向后外側(cè)的凹陷，左右兩側(cè)幾乎對(duì)稱，呈“八”字形.各腹板前后兩角常具2～9根剛毛.

a.雌性背面觀；b.頭板背面觀；c.眼及托氏器(To)側(cè)面觀；d-j.顎足基胸板腹面觀.圖1 賀蘭石蜈蚣，新種整體外形及頭部特征Fig.1 Lithobius (Ezembius) helanensis sp.nov.，habitus and head characteristic

步足：步足發(fā)達(dá)，第1～13對(duì)步足跗節(jié)分節(jié)不明顯，第14、15對(duì)步足跗節(jié)明顯分為2部分.第1～15對(duì)步足各節(jié)表面具有稀疏的長(zhǎng)短不一的剛毛，第1～13對(duì)步足跗節(jié)表面的剛毛比其他各節(jié)稍密，分布均勻，且剛毛較粗長(zhǎng)，跗節(jié)腹面有1列排列整齊的剛毛；第14、15對(duì)步足跗節(jié)剛毛比其他各步足稀疏，無較粗剛毛，腹面無剛毛；第14、15對(duì)步足比前面的步足較粗長(zhǎng)；所有步足跗節(jié)末端均具有彎向腹側(cè)的爪，第1～14對(duì)步足具有2個(gè)副爪，前副爪短細(xì)，與主爪形成的角度較小，后副爪粗長(zhǎng)，與主爪形成的角度稍大；第15對(duì)步足僅具后副爪.第15對(duì)步足第2跗節(jié)是第1跗節(jié)長(zhǎng)度的62.19%～76.3%，第2跗節(jié)長(zhǎng)為寬的5.04～6.24倍.步足刺式見表2～3.

基節(jié)腺孔：6～10個(gè)，多數(shù)為7或8個(gè)，排列成1列，大小不一，形狀不規(guī)則，多數(shù)近似橢圓形，少數(shù)近似圓形.基節(jié)腺孔區(qū)域凹陷，外側(cè)邊緣隆起，隆起表面上雌性散亂分布12～19根長(zhǎng)剛毛，雄性分布7～15根較長(zhǎng)剛毛.

表2 賀蘭石蜈蚣，新種雌性個(gè)體步足刺式Tab.2 Leg plectrotaxy of female Lithobius (Ezembius) helanensis sp.nov.

雌性特征：第15節(jié)腹板2后角均鈍圓，后緣中部平直.生殖節(jié)腹板寬大于長(zhǎng)，兩側(cè)向背部?jī)A斜，后緣在2生殖肢間向前和背部?jī)A斜，中央有1小的長(zhǎng)條狀輕微角質(zhì)化突起.第15節(jié)腹板表面著生較多長(zhǎng)短不一的剛毛，近前緣處剛毛少于后緣部分.雌性生殖肢分為3節(jié)，第1節(jié)較寬大，表面密生剛毛，內(nèi)側(cè)著生2～3個(gè)較小的圓錐形生殖棘，多數(shù)為3+3個(gè)，少數(shù)為2+3個(gè)，最內(nèi)側(cè)的較小，稍靠前.第2節(jié)背面具7～14個(gè)較短刺，排成2列；腹面著生7～16根長(zhǎng)短不一的剛毛，外緣剛毛較內(nèi)側(cè)粗長(zhǎng)，分散排布.第3節(jié)背側(cè)基部具有2～3個(gè)短刺；腹側(cè)著生4～8根長(zhǎng)短不一的剛毛，基部?jī)?nèi)側(cè)具有1～2根短刺，外側(cè)有1～2根較長(zhǎng)剛毛.末端具爪，爪尖向內(nèi)側(cè)彎曲，簡(jiǎn)單且較寬闊.

表3 賀蘭石蜈蚣，新種雄性個(gè)體步足刺式Tab.3 Leg plectrotaxy of male Lithobius (Ezembius) helanensis sp.nov.

表中帶括號(hào)的刺表示有的標(biāo)本無此刺.

雄性特征：第15節(jié)腹板前寬后窄，近倒梯形.后緣弧形，腹板表面著生著稀疏長(zhǎng)短不一的剛毛，邊緣處剛毛較長(zhǎng)且排列較整齊.雄性生殖肢短小、簡(jiǎn)單，僅為2個(gè)很小的半球形突起，末端輕微角質(zhì)化，生殖肢頂端著生著0～2根剛毛(圖2).

主要形態(tài)學(xué)特征區(qū)別見檢索表.

a.雌性末節(jié)及生殖肢腹面觀；b.雌性生殖肢背外側(cè)觀；c.雌性生殖肢末端爪腹側(cè)觀；d.雄性末節(jié)及生殖肢腹面觀.圖2 賀蘭石蜈蚣，新種生殖肢Fig.2 Lithobius (Ezembius) helanensis sp.nov., gonopod

中國伊森石蜈蚣亞屬種檢索表

2.2 分子系統(tǒng)學(xué)結(jié)果

COⅠ基因具有高度保守性，在系統(tǒng)發(fā)育研究中常作為確定物種進(jìn)化地位的重要依據(jù)，可以用來推斷物種間的親緣關(guān)系.使用MrBayes 3.2.6將測(cè)序所得新種2個(gè)個(gè)體的COⅠ序列與2種伊森石蜈蚣亞屬物種、21種石蜈蚣科其他屬物種、2種單眼石蜈蚣科物種的COⅠ序列，構(gòu)建了BI系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，其中2種單眼石蜈蚣科物種Lamyctesemarginatus和Anopsobiusneozelanicus作為外群.由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，本文新種2個(gè)個(gè)體集中于1支，位于伊森石蜈蚣亞屬.新種與石蜈蚣科其他種匯為1支，同屬于石蜈蚣科Lithobiidae，分類地位明確.

圖3 基于石蜈蚣目COⅠ基因序列構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Bayesian tree for the some Lithobiomorpha species based on COⅠsequences

新種不同個(gè)體之間的遺傳距離為0.3%，與L.(E.)giganteus和L.(E.)maqinensis的平均遺傳距離為22%.L.borealis與L.melanops的遺傳距離最小(13.6%)，L.(M.)crassipes與L.emarginatus的遺傳距離最大(30%)，石蜈蚣科不同種與外群的遺傳距離為22.4%～30%.

3 討論

形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)該種與東北石蜈蚣L.(E.)mandschreiensis相似，但有明顯不同的特征可以將兩者區(qū)分；系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，新種不同個(gè)體之間的遺傳距離為0.3%，與L.(E.)giganteus和L.(E.)maqinensis的遺傳距離均為22%，屬內(nèi)種間遺傳距離與種內(nèi)遺傳距離的差異較大，可以認(rèn)為是不同的種[18].目前伊森石蜈蚣亞屬僅2個(gè)物種具有相關(guān)分子數(shù)據(jù)，而東北石蜈蚣L.(E.)mandschreiensis的相關(guān)分子數(shù)據(jù)尚未見報(bào)道.結(jié)合形態(tài)學(xué)比較及分子系統(tǒng)學(xué)分析結(jié)果，賀蘭石蜈蚣為伊森石蜈蚣亞屬1新種，分類地位明確.