蔣曉霞 徐博文 李偉剛 邵建宏 周傲白雪 唐泰山 趙福振 苗 麗 黃海超 羅寶正*

(1.拱北海關(guān)技術(shù)中心，珠海，519001；2.南京海關(guān)動植物與食品檢測中心，南京，210019；3.鄭州海關(guān)技術(shù)中心，鄭州，450003)

在世界范圍內(nèi)，野生動物及其制品在食用、藥用、收藏、寵物飼養(yǎng)等領(lǐng)域普遍存在[1]，旺盛的市場需求導(dǎo)致針對野生動物及其制品的非法貿(mào)易行為頻發(fā)[2]。多年以來，我國海關(guān)公布的野生動物走私案件涉及獸類(Mammalia)、鳥類(Aves)、兩棲類(Amphibia)、爬行類(Reptilia)等109種，象牙及其制品、穿山甲(Manisspp.)及其制品的非法貿(mào)易多有發(fā)生[3]。在預(yù)防和處置走私瀕危野生動物及其制品行為的過程中，對物種的識別和鑒定是核心要素。脊椎動物是地球上結(jié)構(gòu)最復(fù)雜、進(jìn)化地位最高的生物類型，目前，針對脊椎動物鑒定的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)均以既定物種鑒定為目標(biāo)，采用單一物種鑒定方法，如果樣品背景不明，難以選擇恰當(dāng)方法，鑒定費(fèi)時費(fèi)力。因此，迫切需要建立一種對瀕危脊椎動物鑒定的通用物種鑒定方法。

DNA條形碼鑒定方法于2003年由Hebert等[4]提出，其應(yīng)用領(lǐng)域涵蓋瀕危野生動物保護(hù)、入侵物種識別、食品和中藥材鑒定等。目前，已有研究人員利用DNA條形碼對穿山甲[5]、羚羊角[6]等既定物種及其制品進(jìn)行鑒定，但根據(jù)研究對象生物學(xué)特性以及不同的研究目的建立的條形碼，較難實(shí)現(xiàn)對背景不明的瀕危脊椎動物的快速鑒定。本研究以瀕危脊椎動物樣本為研究對象，通過擴(kuò)增16S rRNA中短的基因片段并測序，將GenBank中BLAST序列比對結(jié)果、遺傳距離計算結(jié)果相結(jié)合，探討該基因片段用于瀕危脊椎動物鑒定的可行性，以期解決瀕危脊椎動物鑒定時間長、成本高的問題，為海關(guān)、森林公安、海警、市場監(jiān)督管理等部門執(zhí)法提供快速、準(zhǔn)確的物種鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集

研究材料均來源于海關(guān)走私罰沒的已知物種的肌肉、角、牙、毛皮、骨骼和鱗片，共計71個(表1)。

表1 研究樣本信息

1.2 樣本預(yù)處理

用酒精棉擦拭各待檢樣本表面，室溫干燥后使用紫外燈照射30 min，清除其上可能附著的影響檢驗(yàn)結(jié)果的異物，以提高檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。針對不同狀態(tài)的樣本，采用不同的取樣方法。肌肉、毛和皮張使用手術(shù)剪取樣約30 mg，置于1.5 mL離心管中；動物角、動物牙、動物骨骼或鱗片使用無菌手術(shù)刀或電鉆取粉末約30 mg，置于1.5 mL離心管中，加入1.0 mL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸(ethylene diaminete traacetic acid，EDTA)充分混勻，37 ℃孵育(或室溫放置)12～24 h后進(jìn)行脫鈣處理，12 000g離心5 min，丟棄上清液，保留沉淀物。

1.3 PCR引物的合成

根據(jù)GenBank中公布的脊椎動物線粒體全基因序列，應(yīng)用生物學(xué)軟件DNAMAN進(jìn)行多序列比對，使用Oligo 7.0在高度保守區(qū)域設(shè)計1對瀕危脊椎動物通用PCR引物，兼顧擴(kuò)增子序列體現(xiàn)物種多樣性信息。上游序列：5′-ACAAATAAGACGAGAAGACCCT-3′，下游序列：5′-TGATCCAACATCGAGGTCGTAA-3′，熔解溫度55 ℃，由上海輝睿生物科技有限公司合成。

1.4 樣本的DNA提取及PCR擴(kuò)增

所有樣本的基因組DNA提取均采用商品化DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.Tissue DNA Kit，Omega，美國)，具體方法參考試劑盒說明書。將皮毛、骨、角、牙和鱗片的消化時間均延長至12 h以上，提取后的DNA置于冰箱中-20 ℃保存?zhèn)溆?。將樣本DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個PCR反應(yīng)體系25 μL，體系組成為：2×TaqPCR Master mix 12.5 μL(天根生化科技(北京)有限公司)，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，補(bǔ)雙蒸水至23 μL，目標(biāo)擴(kuò)增模板2.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰的產(chǎn)物采用Sanger法進(jìn)行雙向測序，由上海生工和拱北海關(guān)技術(shù)中心動物檢疫實(shí)驗(yàn)室完成。

1.5 序列比對和分析

將所測得的序列使用美國國家生物技術(shù)中心(NCBI)GenBank數(shù)據(jù)庫搜索工具BLAST[9]進(jìn)行同源性比較，以確定所測序列是否正確。通過MEGA 7.0軟件，對測序所得基因序列(剔除經(jīng)BLAST比對無法確定的物種)和從GenBank數(shù)據(jù)庫下載與擴(kuò)增引物對應(yīng)的擴(kuò)增子16S rRNA基因序列進(jìn)行比對，基于Kimura-2-parameter(K2P)模型，選擇Transition substitution(Ts)替換類型計算各物種的種內(nèi)和種間遺傳距離[10-11]。

1.6 PCR檢測靈敏度試驗(yàn)

以新鮮牛肉為代表樣本，測試所建立PCR方法的擴(kuò)增靈敏度。按上述方法提取DNA后，使用NanoDrop?DN-1000分析儀(NanoDrop Technologies，美國)測定新鮮牛肉的DNA質(zhì)量濃度為266 ng/μL(A260/A280=1.91)。將其稀釋為100 ng/μL，再進(jìn)行10倍梯度稀釋，共稀釋7個質(zhì)量濃度，分別為：10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng/μL，用上述模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

71個脊椎動物樣本提取的DNA，40種(62個樣本)脊椎動物PCR擴(kuò)增成功，產(chǎn)物大小約286 bp(圖1)。9個未擴(kuò)增成功，分別為象牙樣本8個、綠鬣蜥(Iguanaiguana)皮張樣本1個。

圖1 40種脊椎動物樣本的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.2 基于BLAST比對的物種鑒定

將測序所得62條基因片段在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性比對分析。結(jié)果表明，57個樣本基因測序比對結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的參考序列具有較高相似度(98.21%～100.00%)，測得的序列為16S rRNA基因真實(shí)的序列。其中，東方狍(Capreoluspygargus)和西方狍(Capreoluscapreolus)、輻紋陸龜(Astrochelysradiata)和馬達(dá)加斯加陸龜(Astrochelysyniphora)、阿氏前口蝠鲼(Mantaalfredi)和雙吻前口蝠鲼(Mantabirostris)、直齒真鯊(Carcharhinusbrevipinna)和灰色真鯊(Carcharhinusobscurus)、吻海馬(Hippocampusreidi)和管海馬(Hippocampuskuda)的16S rRNA基因中所測片段序列相似性相同，5個樣本基因測序結(jié)果在屬內(nèi)種間高度一致，只能鑒定到屬的水平。

2.3 遺傳距離分析

在兩兩個體遺傳距離比較中，共141條286 bp的16S rRNA基因序列參與遺傳距離分析，其中從GenBank數(shù)據(jù)庫下載與所測序列相似性相同的16S rRNA基因序列84條，與測序所得基因序列57條。結(jié)果表明，種內(nèi)遺傳距離0～0.5%，種間遺傳距離1.0%～39.9%，最小種間遺傳距離大于最大種內(nèi)遺傳距離，存在明顯的條形碼間隔。鹿屬(Cervus)的種間遺傳距離為1.1%～4.4%，最小種間遺傳距離為梅花鹿(C.nippon)與歐洲馬鹿(C.elaphus)，為1.1%；棕熊屬(Ursus)的種間遺傳距離為1.6%～2.7%；鹿科(Cervidae)的屬間遺傳距離為2.7%～6.8%；?？?Bovidae)的屬間遺傳距離為2.7%～5.6%?？梢姡诸愲A元高的種間遺傳距離平均值較分類階元低的大(表2)。

表2 不同分類階元遺傳距離(K2P)統(tǒng)計

2.4 PCR擴(kuò)增方法的靈敏度測試結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶的亮度隨DNA模板質(zhì)量濃度的降低逐漸下降，質(zhì)量濃度為0.001 ng/μL以上的DNA均可見清晰的286 bp條帶(圖2)。

圖2 牛源性成分DNA質(zhì)量濃度靈敏度的PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

DNA是分子生物學(xué)檢測的基礎(chǔ)，對樣本表面進(jìn)行清潔或直接選取深層組織是試驗(yàn)必需的步驟，針對骨類或與之相似的較堅硬的樣本應(yīng)進(jìn)行細(xì)化以便于水解消化[12]，經(jīng)過脫鈣處理的樣本能夠擴(kuò)增得到目的條帶，而未經(jīng)過脫鈣的樣本無法正常擴(kuò)增[13]。本研究所涉樣本種類繁雜，針對角、牙和骨類制品，如梅花鹿角、象牙和龜殼等均進(jìn)行12 h以上的脫鈣處理；針對動物角、毛、牙、鱗片及其制品等，均使用無水乙醇擦拭消毒，充分干燥后再經(jīng)紫外燈照射，最大限度復(fù)原本質(zhì)，提取高純度DNA。要在相對獨(dú)立的房間內(nèi)進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)增，同時加強(qiáng)室內(nèi)通風(fēng)，以防止DNA交叉污染。由于通用引物擴(kuò)增時極易發(fā)生DNA交叉污染，若在研究過程中未采取有效的防交叉污染措施，將可能導(dǎo)致錯誤的鑒定結(jié)論。

根據(jù)本研究，71個樣本中有62個樣本成功擴(kuò)增，表明本研究設(shè)計的引物通用性較強(qiáng)、擴(kuò)增效果較好，適用于不同組織、不同狀態(tài)的樣本鑒定，包括已經(jīng)風(fēng)化的動物標(biāo)本。然而，部分工藝品特別是一些深加工品，在加工過程中受高溫、高壓、輻射等物理因素及酸堿、添加劑等化學(xué)因素的影響，其DNA已發(fā)生不同程度、不可逆轉(zhuǎn)的變性、斷裂或降解[14]，這不可避免地制約了本方法的適用范圍。有的樣品中DNA含量極低，如本研究中的部分象牙工藝品和蜥蜴皮張，提取DNA后達(dá)不到PCR擴(kuò)增需要的核酸濃度。

GenBank數(shù)據(jù)庫中DNA信息儲備量龐大、內(nèi)容豐富，能夠?yàn)橄嚓P(guān)研究提供必要支撐。對經(jīng)測序獲得的DNA序列進(jìn)行BLAST同源搜索比對，是動物種屬鑒定的必要步驟[15]。本研究建立的DNA條形碼技術(shù)能夠區(qū)分近緣脊椎動物的物種，如梅花鹿和馬鹿，但其中5個樣本的測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對后分別得出2種可能結(jié)果，表明建立的方法對于部分物種近緣種鑒定還有一定的局限性。已有的研究結(jié)果[16-17]顯示，東方狍和西方狍為近緣種，由于分子標(biāo)記序列長度有限，加之序列相似度很高，使用BLAST比對法無法進(jìn)行區(qū)分；劉大偉等[17]認(rèn)為對于近緣物種的鑒定，需結(jié)合其他分析方法以確保鑒定結(jié)論的可靠性，可采用基于COⅠ和Cytb兩個基因片段的不同方法進(jìn)行鑒定。

近年來，種間的最小差異和種內(nèi)的最大差異被用作DNA條形碼間隔，比平均種內(nèi)和種間差異更加有效[18]。本研究中，種內(nèi)的最大K2P遺傳距離為0.5%，種間的最小K2P遺傳距離為1.0%，兩者存在間隔區(qū)域，且分類階元高的種間遺傳距離平均值較分類階元低的大，初步表明該序列可用于瀕危脊椎動物的物種鑒定。此外，由于同科和同屬的樣本數(shù)量較少，后續(xù)研究中有必要擴(kuò)大采樣量以進(jìn)一步驗(yàn)證該條形碼的適用性和可行性。同時，為更好地體現(xiàn)適用性和靈敏度，可與基于COⅠ和Cytb基因序列的DNA條形碼進(jìn)行對比研究。