朱詠珊，羅曉欣，梁浩然，陳正桐，劉成，曹凱，劉少群，周而勛，舒燦偉，鄭鵬

一株茶樹根際細(xì)菌的鑒定與生防效果研究

朱詠珊1，羅曉欣1，梁浩然4，陳正桐4，劉成3，曹凱3，劉少群2，周而勛1，舒燦偉1，鄭鵬2*

1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/廣東省微生物信號與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/群體微生物研究中心，廣東 廣州 510642；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642；3. 海峽兩岸農(nóng)業(yè)發(fā)展研究院，廣東 珠海 519080；4. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642

炭疽病是茶樹的重要病害之一，對茶葉的生長和產(chǎn)量造成嚴(yán)重的危害。目前該病的防治主要依靠化學(xué)藥劑，開發(fā)生物防治產(chǎn)品是推廣茶樹綠色防控技術(shù)主要措施之一。用生理生化特征分析和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定一株茶樹根際生防菌JT68，評估其對茶炭疽病菌的抑菌效果以及菌液對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響。用對扣法檢測該菌株的揮發(fā)性有機(jī)物對茶炭疽菌的抑制效果，并鑒定有機(jī)物的成分。用離體葉片接種的方法測試了菌液對炭疽病的防效。鑒定結(jié)果表明，菌株JT68為解淀粉芽孢桿菌。JT68菌液對茶炭疽病菌的平板抑制率為80.94%，對孢子萌發(fā)抑制率為99.18%。其發(fā)酵液富含細(xì)胞壁降解酶，處理菌絲后使病菌菌絲萎縮變形和產(chǎn)生厚垣孢子。JT68菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物對茶炭疽菌的抑菌率為50.73%，GC-MS檢測發(fā)現(xiàn)揮發(fā)物中主要含有酮類物質(zhì)。離體接種結(jié)果表明，菌液稀釋100倍、稀釋10倍和原液對炭疽菌相對抑制率分別為72.66%、79.70%和83.20%。抑菌譜試驗(yàn)表明該菌株對稻瘟病、香蕉枯萎病、辣椒炭疽病菌、希金斯炭疽菌、大麗輪枝菌和齊整小核菌等6種植物病原菌抑菌率達(dá)到70.0%～93.2%。本研究鑒定的茶樹根際解淀粉芽孢桿菌，具有優(yōu)越的防治病害效果，目前已經(jīng)投入生產(chǎn)，用于制備茶樹專用葉面肥并推廣應(yīng)用，該產(chǎn)品的使用可以替代或減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，實(shí)現(xiàn)茶樹的綠色防控。

茶樹炭疽菌；解淀粉芽孢桿菌；抑菌作用；生物防治

茶樹（）是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。2018年全球茶葉產(chǎn)量約570萬t，其中，我國產(chǎn)量約280萬t，占全球產(chǎn)量的近一半[1]。由炭疽菌（sp.）引起的茶炭疽病是一種嚴(yán)重的真菌性病害，廣泛發(fā)生在世界上茶葉種植地區(qū)。發(fā)病早期，葉片邊緣或頂端形成黑色圓斑，后期逐漸擴(kuò)大病斑中心呈灰白色，可見分生孢子的小黑色點(diǎn)。炭疽菌的侵染導(dǎo)致葉片脫落，茶樹活力減弱[2-3]。此外，該病還對茶葉的產(chǎn)量、品質(zhì)和價值均有影響[2,4]。

膠孢炭疽菌（）已被發(fā)現(xiàn)是引起茶炭疽病的病原種之一，而炭疽菌屬真菌也被列為世界十大真菌病原物之一[2]，能侵染包括園藝作物和林業(yè)等多種植物。隨著茶葉種植面積的快速擴(kuò)大，茶炭疽病普遍發(fā)生，筆者在潮州饒平茶葉種植區(qū)發(fā)現(xiàn)部分茶園發(fā)病率高達(dá)50%～60%。針對該病害目前主要使用化學(xué)殺菌劑，如吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑和多菌靈等進(jìn)行防治[5-6]。但是過量、長期使用化學(xué)農(nóng)藥不僅容易導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、病菌抗藥性增強(qiáng)等問題，影響茶葉的銷售和貿(mào)易[7]，還會影響環(huán)境中的非靶標(biāo)生物，破壞生態(tài)系統(tǒng)平衡，造成環(huán)境惡化。

生物防治法是利用其他生物對病蟲害進(jìn)行防控的方法，是一種環(huán)境友好的綠色防控技術(shù)[8]。為了減少茶葉產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留和保護(hù)環(huán)境，采用生物殺菌劑控制茶炭疽病是茶葉綠色生產(chǎn)的重要措施之一。已有一些微生物被報道能夠用于防治茶葉病害。茶葉葉際分離出的BMO-111對茶擬盤多毛孢菌（）和外擔(dān)子菌（）具有顯著的抑制效果，具有防治茶輪斑病和茶餅病的潛力[9]；茶樹根際分離的粘質(zhì)沙雷氏菌（）ETR17對9種茶樹葉部和根部致病菌具有拮抗作用，ETR17能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、蛋白酶和纖維素，從而降解病原體的細(xì)胞壁[10]；還有研究發(fā)現(xiàn)灰鏈霉菌（）和哈氏赤霉（）聯(lián)合使用可有效控制茶樹根腐病[11]。

本研究通過鑒定一株采自茶樹根際的生防菌株并評估其對茶炭疽病的防治效果，旨在為生物防治產(chǎn)品的研發(fā)和產(chǎn)品化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

生防菌株：解淀粉芽孢桿菌（），從廣東潮州古茶樹根際土壤分離獲得，編號JT68，菌株保藏于廣東省微生物所菌株保藏中心。

供試病原菌：茶炭疽菌（），由湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所提供。

茶樹鮮葉：2019年2月于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院茶園內(nèi)采摘，茶樹品種為金萱，取葉位置為芽下第4片葉。

主要試劑：丙酮、壬酮和癸酮（分析純）均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 培養(yǎng)基配置

LB液體培養(yǎng)基：10?g蛋白胨，5?g酵母粉，10?g NaCl，補(bǔ)充蒸餾水至1?000?mL。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200?g煮沸，取過濾液，加入葡萄糖20?g、瓊脂20?g，加熱溶解后補(bǔ)充蒸餾水至1?000?mL。

上述培養(yǎng)基的pH值均為7.0，高壓滅菌鍋121℃滅菌20?min。配置培養(yǎng)基的試劑購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 生防細(xì)菌的分離與篩選

1.3.1 細(xì)菌的活化和發(fā)酵

從–80℃冰箱取出已保存的菌株JT68。用涂布棒蘸取JT68菌液，涂布在LB平板上，于30℃培養(yǎng)過夜，獲得單菌落。用滅菌牙簽挑取1個單菌落接種到50?mL的LB液體培養(yǎng)基中，以200?r·min-1轉(zhuǎn)速在30℃的搖床振蕩培養(yǎng)48?h獲得生防菌的菌液備用。

1.3.2 生防細(xì)菌的篩選

以茶炭疽菌作為指示菌，采用平板對峙培養(yǎng)法進(jìn)行檢測。本研究采用了3種不同的篩選方法。

兩點(diǎn)對峙法：在距PDA平板外緣2?cm處各放置茶炭疽菌餅（直徑6?mm）和風(fēng)干濾紙片，兩點(diǎn)在一條直線上，共5個重復(fù)。以滴加等量無菌水的濾紙片為空白對照。所有平板在28℃恒溫箱中培養(yǎng)14?d。

點(diǎn)線對峙法：在距培養(yǎng)PDA平板外緣2?cm處放置茶炭疽菌餅，在另一端距外緣2?cm處蘸菌液劃一條垂直直線，共3個重復(fù)。以等量無菌水劃線為空白對照。所有平板在28℃恒溫箱中培養(yǎng)14?d。

五點(diǎn)對峙法：在PDA平板中心放置茶炭疽菌餅（直徑6?mm），取4片無菌濾紙片十字交叉放在菌餅四周，每張濾紙片距平板外緣2?cm。每個濾紙片滴上5?μL JT68菌懸液，在無菌超凈臺風(fēng)干。以接種5?μL無菌水為對照，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。在28℃下培養(yǎng)，3?d后觀察抑菌效果，計算其抑菌帶大小。

菌落凈生長量=菌落直徑－菌餅直徑

相對抑菌率=［（對照組菌落凈生長量－處理組菌落凈生長量）/對照組菌落凈生長量］×100%

1.4 生防細(xì)菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)及生理生化鑒定

對待測菌株進(jìn)行生理生化分析，包括菌落形狀、菌體形狀、細(xì)菌電鏡掃描形狀、革蘭氏染色、生理生化特征測定。

1.4.2 16?S rDNA的PCR擴(kuò)增

以JT68菌株DNA為模板，用細(xì)菌常用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為：PCR預(yù)混液25?μL，上游引物2?μL，下游引物2?μL，DNA 1?μL，滅菌水補(bǔ)足至50?μL；PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃ 3?min；98℃ 10?s，55℃ 10?s，72℃ 15?s，35個循環(huán)；72℃ 2?min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，再送往擎科生物公司進(jìn)行測序。

1.4.3 序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

將測序結(jié)果通過BLAST同源性比對，采用MEGA 5.0軟件基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。建樹所用的序列為：解淀粉芽孢桿菌（NCBI登陸號：NR_117946），枯草芽孢桿菌（NCBI登陸號：NR_118972），暹羅芽孢桿菌（NCBI登陸號：NR_117274），死亡谷芽孢桿菌（NCBI登陸號：NR_075005），漠海威芽孢桿菌（NCBI登陸號：NR_116186），萎縮芽孢桿菌（NCBI登陸號：NR_118290）等12條序列。

1.5 細(xì)胞壁水解酶活性測定

將JT68菌液原液（2×108cfu·mL-1）按照1?000?r·min-1離心15?min后，獲得上清液，稀釋5倍，采用酶聯(lián)免疫吸附劑法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定發(fā)酵液中的酶活。蛋白酶試劑盒（貨號：SBJ-P270-48T）、纖維素酶試劑盒（貨號：SBJ-P271-48T）和幾丁質(zhì)酶試劑盒（貨號：SBJ-P1034-48T）均購自南京森貝伽生物科技有限公司，具體步驟參照產(chǎn)品說明書。

1.6 孢子萌發(fā)和菌絲生長的抑制作用

挑取3塊直徑為6?mm的茶樹炭疽病菌餅于PDB液體培養(yǎng)基中，置于30℃搖床振蕩培養(yǎng)5～7?d后用一層擦鏡紙過濾備用。吸取JT68菌株菌液25?μL置于裝有凹玻片的已滅菌的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中墊濕潤的濾紙。然后吸取等量的病原菌孢子懸液于凹玻片上，輕微振蕩、搖勻。另以無菌水代替菌液作為空白對照。將搖勻的培養(yǎng)皿放置在21℃恒溫培養(yǎng)箱中，黑暗處理24?h[12]。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。處理后取出凹玻片吸取混合液于血球計數(shù)板上，稀釋至孢子濃度為每毫升1×106個時在顯微鏡下計數(shù)，統(tǒng)計分生孢子總數(shù)以及萌發(fā)的分生孢子數(shù)，計算分生孢子萌發(fā)率以及菌液對分生孢子萌發(fā)的抑制率。以孢子萌發(fā)的芽管超過孢子長度一半為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)[13]，按以下公式計算分生孢子平均萌發(fā)率和菌液對孢子萌發(fā)的抑制率：

萌發(fā)率=（已萌發(fā)的分生孢子數(shù)/分生孢子總數(shù)）×100%

抑制率=［（對照萌發(fā)率－藥劑處理萌發(fā)率）/對照萌發(fā)率］×100%

在PDA平板上滴加50?μL均勻涂布JT68菌液，待半干時覆蓋一層滅菌玻璃紙，排除氣泡使之平整，培養(yǎng)基中間接種茶炭疽菌菌餅?？瞻捉M處理操作同上，但不涂菌液，放置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)5?d。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。觀察時撕下玻璃紙，剪取少量最外緣菌絲于顯微鏡下觀察，以保證真實(shí)的菌絲狀態(tài)。

1.7 揮發(fā)性有機(jī)物的抑菌效果和物質(zhì)鑒定

在LB平板上滴加50?μL JT68菌液（2×108CFU·mL-1），涂布均勻，晾干待用。另在PDA平板中心接種一個茶炭疽病菌菌塊。再將兩個平板對扣，并用封口膜密封，以等量無菌水涂布LB平板為空白對照，設(shè)3組重復(fù)，放在28 ℃恒溫箱培養(yǎng)1周，記錄茶炭疽病菌菌落直徑。計算相對抑制率：RI=(0-)/0×100%，其中RI為相對抑制，0為對照組菌落凈生長量，為處理組菌落凈生長量。

將JT68菌種接種于100?mL LB液體培養(yǎng)基中，在30℃ 200?r·min-1條件下恒溫振蕩培養(yǎng)48?h，得到菌液。瓶口不加塞，用三層滅菌錫箔紙封口并用橡筋扎緊，錫箔紙邊緣用封口膜密封，以免發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)物漏出。以不加細(xì)菌的LB培養(yǎng)基為空白對照組。將菌液連瓶送至華南農(nóng)業(yè)大學(xué)科技樓色譜分析室，采用頂空固相微萃取法對三角瓶內(nèi)的頂空氣體成分進(jìn)行分析。將萃取頭插入頂空瓶中40℃頂空吸附揮發(fā)性物質(zhì)40?min后，立即插入GC-MS進(jìn)樣口，在240℃下解吸附5?min后，進(jìn)行GC-MS分析。色譜條件：采用Agilent 19091S-433UI HP-5ms Ultra Inert色譜柱（30?m×250?μm×0.25?μm）；色譜程序：初始溫度50℃；以10℃·min-1升至200℃，保持5?min；以5℃·min-1升至220℃，保持10?min。質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源，檢測器電壓350?V，離子源溫度200℃，傳輸線溫度250℃，電子能量70?eV，掃描質(zhì)量范圍35～350?m/z。試驗(yàn)設(shè)置重復(fù)3次。

1.8 純品體外拮抗驗(yàn)證

在每個培養(yǎng)皿中放入直徑1?cm的濾紙片，分別加入100?μL的2-丙酮、2-壬酮和2-癸酮，對照組蓋子里加入100?μL滅菌水，另一個PDA培養(yǎng)基中央接種直徑為6?mm的茶樹炭疽病菌餅。將兩個平板對扣并用封口膜密封，設(shè)3組重復(fù)，放至28℃恒溫箱培養(yǎng)1周，記錄茶炭疽病菌菌落直徑并計算相對抑制率。

1.9 茶炭疽病室內(nèi)抑菌效果測定

選取茶樹芽尖下第4葉，保證長勢一致無病害，葉片清洗干凈，并晾干用75%的酒精浸泡約5?s，浸泡時間不可過長以免灼傷葉片，再用無菌水清洗3次，放至無菌超凈臺處晾干。取菌懸液原液（2×108cfu·mL-1）和10倍、100倍稀釋液進(jìn)行試驗(yàn)，每個樣品處理3張葉片，設(shè)置5個重復(fù)。以無菌水為空白對照組。每組菌液分別按1∶1?000加入50%的曲拉通表面活性劑，有助于生防菌在葉片上充分展開，分布均勻。用無菌棉蘸取菌液均勻涂抹在葉片正反面，放入人工氣候箱中培養(yǎng)一晚，培養(yǎng)條件為濕度95%、溫度26℃。第2天進(jìn)行接種，每片葉片葉脈左右兩側(cè)各對稱接種2次，用接種針輕輕扎傷葉片（不刺破）。上方左右兩個位置分別接種1個空白培養(yǎng)基和1個茶炭疽菌菌餅，下方左右位置分別接種1個炭疽菌餅和1個空白培養(yǎng)基。用濕潤無菌脫脂棉花覆蓋保濕。接種葉片平攤放入人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為濕度95%，溫度26℃，12?h光暗交替。每天觀察葉片癥狀，記錄20?d生長情況，測量病斑直徑，利用Photoshop軟件計算面積，統(tǒng)計各處理組的相對抑制率：

相對抑制率=（對照組病斑面積－處理組病斑面積）/對照組病斑面積×100%

1.10 JT68抗菌譜檢測

采用PDA培養(yǎng)基將稻瘟病菌（）、香蕉枯萎病菌（f. sp.）、大麗輪枝菌（）、齊整小核菌（）、辣椒炭疽病菌（）、希金斯炭疽菌（）、瓜疫霉病菌（）及立枯絲核菌（AG1-IA）8種供試病原真菌于25℃培養(yǎng)7?d，用直徑為6?mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，分別接種至PDA平板中央，采用上述五點(diǎn)對峙法檢測JT68抑菌譜。試驗(yàn)設(shè)置3個重復(fù)。抑菌率計算如前所述。

1.11 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌株的篩選

對峙培養(yǎng)的結(jié)果表明，采用五點(diǎn)對峙法、點(diǎn)線對峙法和兩點(diǎn)對峙法的抑菌率分別為80.94%、74.46%和74.68%（圖1），表明JT68菌株的菌液對茶炭疽病菌具有較高的抑菌效果。

2.2 JT68菌株的鑒定

2.2.1 JT68的形態(tài)鑒定

在LB固體培養(yǎng)基上，JT68菌株菌落呈白色圓形，邊緣不規(guī)則，表面光滑、濕潤、黏稠，不易挑起。革蘭氏染色為陽性，菌體桿狀，有芽孢，初步鑒定該菌株可能為解淀粉芽胞桿菌屬sp.（圖2）。

2.2.2 JT68的生理生化性質(zhì)

經(jīng)檢測JT68能利用蔗糖、果糖、甘露醇和麥芽糖，接觸酶反應(yīng)、運(yùn)動性測定、淀粉水解、V-P試驗(yàn)、硝酸鹽還原、明膠液化等生理生化試驗(yàn)呈陽性，不能利用葡萄糖和乳糖，需氧，氧化酶反應(yīng)、甲基紅試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)等呈陰性（表1）。根據(jù)細(xì)菌學(xué)鑒定手冊判定該菌為芽孢桿菌屬（）。

2.2.3 JT68的分子生物學(xué)鑒定

JT68菌株的16?S rDNA基因PCR產(chǎn)物為一條約1?500?bp的片段，將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST同源性比對，結(jié)果顯示JT68菌株的16?S rDNA基因長度為1?304?bp，將該序列提交到NCBI網(wǎng)站，登錄號為MK928420。BLAST比對發(fā)現(xiàn)其與解淀粉芽孢桿菌（）、枯草芽孢桿菌（）、暹羅芽孢桿菌（）、死亡谷芽孢桿菌（）、漠海威芽孢桿菌（）、萎縮芽孢桿菌（）的16?S rDNA序列相似性高。選取12株同源性較高的不同物種的基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建（圖3），結(jié)果表明JT68菌株與解淀粉芽孢桿菌（）聚為一支，置信度高。

注：A、B、C為對照；D、E、F為JT68對茶炭疽菌的抑菌效果

圖2 JT68的菌落圖(A)、形態(tài)圖(B)和革蘭氏染色(C)

表1 JT68菌株的生理生化特性

注：+，陽性；-，陰性

Note: +, positive. -, negative

綜合分子鑒定與生理生化鑒定結(jié)果，最終確定JT68菌株為解淀粉芽孢桿菌（）。

2.3 JT68菌液中細(xì)胞壁水解酶活性

蛋白酶、纖維素酶及幾丁質(zhì)酶是真菌細(xì)胞壁的主要水解酶，通過檢測發(fā)現(xiàn)JT68發(fā)酵液中它們的活性分別為591.6?mU·L-1、127.65?U·L-1和190.85?U·L-1（圖4）。

2.4 JT68對茶樹炭疽病菌孢子和菌絲的影響

JT68菌液能顯著抑制分生孢子的萌發(fā)。光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對照組的茶炭疽菌孢子萌發(fā)率為61.1%（圖5-A）。用JT68菌液處理后的孢子萌發(fā)率極低，在視野中僅能找到幾個萌發(fā)孢子，萌發(fā)率近為1%（圖5-B），說明JT68菌液可以完全抑制茶炭疽病菌的萌發(fā)。菌絲處理的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組菌絲寬度為8.0～9.0?μm，處理組菌絲形態(tài)發(fā)生了顯著的變化，菌絲萎縮變細(xì)且在隔膜處膨大，菌絲寬度僅有4.0～5.0?μm（圖5-C）。還可見胞質(zhì)外泄，菌絲中心或頂端形成隔膜且菌絲近末端膨大形成厚垣孢子（圖5-D），并隨著培養(yǎng)時間增長厚垣孢子數(shù)逐漸增多。

圖3 菌株JT68的系統(tǒng)發(fā)育樹

注：A：蛋白酶；B：纖維素酶；C：幾丁質(zhì)酶

2.5 JT68菌株揮發(fā)性有機(jī)物對菌絲的抑制效果和鑒定

通過對扣試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，JT68菌液產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對茶炭疽病菌抑制率為50.73%（圖6）。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對JT68發(fā)酵過程中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，從30℃條件下發(fā)酵2?d的JT68菌液中鑒定出6種主要的揮發(fā)性有機(jī)化合物，均與NIST譜庫中檢測到的物質(zhì)具有較高的相似指數(shù)（SI）≥80%。這些化合物主要包括烷烴和酮類（表2），其中2-庚酮、2-壬酮和2-癸酮的含量最多，分別為24.176?8%、7.698?5%和1.344?7%。

注：A：以無菌水為空白對照中茶炭疽菌孢子正常萌發(fā)；B：JT68菌液處理后對茶炭疽菌的影響；C：PDA平板上正常生長的茶炭疽菌菌絲形態(tài)；D：JT68菌液處理后PDA平板上茶炭疽菌的菌絲形態(tài)

2.6 有機(jī)物純品對菌絲的抑制效果

對JT68菌液揮發(fā)性有機(jī)物測定中含量最高的2-庚酮、2-壬酮和2-癸酮的抑菌效果進(jìn)行測定。對扣試驗(yàn)結(jié)果表明，3種有機(jī)物純品對炭疽菌均有顯著的抑菌效果，抑菌率均達(dá)80%以上（表3）。

2.7 JT68菌液對茶葉炭疽病的抑制作用

離體接種試驗(yàn)表明，空白對照組的茶葉發(fā)病較快，接種3?d后葉片出現(xiàn)深棕色病斑，發(fā)病率為100%，20?d后病斑面積為2.06?cm2。JT68發(fā)酵原液處理組顯著抑制病斑發(fā)展，葉片病斑面積明顯減小，20?d后病斑面積為0.35～0.56?cm2且隨著生防菌液濃度的增加而減小；菌液稀釋100倍、稀釋10倍和原液的條件下對茶炭疽病的相對抑制率分別為72.66%、79.70%和83.20%（表4、圖7），表明該菌株菌液對茶炭疽病的防治效果很好。

2.8 JT68對不同病原真菌的廣譜抑菌作用

五點(diǎn)對峙法檢測結(jié)果顯示，菌株JT68可以完全抑制稻瘟病菌、大麗輪枝菌、齊整小核菌的菌絲生長，抑菌率達(dá)100%。對希金斯炭疽菌、香蕉枯萎病菌、辣椒炭疽病菌的抑菌率分別為93.2%、70.3%和79.7%（圖8、表5）。但對瓜疫霉病菌及立枯絲核菌沒有抑菌作用。

注：A：空白對照；

B：JT68揮發(fā)性有機(jī)物處理

Note: A: Blank control.

B:treated with VOCs of JT68

圖6 JT68菌株揮發(fā)性有機(jī)物對茶炭疽菌的抑制作用

Fig. 6 Inhibitory activity of VOCs from bacteria strain JT68 to

表2 JT68菌株揮發(fā)性有機(jī)物成分鑒定結(jié)果

注：只列出了相似指數(shù)≥80%的成分，微量成分也在JT68揮發(fā)物中檢測到但未列在表中

Notes: Only components with similarity index≥80% were listed, and micro constituents were also detected in JT68 volatiles but not listed in the table

表3 3種有機(jī)物純品的抑菌效果

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

Note: The data are mean±SD

表4 茶炭疽菌活體接種病斑面積和抑制率

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（<0.05）

Note: The data are mean±SD. Lowercase letters in the same row mean significant difference (<0.05)

注：A為清水對照組，B為生防菌液稀釋100倍，C為生防菌液稀釋10倍，D為生防菌液原液。黑色箭頭表示接種病原菌，白色箭頭表示接種水瓊脂

注：A為稻瘟病菌，B為香蕉枯萎病菌，C為辣椒炭疽病菌，D為希金斯炭疽菌，E為大麗輪枝菌，F(xiàn)為齊整小核菌

表5 JT68菌對其他病原真菌的抑菌率

3 討論

隨著人們生活水平的提高，飲食安全受到廣泛關(guān)注。茶原產(chǎn)于中國，是世界上最受歡迎的飲料之一。茶葉產(chǎn)品中的化學(xué)殘留物嚴(yán)重影響人們健康，生物防治方法可以減少化學(xué)農(nóng)藥的使用[14-16]。生物防治的目的是應(yīng)用生物體或其活性成分來實(shí)現(xiàn)病害的防控。茶葉產(chǎn)品直接從茶葉和茶芽中提取，因而植物病害生物防治在有機(jī)茶生產(chǎn)的病害控制中至關(guān)重要[17]。在本研究中，從茶樹根際土壤中篩選獲得一株具有生防潛力的菌株并進(jìn)行鑒定，評估其對茶炭疽病的防效。

目前，解淀粉芽孢桿菌因其優(yōu)越的生防潛力和在惡劣環(huán)境條件下的高穩(wěn)定性而廣泛應(yīng)用在生物防治產(chǎn)品。解淀粉芽孢桿菌的抑菌作用主要作用方式包括抗菌化合物的產(chǎn)生、生物膜的空間競爭、植物激素的產(chǎn)生、細(xì)胞外細(xì)胞壁降解酶分泌和誘導(dǎo)植株抗性[18-22]。本研究中，菌株JT68可以合成抗菌化合物，從而抑制炭疽病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)，對茶炭疽病菌的抑菌率達(dá)80%左右。其菌液還可以完全抑制稻瘟病菌、大麗輪枝菌和齊整小核菌菌絲的生長，且對希金斯炭疽菌、香蕉枯萎病菌、辣椒炭疽病菌的抑菌率達(dá)到70.3%～93.2%，表明該菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)抑菌譜廣、抑菌效果好。

由于病原菌分生孢子萌發(fā)和菌絲的生長發(fā)育在病原入侵寄主植物中起著關(guān)鍵作用，研究發(fā)現(xiàn)JT68菌液幾乎完全抑制了茶炭疽菌分生孢子的萌發(fā)，菌絲發(fā)育變態(tài)且在菌絲中心形成厚垣孢子，在植物葉片或果實(shí)采后炭疽病防治中具有巨大的生防潛力。從JT68發(fā)酵液中檢測出3種重要的細(xì)胞壁降解酶的酶活性，其中包括蛋白酶、纖維素酶和幾丁質(zhì)酶，發(fā)酵液中酶活性為591.6?mU·L-1、127.65?U·L-1和190.85?U·L-1。眾所周知，生防細(xì)菌可以分泌細(xì)胞壁降解酶來降解真菌細(xì)胞壁，導(dǎo)致真菌病原體競爭活性下降[23]。真菌細(xì)胞壁由幾丁質(zhì)、葡萄糖、多糖和粘多糖、蠟和色素組成[24]。蛋白酶與細(xì)胞壁的外蛋白層結(jié)合，打開蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，暴露內(nèi)葡聚糖層和幾丁質(zhì)微原纖維。纖維素酶將纖維素分子分解為單糖，如葡萄糖或其他低聚糖。幾丁質(zhì)酶溶解并消化幾丁質(zhì)及其衍生物，形成乙酰葡萄糖胺，分解真菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)[25]。由于JT68使病原真菌缺乏營養(yǎng)物質(zhì)，菌絲受其他生理和環(huán)境脅迫的影響，形成了厚垣孢子[26]。JT68分泌的細(xì)胞壁降解酶可能會導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)滲漏。另外，JT68的代謝物可能導(dǎo)致菌絲死亡，破壞菌絲質(zhì)膜，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)液體蒸發(fā)，隨后導(dǎo)致菌絲萎縮[27-28]。

植物根部微生物產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物具有抑制植物病原真菌的生長作用和植物促生作用[29]，利用根際揮發(fā)物或根際細(xì)菌作為生物防治劑具有重要的農(nóng)業(yè)應(yīng)用前景。據(jù)報道，解淀粉芽孢桿菌TJ產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物對蘋果腐爛病菌有強(qiáng)烈的抑制效果，4-乙基苯酚、2-乙基環(huán)己酮和反-2-壬烯醛為主要的抑菌有效成分[30]。Gotor-Vila等[31]發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌CPA-8產(chǎn)生具有抑菌作用的揮發(fā)性有機(jī)物中的主要有效成分為噻吩，能有效防控櫻桃果腐病。趙月菊等[32]發(fā)現(xiàn)2-壬酮抑制黃曲霉的生長、孢子的萌發(fā)、菌絲形成和毒素產(chǎn)生。本研究中JT68能產(chǎn)生具有抑菌作用的揮發(fā)性有機(jī)物，對茶炭疽病菌抑制率為50.73%，GC-MS檢測發(fā)現(xiàn)有效成分主要為庚酮、壬酮等酮類物質(zhì)，且有研究表明酮類化合物的抗真菌活性與酮類化合物中的碳原子數(shù)呈負(fù)相關(guān)[33]，這為熏蒸型生物農(nóng)藥提供了理論基礎(chǔ)。

隨著國家對農(nóng)業(yè)的支持，微生物肥料在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用越來越受到重視。JT68菌株對炭疽菌具有巨大的生物防治潛能，有助于進(jìn)一步加強(qiáng)炭疽菌綜合防治，減少化學(xué)殺菌劑的使用。在今后的研究中，可以對該菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能鑒定，開發(fā)成一種新型抗生素。目前該菌株已由海峽兩岸農(nóng)業(yè)科技股份有限公司投產(chǎn)，用于制備微生物肥料，作為茶樹的專用葉面肥，在貴州、廣東等省份的茶區(qū)推廣近2?000?hm2，極大提高了茶樹的防病能力，并對茶樹的提質(zhì)增效發(fā)揮重要作用。

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Identification of a Tea Rhizosphere Bacterium and its Biocontrol of Tea Anthracnose Disease

ZHU Yongshan1, LUO Xiaoxin1, LIANG Haoran4, CHEN Zhengtong4, LIU Cheng3, CAO Kai3, LIU Shaoqun2, ZHOU Erxun1, SHU Canwei1, ZHENG Peng2*

1. College of Agriculture, South China Agricultural University/Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Signals and Disease Control/Integrative Microbiology Research Center, Guangzhou 510642, China; 2. College of Horticulture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 3. Cross-strait Agricultural Development Research Institute, Zhuhai 519080, China; 4. College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China

Tea anthracnose () is one of the most important fungal diseases ofworldwide, which causes serious damage to tea growth and production. The control of tea anthracnose is mainly dependent on chemical fungicides. To promote green prevention and control in tea plantation, development of biocontrol agents is critically important. A bacterium named JT68 isolated from tea rhizosphere was identified based on physiological and biochemical analysis and PCR. The inhibition effects of fermented broth JT68 on confrontation culture, mycelia growth and spores germination were determined. The effect of volatile organic compounds (VOCs) of JT68 was tested and the components were identified by GC-MS. The control effect of JT68 was determined using detached leaf method. The results of this study shows that the strain JT68 was identified as. Plate confrontation shows that the inhibition rate of fermentation broth of JT68 againstwas 80.94%. Co-culture shows that the inhibition rate of spore germination ofwas 99.18%, and the mycelia of pathogen shrank and formed chlamydospores. The VOCs of JT68 could inhibit 50.73% mycelia growth of. Ketones such as 2-Nonanone and 2-Undecanone were revealed as major components in VOC through GC-MS analysis. Leaf detached inoculation shows that the relative inhibition rates of the original fermentation broth, 10-fold, and 100-fold dilutions were 83.20%, 79.70% and 72.66%, respectively. Furthermore, our study found that JT68 strongly inhibited the growth of,,,,andwith the inhibition rates of 70.0%- 93.2%. Our study provided a biocontrol agentfrom tea rhizosphere, which showed superior biocontrol effect against. This strain had been applied to develop biofertilizer and widely used in the field, which would reduce the use of chemical fungicide and implement prevention and control in tea plantation.

tea anthracnose,, inhibition effect, biological control

S571.1

A

1000-369X(2022)01-087-14

2021-09-03

2021-10-30

廣東省自然科學(xué)基金（2021A1515012091）、廣州市科技計劃（202102020290）、廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計劃（2019B020218009）

朱詠珊，女，本科生，主要從事生物防治研究，13533617512@163.com。*通信作者：zhengp@scau.edu.cn

（責(zé)任編輯：趙鋒）