張明亮,王俊,翁可欣,李力,黃建忠,林清強*

1(福建師范大學 生命科學學院,福建 福州,35018) 2(工業(yè)微生物發(fā)酵技術國家地方聯合工程研究中心,福建 福州,35018)

二十二碳六烯酸(C22:6,cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid,DHA)對人類健康起重要生理作用,能影響細胞膜功能、增強機體免疫、治療抑郁癥、治療和預防心腦血管疾病、抗腫瘤、抗炎、對抗肥胖、促進大腦發(fā)育、促進視力發(fā)育和預防老年癡呆等[1]。人類和哺乳動物無法從頭合成DHA,只能從食物中攝取。DHA的主要來源是魚類和植物。由于魚油容易受環(huán)境污染,存在食品安全隱患,人們對從可持續(xù)、安全和經濟生產DHA的替代資源的研究越來越廣泛。許多微生物物種/菌株具有大量合成DHA的能力,且DHA占總脂肪酸的比例很高,這些天然生產者主要包括海洋細菌、真菌、原生生物和微藻。破囊壺菌(Aurantiochytriumsp.)是從海水中分離得到的海洋單細胞真菌,其生長快,生物量高,油脂及DHA含量較高,一直以來被認為是理想的DHA生產菌株[2-4]。同時,破囊壺菌與裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)的同源性很高[5],后者也是當前DHA產業(yè)化的主要生產菌,其安全性已得到論證[6]。

近些年來,微生物生產DHA的發(fā)酵工藝研究比較多,如通過控制溶氧、pH及優(yōu)化碳源提高DHA產量等[7-9]。溫度對產油微生物生物量、油脂含量及組成的影響已有一些研究報道[5,10-12]。溫度是DHA生物合成的一個非常重要的環(huán)境因素。本課題組前期研究低溫脅迫對裂殖壺菌DHA生物合成及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)表達的影響,發(fā)現低溫有利于DHA的積累,低溫脅迫下SOD的mRNA表達量最高[13]。近年,溫度促進DHA積累的機制也有一些研究報道,MA等[14]通過轉錄組測序手段研究了低溫對Aurantiochytriumsp.積累DHA的影響,發(fā)現參與信號轉導、細胞成分的生物合成、糖脂代謝的相關基因的差異表達對菌體低溫適應至關重要；HU等[15]研究了低溫對裂殖壺菌生物合成DHA的影響及機制,低溫可以顯著增加DHA占總脂肪酸的含量,但負責DHA生物合成的聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)途徑基因的表達水平沒有明顯的差異,而支鏈氨基酸降解途徑和戊糖磷酸途徑及其相關基因表達明顯上調,飽和脂肪酸生物合成(脂肪酸合成途徑基因和蘋果酸酶)明顯下調,這促進了大量底物乙酰-CoA進入PKS途徑合成DHA。低溫可以顯著提高DHA占總脂肪酸的含量,但對細胞生物量的積累不利。另外,不同溫度對油脂的積累也有明顯的影響,但如何平衡三者量的關系,溫度優(yōu)化調控可能是DHA工業(yè)化發(fā)酵生產過程中的關鍵。

本研究以Aurantiochytriumsp.FN21為研究對象,該菌為經纖維素水解液馴化的破囊壺菌突變株,在富營養(yǎng)培養(yǎng)基中擁有積累較高DHA水平的能力[16]。通過優(yōu)化溫度調控策略,實現生物量、總脂肪酸含量及DHA的含量平衡,以促進DHA產量提高,也為提高DHA產量及品質提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備

YXQ-2S-30SⅡ高壓滅菌鍋,上海博迅實業(yè)有限公司;SW-CJ-2G超凈工作臺,蘇州凈化設備有限公司;ZHWY-2122B雙層全控溫搖床,上海智誠分析儀器有限公司;SBA-40D生物傳感器,山東省科學院生物研究所;GUJS-15-100 AUTOBIO型全自動機械攪拌成套不銹鋼發(fā)酵罐,鎮(zhèn)江東方生物工程設備技術有限責任公司;Microfuge?22R高速臺式冷凍離心機,BECKMAN COULTEK;DO電極、pH電極計,METTLER TOLEDO;6890C-5975N氣質聯用儀,Agilent。

1.2 菌株

破囊壺菌(Aurantiochytriumsp.FN21),海水中分離篩選并通過纖維素水解液馴化,保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30,蛋白胨10,酵母浸汁粉5,海水晶15。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖含量為90 g/L,其他配方參考課題組前期已發(fā)表文獻[16]。

1.4 培養(yǎng)條件

15 L發(fā)酵罐發(fā)酵：按接種量5%～10%將種子液移入發(fā)酵罐中,初始發(fā)酵體積8 L,葡萄糖20 g/L,通氣量1.0～2.0 vvm(air volume/culture volume/min),攪拌速度200～600 r/min(根據溶液控制),在24～108 h間流加700 g/L的葡萄糖,每隔12 h取樣,測定殘?zhí)呛?、生物量、油脂含量及DHA含量。

1.5 測定方法

發(fā)酵液殘?zhí)呛繙y定：取1 mL發(fā)酵樣品8 000 r/min,5 min離心,去除菌體及固體殘渣,取上清液,稀釋至合適濃度,使殘?zhí)侵迪陆抵?.6～0.8 g/L,使用生物傳感器測定樣品葡萄糖含量,殘?zhí)橇?測量值×稀釋倍數。細胞干重、總脂肪酸含量及脂肪酸組成分析參考課題組前期發(fā)表的文獻[16]。

2 結果與分析

2.1 溫度對破囊壺菌生物量、總脂肪酸產量及DHA產量的影響

ZENG等[12]考察了不同溫度對裂殖壺菌產DHA的影響,發(fā)現低溫(15 ℃)會延長細胞的培養(yǎng)的時間,當溫度>35 ℃時,細胞生長受到抑制,20～30 ℃為裂殖壺菌較佳的培養(yǎng)溫度。在搖瓶發(fā)酵水平考察了溫度對破囊壺菌生物量、總脂肪酸產量及DHA產量的影響,分別設置了15、20、25、28、30、35 ℃的培養(yǎng)溫度。從圖1-a可知,當培養(yǎng)溫度為15 ℃時,Aurantiochytrium.sp.FN21的生物量明顯減少,其生長受到抑制。當溫度為20～35 ℃時,可以獲得較大的菌體生物量,尤其是當溫度為28 ℃時,菌體生物量最大為41.41 g/L,說明此溫度為菌體最適的生長溫度。由圖1-b可知,溫度對Aurantiochytriumsp.FN21總脂肪酸的作用規(guī)律與生物量類似,20～35 ℃的培養(yǎng)溫度較利于破囊壺菌油脂的積累。當培養(yǎng)溫度為28 ℃時,收獲最大的總脂肪酸量達到18.13 g/L。15 ℃培養(yǎng)時,總脂肪酸產量較低(4.41 g/L),主要是由于此溫度下培養(yǎng)獲得的生物量較低。

a-生物量；b-油脂含量；c-DHA含量圖1 溫度對破囊壺菌細胞生長、油脂含量及DHA含量的影響Fig.1 Effects of temperature variation on biomass,total lipid and DHA production by Aurantiochytrium sp.FN21.

在不同溫度培養(yǎng)條件下,破囊壺菌的DHA產量變化較大,其變化趨勢總體與菌體生物量及總脂肪酸產量的變化趨勢呈正相關,但也有一些差異。當培養(yǎng)溫度為15 ℃時,DHA產量最低為2.08 g/L,主要是因為該溫度下菌體生物量及總脂肪酸量均比較低。隨著培養(yǎng)溫度的升高,DHA產量顯著提高,培養(yǎng)溫度為28 ℃時達到最大值7.42 g/L,但培養(yǎng)溫度進一步提高,DHA產量的降幅也明顯增加(圖1-c所示),說明DHA占總脂肪酸的比例可能有明顯的下降。

2.2 溫度對破囊壺菌油脂含量及組成的影響

從表1可知,不同培養(yǎng)溫度對破囊壺菌油脂含量及組成的影響較大。15 ℃培養(yǎng)時,菌體油脂占細胞干重含量最低(18.02 g/L),但DHA占總脂肪酸的比例最高為47.16%。當培養(yǎng)溫度為25～28 ℃時,油脂含量處于最高區(qū)間(42.81～43.78 g/L),說明此溫度階段有利于油脂積累。隨著溫度的升高,DHA占總脂肪酸的含量降低,從15 ℃時的47.16%降低到了35 ℃時的32.71%。另外,二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid,DPA)與DHA的比值(DPA/DHA)不斷增加(從0.12到0.33),說明低溫有利于DHA的積累,同時可降低DPA的生成。而C16∶0(棕櫚酸)的含量隨著培養(yǎng)溫度的升高而升高,說明高溫利于飽和脂肪酸的形成。特別值得注意的是,溫度越低,奇數不飽和脂肪酸(C15)含量越低,可能低溫有利于脂肪酸α-氧化途徑的進行,因為奇數碳脂肪酸是通過此途徑形成[17]。

表1 不同培養(yǎng)溫度下破囊壺菌脂肪酸的組成Table 1 Fatty acid compositions (of total fatty acids) of Aurantiochytrium sp.FN21 under different temperature

2.3 分階段控溫提高DHA產量

破囊壺菌發(fā)酵過程可分為細胞數量增長期和細胞體積增長期。在第1個時期,細胞數量增加,體積增加不明顯。第2個時期細胞數目幾乎不增加,細胞體積變大,胞內脂質大量積累。由上述結果可知,當培養(yǎng)溫度為28 ℃時,可以收獲最大的菌體生物量,當溫度區(qū)間為25～30 ℃時,總脂肪酸占細胞干重的量最優(yōu)。隨著溫度的降低,能夠明顯的增加DHA占總脂肪酸的含量。基于Aurantiochytriumsp.FN21的生長特性,我們設計了以下變溫策略：0～84 h時28 ℃培養(yǎng),84～120 h時20 ℃培養(yǎng)(二階段控溫)；0～84 h培養(yǎng)溫度為28 ℃,84～108 h為25 ℃,108～120 h為15 ℃(三階段控溫),分別研究其對破囊壺菌生長、油脂及DHA產生的影響,結果如表2所示。

表2 控溫方式對破囊壺菌發(fā)酵的影響Table 2 Effects of different temperature control mode on the fermentation of Aurantiochytrium sp.FN21

由表2可知,與對照組(全程28 ℃培養(yǎng))相比,二階段和三階段控溫培養(yǎng)對破囊壺菌生物量及油脂含量均有微降,而DHA占總脂肪酸量的比例有顯著提高,三階段控溫DHA含量46.39%,二階段控溫時DHA含量為44.79%,相比對照組,分別提高了11.33%和10.94%。采用三階段控溫策略可以有效地平衡生物量、油脂含量及DHA占總脂肪酸含量三者的關系,使它們均達到較高的水平,最終DHA產量達8.29 g/L,比對照提高了11.73%。

2.4 三階段控溫對分批補料培養(yǎng)破囊壺菌產DHA的影響

根據以上實驗結果,我們在15 L發(fā)酵罐中采取三階段控溫策略高密度發(fā)酵破囊壺菌生產DHA,實驗結果見圖2。

圖2 采用三階段變溫發(fā)酵破囊壺菌的生長、油脂含量 及DHA積累曲線Fig.2 The curve of growth,total lipid and DHA accumulations by Aurantiochytrium sp.FN21 under three-phase temperature shifting

從圖2可知,在整個發(fā)酵過程中,破囊壺菌的生物量、油脂含量及DHA含量均不斷提高。當84 h變溫(25 ℃,84～108 h)后,菌體生物量、總脂肪酸含量及DHA含量增幅減小,108 h開始以15 ℃發(fā)酵,生物量有略微下降,可能是由于細胞停止生長,小部分菌體開始裂解。120 h時油脂含量有所降低,從108 h的55.15 g/L減少到了53.63 g/L,說明低溫減少總脂肪酸占比；而120 h比108 h的DHA產量略有增加(從26.99 g/L增加到27.17 g/L),這主要由于DHA占總脂肪酸的含量還在上升,從48.62%上升到了50.66%。

來源于Schizochytrium和Aurantiochytrium的高產DHA的菌株,DHA含量均可達40%以上[4]。采用分批補料的高密度培養(yǎng)模式,可以最大程度的得到高的生物量、油脂含量及DHA產量。CHANG等[18]研究了溶氧對高密度培養(yǎng)Schizochytriumsp.S31產DHA的影響,優(yōu)化發(fā)酵工藝后DHA產量達21.26 g/L,占總脂肪酸的33.94%；LI等[19]優(yōu)化了碳源使用策略,AurantiochytriumlimacinumSR21發(fā)酵得到32.36 g/L,占總脂肪酸的43.70%。這兩項研究獲得的DHA產量均處于較高水平,但DHA占總脂肪酸含量的比例偏低,說明還有一定的提升空間。YIN等[9]采取分階段控制pH策略,優(yōu)化了發(fā)酵中細胞生長與DHA合成的平衡關系,最終,生物量、油脂含量及DHA占總脂肪酸含量均得到提高。本研究借鑒此策略,經三階段控溫,提高了DHA的品質及產量,最終DHA產量達27.17 g/L(表3),處于國內外較先進的發(fā)酵水平。

表3 部分高產DHA菌株的發(fā)酵水平Table 3 Some stains of high DHA productivity for fermentation

3 結論與討論

本研究探索了不同溫度對破囊壺菌Aurantiochytriumsp.FN21的生物量,總脂肪酸產量及DHA產量的影響。我們發(fā)現,低溫利于DHA積累但不利于細胞生長,高溫利于細胞生長但不利于DHA合成。基于搖瓶實驗結果,提出了三階段控溫策略,在發(fā)酵前期(0～84 h),采用最利于細胞生長及產油的溫度(28 ℃)培養(yǎng)；至發(fā)酵中后期(84～108 h),采取較有利于細胞生長、產油及DHA積累的溫度(25 ℃)培養(yǎng)；最后發(fā)酵階段(108～120 h),不考慮生物量及油脂含量的積累,采取更低溫度(15 ℃)進一步脅迫破囊壺菌積累DHA,最終在15 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)獲得27.17 g/L的DHA,且DHA占總脂肪酸比例較高(50.66%)。本研究為破囊壺菌工業(yè)化發(fā)酵生產DHA提供了借鑒。