張樹(shù)交 查中明 武 陽(yáng)

人類(lèi)肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，被公認(rèn)為是全球所有與癌癥相關(guān)的死亡率的第二大誘因[1]。 HCC的死亡率高達(dá)95%，5年生存率極短，僅為6.9%[2]。與HCC發(fā)生率密切相關(guān)的危險(xiǎn)因素包括乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染，吸煙，飲酒，飲食中攝入黃曲霉毒素，糖尿病和肥胖[3]。因此，至關(guān)重要的是發(fā)現(xiàn)影響化療藥物對(duì)HCC發(fā)揮作用的關(guān)鍵分子機(jī)制，以改善HCC患者的診斷和治療。Oct3/4是POU家族的轉(zhuǎn)錄因子，與八聚體序列基序結(jié)合以激活下游基因的表達(dá)[4]。Oct3/4的表達(dá)升高與多種癌癥相關(guān)，包括膀胱癌，非小細(xì)胞肺癌和肝細(xì)胞癌[5]。盡管已經(jīng)進(jìn)行了許多研究，但是Oct3/4在癌癥中的預(yù)后意義仍然存在爭(zhēng)議，并且Oct3/4與化療的關(guān)系尚未得到充分認(rèn)識(shí)[6]?；诖?，本研究旨在探討CRISPR/CAS9靶向敲除Oct3/4基因后化療藥物索拉菲尼(Sorafenib)對(duì)肝癌細(xì)胞的作用影響。

1 材料與方法

1.1 材料

Li-7、HepG2、Huh7、BEL-7405、LX-2細(xì)胞均購(gòu)自普諾賽公司(貨號(hào)：CL-0139、CL-0103、CL-0120、CL-0321、CL-0560)。Sorafenib購(gòu)自深圳市益百順科技有限公司(貨號(hào)：Sorafenib)。pX459、，pX460-1、pX461-1均購(gòu)自Addgene。Cas9慢病毒購(gòu)自吉滿(mǎn)生物科技(上海)有限公司(貨號(hào)：GM-KC-100001)。Oct3/4和GAPDH抗體均購(gòu)自abcam(貨號(hào)：ab124826、ab8245)，Total RNA Isolation Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司(貨號(hào)：RC101-01)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：DEM201-50T)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)：C1062L)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和加藥處理 Li-7、HepG2、Huh7、BEL-7405、LX-2均用RPMI-1640(補(bǔ)充10%胎牛血清和1%雙抗)維持，并放于含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。索拉菲尼(Sorafenib)的處理終濃度為20 μM。

1.2.2 CRISPR/CAS9基因敲除與陽(yáng)性細(xì)胞的篩選 Cas9慢病毒感染HepG2細(xì)胞，并使用2 μg/ml的嘌呤霉素進(jìn)行篩選Cas9陽(yáng)性細(xì)胞。使用CRISPR設(shè)計(jì)工具(http://crispr.mit.edu/)設(shè)計(jì)了靶向OCT3/4基因片段的單向?qū)NA(sgRNA)序列:5'- CCAAGCTCCTGAAGCAGAAG-3'。pX459(包含U6啟動(dòng)子-sgRNA插入位點(diǎn)-sgRNA的3個(gè)載體)，pX460-1(包含U6啟動(dòng)子-sgRNA插入位點(diǎn)-sgRNA支架和CAG啟動(dòng)子-Cas9-T2A-嘌呤霉素N-乙?；D(zhuǎn)移酶基因-牛生長(zhǎng)激素多腺苷酸化信號(hào))和pX461-1(包含U6啟動(dòng)子-sgRNA插入位點(diǎn)-sgRNA支架，以及CAG啟動(dòng)子-嘌呤霉素N-乙?；D(zhuǎn)移酶(PuroR)-牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化信號(hào))用于sgRNA的亞克隆。轉(zhuǎn)染后2周以低密度培養(yǎng)細(xì)胞，允許單個(gè)菌落(50個(gè)菌落)擴(kuò)增，然后通過(guò)PCR測(cè)序進(jìn)行選擇。

1.2.3 RNA抽取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用Total RNA Isolation Kit從細(xì)胞系中分離出總RNA。使用凝膠電泳和2000 Nanodrop分光光度計(jì)評(píng)估提取的RNA的質(zhì)量和數(shù)量。使用隨機(jī)六聚體引物和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)總RNA(1 μg)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。為了定量Oct3/4和GAPDH的轉(zhuǎn)錄水平，定量RT-PCR反應(yīng)包含Premix Ex Taq預(yù)混液、2 μl cDNA模板和引物，在Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)PCR循環(huán)儀中進(jìn)行。擴(kuò)增步驟為：95 ℃5 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，分別是94 ℃30 s，57.5 ℃ 30 s和72 ℃30 s。使用2-△△ct計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 免疫印跡 使用哺乳動(dòng)物蛋白提取試劑制備總蛋白樣品。使用二辛可寧酸蛋白質(zhì)測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)樣品(每個(gè)樣品60 μg)通過(guò)8%SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后將膜用5%脫脂奶在37 ℃下封閉1 h，然后在4 ℃下與一抗連續(xù)孵育12 h，在4 ℃與相應(yīng)的二抗連續(xù)孵育4 h。最后，使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法觀察印跡并定量使用ChemiImager系統(tǒng)。 GAPDH用作內(nèi)部參考。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)測(cè)定法評(píng)估HepG2細(xì)胞的凋亡。對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)分析，用Sorafenib處理HepG2細(xì)胞，然后收集并用冷PBS溶液洗滌2次。將細(xì)胞懸浮于400 μl結(jié)合緩沖液中，加入5 μl Annexin V-FITC孵育15 min，隨后在37 ℃與10 μl PI孵育5 min。立即使用流式細(xì)胞儀和Cell Quest 4.0.2軟件分析染色的細(xì)胞。

1.2.6 DNA損傷的檢測(cè) 使用堿性單細(xì)胞凝膠電泳評(píng)估DNA損傷。Sorafenib處理后，將HepG2細(xì)胞在4 ℃的細(xì)胞裂解液(2.5 M NaCl，100 mM Na2EDTA，10 mM Tris，pH 10.0；1%Triton X-100和10%DMSO)中浸沒(méi)1 h，然后置于電泳溶液(300 mM NaOH，1 mM Na2EDTA，pH>13)在4 ℃下放置40 min。 電泳(25 V，～300 mA)并隨后用Tris-HCl(400 mM，pH 7.5)中和后，將細(xì)胞用PI(5 mg/l；Sigma-Aldrich)染色。 最后，使用CASP彗星分析1.2.2軟件在熒光顯微鏡下以40倍的放大倍率分析彗星圖像。 DNA的Olive尾矩(稱(chēng)為尾巴中的DNA百分比)用于評(píng)估DNA損傷的程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Oct3/4在人肝癌細(xì)胞和人肝正常細(xì)胞中的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)Oct3/4在人肝癌細(xì)胞Li-7、HepG2、Huh7、BEL-7405中的mRNA表達(dá)水平顯著高于人肝正常細(xì)胞LX-2(P<0.05)，見(jiàn)圖1A。同時(shí)，Oct3/4在人肝癌細(xì)胞Li-7、HepG2、Huh7、BEL-7405中的蛋白表達(dá)水平顯著高于人肝正常細(xì)胞LX-2，見(jiàn)圖1B。

圖1 Oct3/4在人肝癌細(xì)胞和人肝正常細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 CRISPR/CAS9技術(shù)構(gòu)建Oct3/4敲除的肝癌細(xì)胞系

設(shè)計(jì)gRNA靶向Oct3/4第1個(gè)外顯子，見(jiàn)圖2A。使用CRISPR/CAS9對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行基因編輯后，挑取嘌呤霉素篩選出的2個(gè)單克隆細(xì)胞株進(jìn)行Oct3/4表達(dá)水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)1#號(hào)單克隆細(xì)胞株Oct3/4表達(dá)水平低于野生型WT，2#號(hào)單克隆細(xì)胞株沒(méi)有表達(dá)Oct3/4，見(jiàn)圖2B。提取1#號(hào)和2#號(hào)單克隆基因組后PCR進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)1#號(hào)基因組上的Oct3/4第1個(gè)外顯子只有1條染色體缺失了2個(gè)堿基，另一條染色體并未缺失；2#號(hào)基因組上的Oct3/4第1個(gè)外顯子2條染色體均存在不同程度的缺失，一條缺失2個(gè)堿基，另一條缺失4個(gè)堿基，見(jiàn)圖2C。

圖2 CRISPR/CAS9技術(shù)構(gòu)建Oct3/4敲除的肝癌細(xì)胞系

2.3 Oct3/4敲除對(duì)化療藥物作用效果的影響

選取2#號(hào)細(xì)胞株作為后續(xù)Oct3/4 KO細(xì)胞株。使用索拉菲尼處理野生型HepG2細(xì)胞和Oct3/4 KO HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Oct3/4 KO細(xì)胞株的凋亡水平顯著上升(P<0.05)，DNA損傷水平顯著上升(P<0.05)，見(jiàn)圖3A和3B。

圖3 Oct3/4敲除對(duì)化療藥物作用效果的影響

3 討論

肝癌是世界范圍內(nèi)的常見(jiàn)惡性腫瘤，每年造成700000多例死亡。HCC是原發(fā)性肝癌的主要類(lèi)型[7]，在病因上與乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染、肝硬化、酒精中毒和非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)相關(guān)[8]。手術(shù)切除是肝癌患者的主要治療方法。然而，由于侵襲性生長(zhǎng)和晚期癥狀表現(xiàn)，大多數(shù)HCC患者被診斷為晚期，不符合手術(shù)治療的條件[9]。晚期HCC患者的中位生存期約為9個(gè)月，而5年總生存率僅為10%，治療晚期HCC患者的選擇仍然非常有限，因此有必要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新的治療方案。

OCT3/4在胚胎干細(xì)胞，生殖細(xì)胞和各種人類(lèi)癌癥中表達(dá)[10]。眾所周知，它是干細(xì)胞多能性和自我更新的主要調(diào)節(jié)劑[11]。越來(lái)越多的證據(jù)表明[12]，在包括前列腺癌、黑色素瘤和HCC在內(nèi)的許多癌癥中，OCT3/4表達(dá)與腫瘤起始之間存在相關(guān)性。已有研究發(fā)現(xiàn)OCT3/4表達(dá)在HCC對(duì)藥物敏感性中起關(guān)鍵作用[13]。在本研究中，Oct3/4在人肝癌細(xì)胞Li-7、HepG2、Huh7、BEL-7405中的mRNA表達(dá)水平顯著高于人肝正常細(xì)胞LX-2(P<0.05)。同時(shí)，Oct3/4在人肝癌細(xì)胞Li-7、HepG2、Huh7、BEL-7405中的蛋白表達(dá)水平顯著高于人肝正常細(xì)胞LX-2。因此，Oct3/4可能是促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展和耐藥性的關(guān)鍵因子。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)最早是在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種自適應(yīng)免疫機(jī)制，可防止病毒DNA入侵[14]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)過(guò)工程改造，可為特定基因敲除引入移碼突變[15]。由于容易編程和高基因編輯功效，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已越來(lái)越多地用于研究各種生物系統(tǒng)中基因功能的喪失[16]。在本研究中，使用CRISPR/CAS9對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行基因編輯后，挑取嘌呤霉素篩選出的2個(gè)單克隆細(xì)胞株進(jìn)行Oct3/4表達(dá)水平的檢測(cè)，1#號(hào)單克隆細(xì)胞株Oct3/4表達(dá)水平低于野生型WT，2#號(hào)單克隆細(xì)胞株沒(méi)有表達(dá)Oct3/4。測(cè)序后發(fā)現(xiàn)1#號(hào)基因組上的Oct3/4第1個(gè)外顯子只有1條染色體缺失了2個(gè)堿基，另一條染色體并未缺失；2#號(hào)基因組上的Oct3/4第1個(gè)外顯子2條染色體均存在不同程度的缺失，一條缺失2個(gè)堿基，另一條缺失4個(gè)堿基。

索拉非尼靶向多種酪氨酸激酶，包括RAF，VEGFR和PDGFR，以抑制其下游增殖和生存信號(hào)通路[17]。先前的研究表明[18]，索拉非尼治療部分通過(guò)引起腫瘤細(xì)胞DNA損傷和凋亡來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。索拉非尼因其可耐受的安全性和可控的副作用，在臨床上是一種有吸引力的分子靶向藥物。但是，索拉非尼治療HCC的臨床療效不高，只能將患者的平均總生存期延長(zhǎng)3個(gè)月[19]。耐藥性的發(fā)展被認(rèn)為是導(dǎo)致HCC患者索拉非尼治療失敗的主要障礙[20]。為了克服索拉非尼耐藥性，與其他抗癌藥物尤其是靶向與索拉非尼耐藥性有關(guān)的分子的藥物聯(lián)合開(kāi)發(fā)，越來(lái)越受到重視。本研究使用Sorafenib處理野生型HepG2細(xì)胞和2# Oct3/4 KO HepG2細(xì)胞后，Oct3/4 KO細(xì)胞株的凋亡水平顯著上升(P<0.05)，DNA損傷水平顯著上升(P<0.05)。因此，Oct3/4基因可能是HCC耐索拉菲尼的原因之一。然而，索拉非尼耐藥的潛在機(jī)制很復(fù)雜，并且仍然難以捉摸。對(duì)索拉非尼耐藥性的分子基礎(chǔ)進(jìn)行進(jìn)一步的研究，可能為確定合理的聯(lián)合療法克服索拉非尼耐藥性的新靶標(biāo)提供參考。

綜上所述，Oct3/4基因的敲除能夠顯著提高化療藥物Sorafenib促肝癌細(xì)胞凋亡和DNA損傷的作用。