高 娜，楊 坤，方 婷，梁陽陽，崔 凱，盧文軒

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所水產(chǎn)增養(yǎng)殖安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230000)

隨著長江流域重點(diǎn)水域全面禁捕方案的實(shí)施，重點(diǎn)湖泊、水庫等大型水域退出漁業(yè)生產(chǎn)功能，漁業(yè)生產(chǎn)空間大幅壓縮，池塘水域成為漁業(yè)發(fā)展的主戰(zhàn)場。與此同時(shí)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的綠色發(fā)展對池塘養(yǎng)殖環(huán)境治理提出了更高要求。研發(fā)經(jīng)濟(jì)高效的養(yǎng)殖廢水處理工藝成為養(yǎng)殖企業(yè)和環(huán)保行業(yè)的熱點(diǎn)問題。目前已開發(fā)出包括活性污泥法、生物接觸氧化法、序批式反應(yīng)器(SBR)，移動(dòng)床生物膜反應(yīng)器(MBBR)等多種處理工藝。微生物是污水處理系統(tǒng)中污染物去除的主體，系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行和處理效果與其中的微生物群落結(jié)構(gòu)及功能密切相關(guān)。因此，研究養(yǎng)殖廢水處理系統(tǒng)中各模塊的微生物群落組成、明確占主導(dǎo)地位的微生物群落以及微生物群落與污染物濃度之間的關(guān)聯(lián)性,對優(yōu)化廢水處理系統(tǒng)的菌群結(jié)構(gòu)，提高水質(zhì)凈化效率具有重要作用。

污水生物處理系統(tǒng)的性能和穩(wěn)定性與微生物群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)密切相關(guān)。為了解廢水處理系統(tǒng)中各單元的凈水機(jī)制，掌握優(yōu)化系統(tǒng)運(yùn)行參數(shù)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為養(yǎng)殖廢水高效凈化提供一定的技術(shù)支持，本研究運(yùn)用高通量測序技術(shù)對采用水解酸化+A/O工藝的龜鱉廢水處理系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，通過相關(guān)性分析對環(huán)境因子和微生物群落的變化進(jìn)行分析，探索對污染物質(zhì)降解起重要作用的功能微生物。

1 材料與方法

1.1 龜鱉養(yǎng)殖廢水處理工藝流程

選擇安徽省銅陵市順東農(nóng)業(yè)科技有限公司龜鱉產(chǎn)業(yè)園為研究對象，主養(yǎng)品種中華鱉，餌料為機(jī)制飼料(主要成分為40%粗蛋白、4.5%粗脂肪、12%水分、粗纖維5%、粗灰分16%)結(jié)合植物性蛋白(胡蘿卜、番茄等)，日常養(yǎng)殖過程中池水不外排，僅在商品鱉出售時(shí)才清池排水。龜鱉廢水處理工藝流程見圖1，養(yǎng)殖周期結(jié)束后，集中排放的養(yǎng)殖尾水經(jīng)過人工格柵攔截掉廢水中的大顆粒物，進(jìn)入水解酸化池，使大分子難降解的物質(zhì)分解為小分子易降解物質(zhì)。出水進(jìn)入?yún)捬醭剡M(jìn)一步水解酸化去除化學(xué)需氧量(COD)。厭氧發(fā)酵后的廢水進(jìn)入好氧池，通過不斷地曝氣使微生物進(jìn)行有氧呼吸從而去除其中的污染物。經(jīng)過曝氣處理的污水依次通過初沉池和二沉池，最后進(jìn)入生態(tài)濕地進(jìn)行深度凈化，最終出水達(dá)標(biāo)排放。

圖1 龜鱉養(yǎng)殖廢水處理工藝流程

1.2 水樣采集

依據(jù)系統(tǒng)的運(yùn)行情況，于2020年4月14日進(jìn)行樣品采集，共采集18個(gè)水樣，其中在龜鱉養(yǎng)殖溫室(WS)、水解酸化池(CC)、厭氧池(YY)、好氧池(HY)、初沉池(CS)、二沉池(SC)各取3個(gè)重復(fù)樣。每個(gè)點(diǎn)取500 mL廢水裝入無菌PV瓶，低溫條件下保存運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3 水質(zhì)檢測

1.4 微生物菌群分析

各樣點(diǎn)采集的水樣經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾，將富集了微生物菌體的濾膜送至美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成DNA提取，PCR擴(kuò)增，文庫構(gòu)建，上機(jī)測序，高通量數(shù)據(jù)處理等工作。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用EXCEL軟件統(tǒng)計(jì)平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)方差，使用UPARSE軟件，根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行OTU聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，利用QIIME軟件計(jì)算樣品包括Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)的Alpha多樣性值。運(yùn)用person相關(guān)系數(shù)計(jì)算物種與環(huán)境因子之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 水體理化性質(zhì)

表1 各處理單元水質(zhì)指標(biāo)分析

2.2 樣品的OTUs和多樣性分析

表2顯示所有樣本的覆蓋度均高于99%，表明測序結(jié)果覆蓋度較好且具有很高的可信度，能夠代表樣本的真實(shí)情況。對所有樣品的有效序列進(jìn)行聚類，以97%的相似性將序列聚類成一個(gè)OTU。維恩圖可以比較直觀地表現(xiàn)樣品中的OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況，18個(gè)樣品中共有的OTU數(shù)目為111，不同樣品中特有OTU表現(xiàn)為養(yǎng)殖溫室295個(gè)、水解酸化池116個(gè)、厭氧池78個(gè)、好氧池46個(gè)、初沉池20個(gè)、二沉池27個(gè)(圖2)。α多樣性分析結(jié)果顯示(表2)，不同處理單元廢水中的微生物群落的豐富度指數(shù)(ACE和Chao l)和多樣性指數(shù)(Shannon和Simpson)均存在一定的差異。

圖2 OTUs韋恩圖

表2 微生物群落多樣性指數(shù)

2.3 不同處理單元水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征與動(dòng)態(tài)變化

各單元水體中共檢測到42個(gè)門水平的細(xì)菌和一些無法歸類的細(xì)菌，所有樣本中豐度占比均小于0.05的物種歸為others(圖3)。由表2可知，養(yǎng)殖溫室水體中微生物多樣性水平較高，圖3顯示其中各類微生物占比較為平均。水解酸化池水體中優(yōu)勢類群為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，占比率為49.56%、27.25%、5.88%。厭氧池中優(yōu)勢類群發(fā)生了變化，主要為放線菌門(42.56%)、變形菌門(41.02%)和擬桿菌門(7.06%)。好氧池相對于厭氧池來說，優(yōu)勢群體的種類沒有改變，除變形菌門(42.18%)外，其他種群數(shù)量明顯發(fā)生了變化，擬桿菌門(22.43%)顯著高于厭氧池，放線菌門(20.63%)顯著低于厭氧池。初沉池和二沉池中優(yōu)勢類群依然為變形菌門、擬桿菌門和放線菌門，但是種群含量存在差異，二沉池中變形菌門處于絕對優(yōu)勢地位，占比高達(dá)56.55%。

圖3 不同處理單元水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成(門水平)

以屬為分類單元分析水體中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4所示，龜鱉廢水處理系統(tǒng)中檢測到的細(xì)菌覆蓋了679個(gè)屬，大量的序列不能歸入已知屬(數(shù)據(jù)庫分別以科的名稱加-norank，-unclassified來表示)，所有樣本中豐度占比均小于0.05的物種歸為others。水體中細(xì)菌類群和含量隨著處理進(jìn)程逐步發(fā)生改變。養(yǎng)殖溫室中細(xì)菌多樣性水平最高，但是豐度占比低于0.05的物種比例高達(dá)72.83%，其他優(yōu)勢細(xì)菌屬為5.96%，分枝桿菌屬7.36%，norank-f-norank-o-Saccharimonadales 6.82%。在水解酸化池中，優(yōu)勢細(xì)菌屬為噬氫菌屬35.62%，黃桿菌屬17.09%，地桿菌屬2.8%。進(jìn)入?yún)捬醭?，?yōu)勢細(xì)菌屬發(fā)生了變化，變?yōu)樯形捶诸惖奈U菌科(unclassified-f-Microbacteriaceae)18.77%，氣單胞菌屬14.87%，hgc1-clade 6.43%。好氧池中優(yōu)勢細(xì)菌屬為腸桿菌屬14.67%，黃桿菌屬7.96%，hgc1-clade 6.43%；進(jìn)入初沉池優(yōu)勢細(xì)菌屬變?yōu)?2.94%，不動(dòng)桿菌屬8.91%，黃桿菌屬8.60%；二沉池優(yōu)勢細(xì)菌屬為產(chǎn)卟啉桿菌屬13.99%，10.74%，尚未分類的紅桿菌科(unclassified-f-Rhodobacteraceae)9.71%。

圖4 不同處理單元水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成(屬水平)

2.4 水質(zhì)對龜鱉廢水處理系統(tǒng)中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

表3 屬分類水平上細(xì)菌菌群與水質(zhì)因子的相關(guān)性分析(分類水平總豐度前10的物種)

3 討論

有研究表明溫室龜鱉養(yǎng)殖在水產(chǎn)養(yǎng)殖模式中產(chǎn)生的污染最大，對環(huán)境的污染最嚴(yán)重，因此研究龜鱉養(yǎng)殖廢水處理工藝十分迫切。特定的微生物菌群能夠促進(jìn)廢水處理系統(tǒng)中某些復(fù)雜大分子有機(jī)化合物的降解。本實(shí)驗(yàn)龜鱉廢水處理系統(tǒng)采用水解酸化+A/O的工藝流程，溫室外排的廢水通過不同類型的功能池分級處理,不同類型功能池中微生物群落分布具有較大差異。多樣性分析結(jié)果中顯示好氧階段的細(xì)菌豐富度和群落多樣性比厭氧處理單元高，研究表明細(xì)菌豐富度和群落多樣性越高，污染物的去除效果越好。廢水經(jīng)好氧單元處理后，細(xì)菌豐富度和多樣性明顯減少，可能是由于好氧階段消耗了廢水中大部分的營養(yǎng)物質(zhì)，使得下游處理單元中的微生物生長受限。

大量關(guān)于污水處理系統(tǒng)中微生物的研究表明在不同的污水處理系統(tǒng)中的細(xì)菌群落主要以變形菌、綠彎菌、放線菌、厚壁菌和擬桿菌為功能菌群。在本研究中，變形菌門在各處理單元中都占有很大比例，研究表明變形菌門大部分屬于異養(yǎng)型細(xì)菌，是COD降解和脫氮過程的主要貢獻(xiàn)者，其中的β-變形菌綱更是與反硝化作用密切相關(guān)，擬桿菌門在污水處理中的作用僅次于變形菌門，研究資料表明該菌門有利于促進(jìn)含氮物質(zhì)的利用、類固醇生物轉(zhuǎn)化及水解大分子物質(zhì)。以上分析表明，不同處理單元水體中優(yōu)勢類群種類和含量均存在一定差異，這與翟一帆等在利用A2/O工藝處理養(yǎng)豬廢水中的研究一致。以屬分類水平討論處理系統(tǒng)中微生物群落組成發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢細(xì)菌屬為黃桿菌屬、噬氫菌屬、尚未分類的微桿菌科、等。其中噬氫菌屬和黃桿菌屬是典型的反硝化菌屬，參與水體脫氮，也是城市污水及工業(yè)廢水處理活性污泥中優(yōu)勢菌群。也與氮循環(huán)相關(guān)，可以使有機(jī)氮轉(zhuǎn)變成無機(jī)氮如硝酸鹽氮等。每一級處理單元中均有很多尚未得到分類鑒定的物種，有研究指出這些未分類或不能培養(yǎng)的功能性菌群的生長在維持水體氮平衡中起著至關(guān)重要的作用。綜上，在門和屬水平對微生物群落組成的研究發(fā)現(xiàn)不同的廢水處理階段優(yōu)勢菌屬不盡相同，細(xì)菌群落在二沉池出水和溫室進(jìn)水中存在明顯差異。在水解酸化池、厭氧池及好氧池樣品中存在大量特殊功能菌群，它們在該龜鱉廢水處理系統(tǒng)中，對污染物的分解和氮磷的去除發(fā)揮著重要作用。

4 結(jié)論

本研究采用高通量測序技術(shù)解析龜鱉廢水處理系統(tǒng)各處理單元的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，共檢測到42個(gè)細(xì)菌門，679個(gè)細(xì)菌屬。溫室中的優(yōu)勢細(xì)菌和分枝桿菌屬是典型的致病菌，經(jīng)過生物處理后，二沉池出水中致病菌顯著減量。黃桿菌屬、腸桿菌屬和氣單胞菌屬是常見的魚類致病菌，在前期處理進(jìn)程中這些細(xì)菌占有一定的優(yōu)勢地位，經(jīng)過一系列生物處理進(jìn)入二沉池后，它們的相對豐度大幅度下降，不影響廢水作為再生資源進(jìn)入養(yǎng)殖池塘重新利用。各處理單元水質(zhì)分析也表明，廢水經(jīng)系統(tǒng)處理后符合污水綜合排放一級A標(biāo)準(zhǔn)(GB8978-1996)。綜上，采用水解酸化+A/O工藝處理可實(shí)現(xiàn)龜鱉養(yǎng)殖廢水的高效凈化和循環(huán)利用。該工藝相比于生態(tài)塘和人工濕地凈化既能減少用地，又能降低造價(jià)和運(yùn)行費(fèi)用，符合資源節(jié)約型、環(huán)境友好型社會(huì)的發(fā)展要求，對生物法處理規(guī)模化養(yǎng)殖廢水有一定的理論參考價(jià)值。