孫艷紅，馬 浩，魏輝杰，王貴英，陳 見，祝東梅，李 佩，李 清

(1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，武漢 430207；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070;3.武漢先鋒水產(chǎn)科技有限公司，武漢 430207)

魴、鲌均隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鲌亞科(Cultrinae)。團(tuán)頭魴()是魴類中重要的組成部分，是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類，廣泛分布于各流域湖泊，因其食性廣、易捕撈、生長快、肉質(zhì)細(xì)嫩而深受喜愛；黑尾近紅鲌()是長江上游特有經(jīng)濟(jì)魚類，其人工養(yǎng)殖成本低、性情溫馴、易捕撈、易活魚上市。本研究科研團(tuán)隊(duì)將經(jīng)選育的體型好、生長快的4代的團(tuán)頭魴(♀)與經(jīng)選育的4代的抗應(yīng)激、反應(yīng)溫順黑尾近紅鲌()進(jìn)行雜交，再經(jīng)過4代以上的選育獲得了體型與團(tuán)頭魴相近，生長快、抗應(yīng)激能力強(qiáng)的鲌魴“先鋒2號”，已于2019年被全國水產(chǎn)原良種委員會審定為新品種。ZHU等已經(jīng)報(bào)道過鲌魴“先鋒2號”的線粒體序列，但是對于親本和子代之間的親緣關(guān)系以及遺傳多樣性分析還未見報(bào)道。

遺傳多樣性是種群或者群體長期生存和發(fā)展中遺傳變異的直接體現(xiàn)，因此探究魚類的遺傳多樣性可以為魚類的育種工作提供相應(yīng)的理論指導(dǎo)。微衛(wèi)星(microsatellite)也稱簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats,SSRs)，由串聯(lián)排列的1～6 bp簡單序列重復(fù)組成，是廣泛分布在真核生物基因組中的一種中度重復(fù)序列。目前為止，微衛(wèi)星標(biāo)記由于具有高突變率、共顯性、在基因組中廣泛均勻分布、穩(wěn)定易檢測等優(yōu)點(diǎn)大多被應(yīng)用到魚類群體遺傳的研究和遺傳圖譜繪制。在魚類雜交后代的遺傳分析中也都普遍使用微衛(wèi)星技術(shù)，已有學(xué)者對黃顙魚()(♀)×瓦氏黃顙魚()()、尼羅羅非魚()(♀)×薩羅羅非魚()()、團(tuán)頭魴(♀)×翹嘴鲌()()等進(jìn)行親本與子代的分析。

本實(shí)驗(yàn)利用篩選的11個微衛(wèi)星位點(diǎn)對鲌魴“先鋒2號”、團(tuán)頭魴及黑尾近紅鲌群體的遺傳特性以及親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，旨在為鲌亞科魚類的合理開發(fā)利用、下一步的選育工作以及種質(zhì)資源保護(hù)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

團(tuán)頭魴群體引自湖北省梁子湖野生群體，黑尾近紅鲌群體引自長江上游野生群體，兩者均經(jīng)過了武漢市農(nóng)科院水產(chǎn)所和武漢先鋒水產(chǎn)科技有限公司(先鋒公司)4代選育，將選育的團(tuán)頭魴(♀)與選育的黑尾近紅鲌()進(jìn)行雜交，再經(jīng)過4代選育獲得了體型與團(tuán)頭魴相近，生長快、抗應(yīng)激能力強(qiáng)且在肉質(zhì)方面上具有優(yōu)勢的鲌魴“先鋒2號”。三個群體均在先鋒公司基地進(jìn)行人工養(yǎng)殖。三個群體各取30尾，分別剪尾鰭保存于無水乙醇中，帶回實(shí)驗(yàn)室于4 ℃冰箱中備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測

使用酚氯仿分別提取鲌魴“先鋒2號”、團(tuán)頭魴、黑尾近紅鲌三個群體共90個樣本的DNA?；蚪MDNA質(zhì)量通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA濃度與純度的檢測，合格后稀釋至100 ng/μL，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 熒光標(biāo)記的微衛(wèi)星引物

根據(jù)SUN等發(fā)表的黑尾近紅鲌微衛(wèi)星引物，從90尾樣本中隨機(jī)挑選5尾團(tuán)頭魴、5尾鲌魴“先鋒2號”、5尾黑尾近紅鲌的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，聚丙烯凝膠電泳檢測后銀染，篩選出多態(tài)性好以及能夠穩(wěn)定擴(kuò)增的引物，用于三個群體的遺傳分析。

表1 微衛(wèi)星熒光引物和位點(diǎn)特征

1.2.3 PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳檢測及SSR分型

通過PCR擴(kuò)增使11對熒光引物在鲌魴“先鋒2號”、團(tuán)頭魴、黑尾近紅鲌三個群體總共90個樣本中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)總體系20 μL，包括Premix TagVersion 2.0 (Takara) 10 μL，正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1.5 μL，ddHO 6.5 μL。PCR擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其存在性后送由上海生工生物工程有限公司用ABI PRISM 3730測序儀進(jìn)行等位基因分型。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用Genemarker錄入每個微衛(wèi)星位點(diǎn)各個個體的等位基因數(shù)據(jù)；Popgene v1.32和Cervus v3.03計(jì)算了每個位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)(number of alleles,)、有效等位基因數(shù)目(number of effective alleles,)、觀測雜合度(Observed heterozygosit,)、期望雜合度(Expected_heterozygosity,)、多態(tài)性信息含量(Polymorphysm_information_content,)和Nei’s遺傳距離；Convert131進(jìn)行轉(zhuǎn)換格式類型。采用軟件Poptree V2和MEGA X建立群體遺傳關(guān)系的聚類樹；PCoA-GenALEx v6.5基于遺傳距離來分析群體間的遺傳關(guān)系。

2 結(jié)果分析

2.1 微衛(wèi)星多態(tài)性引物的篩選

對所選46對微衛(wèi)星引物進(jìn)行篩選工作，初步篩選出11對符合預(yù)期的微衛(wèi)星引物，按照其擴(kuò)增片段的大小進(jìn)行組合，組合內(nèi)進(jìn)行三種熒光染料(6-FAM,HEX,ROX)分別標(biāo)記，熒光標(biāo)記引物見表1，熒光引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

2.2 遺傳多樣性分析

將11對引物在鲌魴“先鋒2號”、團(tuán)頭魴、黑尾近紅鲌三個群體分別進(jìn)行擴(kuò)增情況統(tǒng)計(jì)分析(表2)。結(jié)果顯示，團(tuán)頭魴群體的在2～6之間，平均為4.182，在1.133～3.122之間，平均為2.482，在0.063～1.000之間，在0.121～0.733之間，值為0.508，6個位點(diǎn)極顯著或顯著偏離哈迪-溫伯格平衡；鲌魴“先鋒2號”群體在2～8之間，平均為4.273，在1.827～6.564之間，平均為3.080，在0.067～0.867之間，在0.471～0.875之間，值為0.572，1個位點(diǎn)顯著偏離哈迪-溫伯格平衡；黑尾近紅鲌群體在2～15之間，平均為4.273，在1.210～11.842之間，平均為2.803，在0.063～0.933之間，在0.179～0.947之間，值為0.414，2個位點(diǎn)顯著偏離哈迪-溫伯格平衡。三個群體共90個個體在11個微衛(wèi)星位點(diǎn)上共擴(kuò)增出81個等位基因。其中在3～20的范圍內(nèi)，的范圍為2.084～9.400，均值分別是7.364和3.862。的在0.188～0.830之間，均值為0.537。的在0.528～0.930之間，均值為0.696。在群體水平上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，11個位點(diǎn)在三個群體中的多態(tài)百分比均為100%。黑尾近紅鲌群體的,和三項(xiàng)指標(biāo)均小于其他兩個群體。

表2 三種魚11個微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)

2.3 群體間的遺傳距離與遺傳相似度

三個群體間Nei的遺傳相似度和遺傳距離見表3。鲌魴“先鋒2號”和團(tuán)頭魴的遺傳相似度(0.762 7)高于鲌魴“先鋒2號”和黑尾近紅鲌的遺傳相似度(0.583 8)。鲌魴“先鋒2號”和團(tuán)頭魴的遺傳距離(0.270 9)小于鲌魴“先鋒2號”和黑尾近紅鲌的遺傳距離(0.538 1)，表明雜交鲌魴“先鋒2號”與母本團(tuán)頭魴的親緣關(guān)系更近，遺傳上更偏向于母本，這與雜交選育過程中表現(xiàn)出來的形態(tài)學(xué)分析結(jié)果相一致，表明團(tuán)頭魴對雜交子代的貢獻(xiàn)率大于父本黑尾近紅鲌。

表3 三種魚間Nei的遺傳相似度(對角線上)和遺傳距離(對角線下)

2.4 群體間的遺傳結(jié)構(gòu)與親緣關(guān)系

2.4.1 聚類分析

基于遺傳距離運(yùn)用UPGMA法對三個群體進(jìn)行聚類分析(圖1)。結(jié)果表明，黑尾近紅鲌群體與其他兩個群體分離，單獨(dú)形成一支，團(tuán)頭魴群體和鲌魴“先鋒2號”群體兩個群體聚成一支。

圖1 基于遺傳距離建立的UPGMA聚類樹

2.4.2 分子變異分析

通過對三個群體的AMOVA分析結(jié)果表明，種群間的遺傳變異占27.09%，種群內(nèi)的遺傳變異占72.91%(表4)。群體內(nèi)的遺傳變異大于群體間，總體上整個群體發(fā)生了顯著的遺傳分化[遺傳固定系數(shù)(st)=0.271，<0.000 1]。

表4 三個群體的分子方差變異分析

2.4.3 PCoA主坐標(biāo)分析

基于個體間遺傳距離對三個群體90個個體進(jìn)行PCoA主坐標(biāo)分析(圖2)，可以明顯發(fā)現(xiàn)團(tuán)頭魴群體與鲌魴“先鋒2號”群體更為相似聚集在一起，而黑尾近紅鲌群體中個體相距較遠(yuǎn)而單獨(dú)聚類。

圖2 3個群體基于個體間遺傳距離的PCoA主坐標(biāo)分析Fig.2 Principal coordinate analysis (PCoA) of pairwise distances between individuals of three populationsTTF：團(tuán)頭魴；XF2：鲌魴“先鋒2號”；HW：黑尾近紅鲌

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性分析

研究表明，微衛(wèi)星側(cè)翼序列在親緣關(guān)系較近的群體間相對保守，同時有部分微衛(wèi)星在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的分類群體間也具有一定的保守性，因此使得SSR分子標(biāo)記具有較高的通用性，可在不同種群之間快速、有效地?cái)U(kuò)增，且群體間親緣關(guān)系越近，跨種擴(kuò)增的可能性越強(qiáng)。基于此原理，大黃魚、鯉、鱘魚和團(tuán)頭魴的微衛(wèi)星引物都能在近緣物種中有效擴(kuò)增，并應(yīng)用于遺傳分析研究。在本研究中，在黑尾近紅鲌基因組和轉(zhuǎn)錄組中開發(fā)的11對中高多態(tài)性的微衛(wèi)星引物在不同種的鲌魴“先鋒2號”與團(tuán)頭魴群體中均能進(jìn)行有效擴(kuò)增，但是在團(tuán)頭魴群體中偏離哈迪-溫伯格平衡的位點(diǎn)數(shù)較多，可能與非同源跨種應(yīng)用，等位基因數(shù)偏少有關(guān)。

目前，國內(nèi)關(guān)于魴屬和鲌屬的育種工作主要集中在選擇育種和雜交育種兩個方面。群體的遺傳多樣性能體現(xiàn)出物種是否能夠較快適應(yīng)環(huán)境、維持生命并產(chǎn)生突變進(jìn)化的能力，其主要表現(xiàn)在有效等位基因數(shù)的豐富和均勻程度、遺傳雜合度的大小和多態(tài)信息含量3個方面。等位基因越多，遺傳雜合度數(shù)值越大，多態(tài)信息含量數(shù)值越高，則證明群體遺傳變異越高，更能適應(yīng)自然環(huán)境變化。雜交后代的等位基因和雜合度一般都高于雙親，這也是形成雜種優(yōu)勢的重要遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)之一。本研究中通過11對微衛(wèi)星引物檢測到鲌魴“先鋒2號”的平均有效等位基因(3.080)大于母本團(tuán)頭魴(2.482)與父本黑尾近紅鲌(2.803)，鲌魴“先鋒2號”的平均觀測雜合度(0.507)小于母本團(tuán)頭魴(0.712)大于父本黑尾近紅鲌(0.380)，鲌魴“先鋒2號”的多態(tài)信息含量(0.572)均高于父本黑尾近紅鲌(0.414)與母本團(tuán)頭魴(0.508)，多態(tài)信息含量大于5時為高度多態(tài)，表明雜交鲌魴“先鋒2號”的遺傳變異程度較團(tuán)頭魴、黑尾近紅鲌群體高，更能適應(yīng)自然環(huán)境的變化，更易存活。這些研究結(jié)果同以往許多研究報(bào)道都有一致性，如李景芬等研究黃顙魚(♀)×瓦氏黃顙魚()得出的雜種一代基因變異程度比雙親高，DNA多態(tài)性豐富。王宏玉等研究的黃顙魚(♀)×長吻鮠()雜交子代多態(tài)性信息含量、雜合度以及等位基因數(shù)均比雙親高。這些研究結(jié)果都體現(xiàn)出雜交子代較雙親的遺傳多樣性有所增加，具有一定的雜交優(yōu)勢,有較大的培育潛力。

3.2 親緣關(guān)系分析

遺傳距離與遺傳相似度常用于群體的親緣關(guān)系分析。雜交親本間遺傳差異越大，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，其后代雜種優(yōu)勢越明顯。李思發(fā)等基于SSR標(biāo)記對五種羅非魚群體進(jìn)行了遺傳距離分析，構(gòu)建的NJ聚類樹以及UPGMA聚類樹，結(jié)果表明，其中兩個雜交種在遺傳上與母本遺傳距離較近；王俊基于SSR標(biāo)記對哲羅鮭()、細(xì)鱗鮭()及雜交子一代進(jìn)行親緣關(guān)系分析，結(jié)果表明子一代與母本細(xì)鱗鮭的遺傳距離(0.315 0)小于子一代與父本哲羅鮭之間的遺傳距離(0.395 3)，同時與母本的遺傳相似系數(shù)(0.729 8)大于父本(0.673 5)，子一代與母本親緣關(guān)系更近；朱樹人開發(fā)10對微衛(wèi)星引物對烏鱧()、斑鱧()及雜交F1的進(jìn)行了群體遺傳多樣性分析，并利用三種魚之間的遺傳距離進(jìn)行了聚類分析，發(fā)現(xiàn)雜交F1的遺傳特性偏向母本斑鱧。而王宏玉等研究的黃顙魚(♀)×長吻鮠()雜交子代與父本的親緣關(guān)系和遺傳距離更近，以及陳見等研究的翹嘴鲌(♀)與黑尾近紅鲌()雜交子代也是與父本遺傳差異小于與母本的遺傳差異，與父本的親緣關(guān)系較近。這些研究結(jié)果均表明雜交雙親的遺傳物質(zhì)對子代的貢獻(xiàn)存在不對等現(xiàn)象。

本研究采用NJ聚類以及PCoA主坐標(biāo)分析來探討團(tuán)頭魴、鲌魴“先鋒2號”、黑尾近紅鲌三種魚之間的遺傳親緣關(guān)系。從NJ聚類分析能明顯看出鲌魴“先鋒2號”與母本團(tuán)頭魴具有更近的親緣關(guān)系，而與父本黑尾近紅鲌相距較遠(yuǎn)。從PCoA主坐標(biāo)分析方面表明鲌魴“先鋒2號”各個個體之間與團(tuán)頭魴各個個體之間具有較小的遺傳差異。這與雜交選育過程中表現(xiàn)出來的形態(tài)分析研究結(jié)果一致，表明團(tuán)頭魴對雜交子代的貢獻(xiàn)率大于黑尾近紅鲌。

以上結(jié)果可能由于在選育過程中，雜交子代的選擇以形態(tài)學(xué)上接近母本團(tuán)頭魴的個體為主，因此遺傳上，鲌魴“先鋒2號”更接近母本團(tuán)頭魴，與父本黑尾近紅鲌相距較遠(yuǎn)。一般情況下，在魚類進(jìn)行雜交時，異源精子可能只對卵子起到刺激作用，父本有部分遺傳物質(zhì)可能向子代傳遞。同時，人工操作和環(huán)境因素對基因交流、親本向子代傳遞遺傳物質(zhì)的過程都會產(chǎn)生影響。雖然鲌魴“先鋒2號”更偏向于母本，但同時也具備了父本黑尾近紅鲌的遺傳物質(zhì)，因此后代較雙親更有優(yōu)勢。通過養(yǎng)殖對比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其生長速度與團(tuán)頭魴接近，但在起捕率和耐運(yùn)輸方面優(yōu)于團(tuán)頭魴