連飄飄 徐巖

肢帶型肌營養(yǎng)不良2A型（limb-girdle muscular dystrophy type 2A，LGMD2A）是一種常染色體遺傳病，在歐洲為最常見的LGMD類型[1]，但在亞洲特別是我國相對較少見。LGMD2A有高度臨床異質性，發(fā)病年齡、臨床表現(xiàn)及疾病的進展速度均有較大變異，診斷難度較大。本文報告了一對臨床表現(xiàn)類似Becker型肌營養(yǎng)不良（Becker muscular dystrophy，BMD）的孿生兄弟，通過基因測序發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶3（calpain 3，CAPN3）基因的復合雜合變異，最終確診為LGMD2A，顯示了基因檢測在 LGMD2A患者診斷中的價值，為該病的臨床診斷和基因檢測提供更多參考依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 臨床特征病例1（先證者），男，34歲，因“四肢乏力10余年，加重伴行走不穩(wěn)、下肢麻木4年”于2020年11月16日入院?；颊?0年前無明顯誘因出現(xiàn)四肢乏力，主要表現(xiàn)為活動易疲勞，休息后逐漸緩解，4年前患者感四肢乏力較前明顯加重，下肢乏力為甚，逐漸向上肢發(fā)展，伴行走不穩(wěn)，活動略緩慢，雙側大腿外側麻木，遂就診于我院。既往強直性脊柱炎4年，家族中同胞哥哥有類似病史。體格檢查：高級神經(jīng)活動正常，腦神經(jīng)檢查未見異常，無明顯肌萎縮，四肢近端肌力5-級、遠端5級，肌張力均正常，雙側腓腸肌無肥大，無肌肉壓痛，伴有漏斗胸，翼狀肩，肱二頭肌肌腱反射可，余腱反射減退，膝反射消失，病理反射未引出，直線行走較差，下蹲起立可。入院后完善相關檢查: 肌酸激酶（creatine kinase，CK）682 U/L（正常值38～174 U/L），乳酸脫氫酶76 U/L（正常值109～245 U/L），雌二醇222.90 pmol/L （正常值41～159 pmol/L）。其他常規(guī)結果均正常。心電圖：竇性心律不齊。大腿MRI：雙側大腿肌肉萎縮伴結締組織脂肪化，以后群、內側群肌肉受累最為嚴重，大腿前群肌肉亦有累及，但程度較輕。肌電圖提示肌源性損傷，神經(jīng)傳導速度正常。肌肉活檢（右股內收?。杭±w維輕度大小不等，少數(shù)肌纖維萎縮，見個別核聚集，未見明顯變性壞死肌纖維（見圖1）。

圖1 肌肉組織病理檢查蘇木素-伊紅（HE）染色結果 肌纖維輕度大小不等，少數(shù)肌纖維萎縮，見個別核聚集，未見明顯變性壞死肌纖維、肌裂或核內移，箭頭示部分肌纖維萎縮。

病例2（先證者之兄），男，34歲，為例1的同胞哥哥，四肢乏力表現(xiàn)與先證者類似，但程度較輕，既往有先天性白內障，強直性脊柱炎4年。體格檢查：高級神經(jīng)活動正常，腦神經(jīng)檢查未見異常，異常乳房肥大，無明顯肌萎縮，雙側小腿肌肉假性肥大，鴨步，四肢近端肌力5-級，遠端肌力5級，肌張力正常，雙上肢腱反射減退，左下肢膝反射消失，右下肢膝反射減退，雙側跟腱反射存在，病理反射未引出。入院后完善相關檢查：CK 567 U/L，乳酸脫氫酶270 U/L，α-羥丁酸脫氫酶186 U/L（正常值72～182 U/L），甘油三酯2.67 mmol/L（正常值＜1.7 mmol/L），孕酮：0.51 nmol/L（正常值＜0.474 nmol/L），雌二醇：224.9 pmol/L，其他常規(guī)檢查結果大致正常。心電圖：竇性心動過緩伴不齊，完全性右束支傳導阻滯。心臟超聲：心臟舒張功能減退。大腿MRI：大腿內側群、后群輕度萎縮伴脂肪化。肌電圖提示肌源性損傷，神經(jīng)傳導速度未見明顯異常。

1.2 基因檢測與結果首先采用高通量測序（highthroughput sequencing，HTS）對先證者（Ⅱ2，見圖2）外周血DNA樣本進行肌肉病相關基因外顯子捕獲測序，結果顯示CAPN3基因第4號外顯子上存在錯義突變 c.526G＞A（p.Val176Met），第176位的遺傳密碼子改變，氨基酸從纈氨酸突變?yōu)榈鞍彼帷.526G＞A曾被文獻提及過，在ClinVar數(shù)據(jù)庫中被歸類為臨床意義未明突變。先證者該變異位點顯示為純合，但外顯子測序分析軟件提示受檢者可能攜帶了一段位于基因組 15q15.1處約 19.3 kb片段的雜合缺失變異。進一步行Sanger測序驗證（見圖3），針對4號外顯子設計引物序列：正向引物5'- TGTGTGTAAGAAGAACTGGTGG -3'，反向引物為5'- CCTGTGGGTGTCTTGGTTAT -3'，對目標區(qū)域片段進行PCR測序。結果表明，先證者及其胞兄（Ⅱ1）確實存在純合突變，其父（I1）為c.526G＞A（p.Val176Met）變異攜帶者，但其母（I2）未檢測到上述位點變異。最后，qPCR對家系中CAPN3基因的15q15.1區(qū)域進行檢測（表1），發(fā)現(xiàn)先證者、先證者胞兄及母親，都存在該區(qū)域的雜合缺失，驗證了外顯子測序分析結果，是由于CAPN3基因2-14號外顯子雜合缺失使4號外顯子點突變處于特殊的“半合子”狀態(tài)。目前為止，CAPN3基因15q15.1區(qū)域雜合缺失未被報告。該變異包含CAPN3基因的第 2～14 號外顯子，可能會導致編碼的蛋白功能喪失，并在DGV普通人群數(shù)據(jù)庫中未檢出該變異，依據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會 （American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）遺傳變異分類標準與指南[2]為疑似致病性變異。只有患者為復合雜合突變，只攜帶單個點突變或缺失的家系攜帶者表型未見異常，表明基因突變與表型存在共分離。綜上所述，根據(jù)ACMG 遺傳變異分類標準與指南，該復合雜合突變是致病突變。

圖2 先證者家系圖 先證者父親（I1）為c.526G＞A（p.Val176Met）變異攜帶者，先證者母親（I2）存在15q15.1（chr15:42676681-42695975）雜合缺失變異，先證者（Ⅱ2）及其孿生哥哥（Ⅱ1）存在c.526G＞A（p.Val176Met）和（chr15:42676681-42695975）雜合缺失的復合雜合變異。

圖3 先證者家系sanger測序 Sanger測序驗證CAPN3基因的雜合突變c.526G＞A（p.Val176Met），箭頭表示c.526G＞A突變所在位點。

表1 先證者家系CAPN3基因突變的qPCR檢測

2 討論

LGMD2A是CAPN3基因突變引起的常染色體隱性遺傳病,在最新的基于遺傳模式的命名方式中被稱為LGMD R1 calpain3-related[3]。LGMD2A主要臨床特征為骨盆和肩部近端肌肉進行性、對稱性的無力，多于兒童或成人早期起病，下肢重于上肢，多伴翼狀肩及跟腱攣縮，心臟和呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥在 LGMD2A型中并不常見[4]。病程早期血清CK水平明顯升高，后期逐漸下降[5]。肌肉影像學以下肢大腿肌肉受累為主，主要是大腿內收肌、后群肌和臀小肌[6]。LGMD2A患者的肌肉活檢表現(xiàn)為肌營養(yǎng)不良的特征，分葉狀肌纖維是其典型病理改變，但缺乏特異性。本研究中，即使2例患者具有相同的CAPN3基因變異，他們亦有不同的臨床表現(xiàn)，先證者臨床癥狀較其兄嚴重。

臨床上，假肥大型肌營養(yǎng)不良（Duchenne/Becker muscular dystrophy，DMD/BMD）可能表現(xiàn)出和LGMD2A相似的肌無力發(fā)作，且DMD/BMD更為常見，應注意加以鑒別診斷，尤其例2有雙側小腿肌肉假性肥大的臨床表現(xiàn)，這一體征是DMD/BMD的典型臨床表現(xiàn)[7]。LGMD2A和BMD均可于青年時期起病，疾病進展緩慢，表現(xiàn)為四肢近端肌肉無力萎縮，肌電圖呈肌源性損傷，肌肉活檢呈肌纖維變性、壞死，脂肪和結締組織增生等特點。但兩者在一些臨床表型和輔助檢查中仍存在差異。LGMD2A常伴翼狀肩和跟腱攣縮，BMD經(jīng)典體征是雙側腓腸肌肥大。研究顯示，兩者的CK升高程度不同，BMD的CK升高明顯，可達正常參考值上限的25～200倍，LGMD2A僅1～80倍[8]。肌肉MRI中受累肌群有所不同，BMD腓腸肌內、外側頭均可受累，股四頭肌股內側肌和股外側肌、 股中間肌受累明顯，而LGMD2A腓腸肌外側頭和股四頭肌的股外側肌相對保留。BMD常累及心臟[9]，心電圖的經(jīng)典表現(xiàn)包括：R波增高，下側壁導聯(lián)深 Q波和傳導異常，超聲心動圖大多表現(xiàn)為左心室擴張[10]。而LGMD2A型較少累及心臟[11]。LGMD2A為常染色體隱性遺傳，BMD為X連鎖隱性遺傳，家族史上表現(xiàn)亦不同。

本研究報告2例患者均為青年男性，隱匿起病，緩慢加重，四肢近端肌肉無力，以下肢無力為主，四肢腱反射不同程度減退或消失，中度增高，肌電圖和肌肉活檢均顯示肌源性損傷，定位于肌肉，故臨床初步診斷肌營養(yǎng)不良癥?；颊呔行呐K受累，表現(xiàn)出心電圖及心臟彩超異常，例2伴有雙側小腿假性肥大，易誤診為BMD。之后進行基于HTS的全外顯子組測序，并采用Sanger測序驗證測序找到的突變位點，qPCR對外顯子水平的缺失進行驗證，最終在CAPN3基因中找到了復合的雜合突變。該家系符合常染色體隱性遺傳，結合臨床表現(xiàn)和基因檢查結果，兩位患者最終確診為LGMD2A。

本文報告了一對LGMD2A型兄弟，臨床表現(xiàn)與BMD相似，容易誤診，提示臨床表現(xiàn)、輔助檢查及肌肉病理雖然對遺傳性肌肉疾病的診斷有導向作用，但最終還需結合基因檢測進行診斷。基因檢測是診斷遺傳性肌肉疾病的“金標準”，注意鑒別LGMD的分型[12]。本文報告了CAPN3基因新的復合雜合突變，增加了人群CAPN3基因突變的多樣性和復雜性，證明了外顯子測序分析對于小片段拷貝數(shù)變異分析的可行性和臨床價值。