侯雄軍，吳文明，羅天澤，沈成英，杜超穎，胡建新

1.江西省人民醫(yī)院，南昌醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006；2.南昌大學藥學院，江西 南昌 330031

韭蓮（Zephyranthes carinata）為石蒜科（Amaryllidaceae）蔥蓮屬（Zephyranthes）植物［1］，又名風雨蘭、紅玉簾、韭蘭，原產(chǎn)于南美，在我國南方及長江流域廣泛栽培。韭蓮全草均可入藥，具有良好的散熱解毒、活血消腫、涼血止血的功效。韭蓮主要次生代謝產(chǎn)物為生物堿［2-3］，是其主要的活性成分，具有抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗癌等生理活性［1］，其中石蒜堿是最具特征性的成分。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，石蒜堿具有良好的抗腫瘤、抗菌、抗寄生蟲、抑制乙酰膽堿酯酶等活性［4-9］。因此，韭蓮總生物堿的分離純化工藝研究，對于其藥效的物質(zhì)基礎開發(fā)利用顯得尤為重要。本研究以石蒜堿作為含量測定的指標，對大孔吸附樹脂分離純化韭蓮總生物堿的工藝進行系統(tǒng)考察與優(yōu)化，優(yōu)選出大孔吸附樹脂分離純化韭蓮總生物堿的最佳工藝，進而制備出生物堿含量較高的韭蓮有效部位，為后續(xù)的研究奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U-T9 紫外可見分光光度計（上海屹譜儀器制造有限公司）、PD-1E-50 型冷凍干燥機（長沙巴躍儀器有限公司）、RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、FBC1002 型超純水機（青島富勒姆科技有限公司）、METTLER TOLEDO AE240 型電子分析天平（中國梅特勒-托利多儀器廠）。

1.2 試藥

韭蓮藥材購于云南曲靖，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學馮育林教授鑒定為正品；石蒜堿標準品（上海源葉生物科技有限公司，批號：R17J10F93289，含量≥98%）；D101、AB-8、HPD300、NKA-9、ADS-7、DM130 大孔吸附樹脂（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為：D20GS171830、N03GS165685、S15GS160858、A05GS144103、B17O10E100047、L07D11X133496）；甲醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，色譜級），無水乙醇（食用級），水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 石蒜堿含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備精密稱取石蒜堿對照品12.80 mg，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得1.280 mg/mL 的對照品儲備液，再用甲醇將該儲備液稀釋為不同濃度（0.128、0.064、0.032、0.016、0.008、0.004、0.002 mg/mL）的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備精密稱取韭蓮對照藥材粉末1.0 g，用70 %乙醇加熱回流提取3 次，每次50 mL回流2 h，合并3 次提取液，減壓濃縮至干，用70%乙醇復溶，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，并定容至刻度。

2.1.3 檢測波長的選擇取石蒜堿對照品溶液和供試品溶液，于200～600 nm 范圍內(nèi)全波長掃描。結(jié)果顯示，兩者吸收圖譜相似，對照品和供試品在215、292 nm 處有較強吸收。因215 nm 處，溶劑效應較強，故選擇292 nm 作為檢測波長。

2.1.4 標準曲線繪制取“2.1.1”項下不同濃度的對照品溶液，以相應溶劑作空白校正，于292 nm 處測定各濃度對照品溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標（Y），溶液濃度為橫坐標（X），建立回歸方程，得Y=10.611X+0.004 4，R2=0.999 6（n=7），結(jié)果表明，石蒜堿濃度在0.002～0.128 mg/mL 范圍內(nèi)與吸光度具有較好的線性關(guān)系，見圖1。

圖1 石蒜堿標準曲線

2.2 韭蓮總生物堿純化工藝研究

2.2.1 上樣液的制備稱取韭蓮藥材粗粉500 g，加熱回流提取3 次（10 倍量70%乙醇），每次2 h，提取液用100 目篩網(wǎng)濾過，濾液減壓濃縮至無醇味，用純化水定容至2 500 mL，超聲溶解1 h，然后3 000 r/min 離心10 min，取上清液作為供試品原液。經(jīng)含量測定，供試品原液中總生物堿的含量為2.656 mg/mL。

2.2.2 靜態(tài)吸附試驗精密稱取各型號已處理好的大孔吸附樹脂1.0 g，置于50 mL 錐形瓶中，加入30 mL供試品原液，用保鮮膜密封，恒溫振蕩吸附24 h，精密吸取100 μL 溶液轉(zhuǎn)移至2 mL 容量瓶中，用純水定容至刻度，測定總生物的含量，計算靜態(tài)飽和吸附量，結(jié)果見表1。

2.2.3 解吸附試驗取已吸附好的樹脂，濾過，用少量純化水潤洗，吸干表面水分，加入70%乙醇30 mL，用保鮮膜密閉，恒溫振蕩解吸附2 h，精密吸取100 μL 溶液轉(zhuǎn)移至2 mL 容量瓶中，用純水定容至刻度，測定總生物的含量，計算解吸率，結(jié)果見表1。

表1 不同型號樹脂靜態(tài)吸附、解吸附性能比較

由表1 結(jié)果可知，上述6 種樹脂中，HPD300大孔吸附樹脂靜態(tài)飽和吸附量和解吸率均較優(yōu)，因此本實驗選用HPD300 大孔吸附樹脂作為韭蓮提取液總生物堿純化工藝研究的樹脂。

2.2.4 靜態(tài)吸附動力學曲線精密稱取HPD300 大孔吸附樹脂1.0 g，置于50 mL 錐形瓶中，加入供試品原液30 mL，用保鮮膜密封，恒溫振蕩吸附，分別于5、10、30、60、120、180、240、480、640、960、1 440 min 精密吸取100 μL 溶液轉(zhuǎn)移至2 mL 容量瓶中，用純水定容至刻度，測定各時間點總生物的含量，繪制HPD300 大孔吸附樹脂對韭蓮總生物堿的吸附動力學曲線，見圖2。

圖2 靜態(tài)吸附動力學曲線

由圖2 結(jié)果可知，靜態(tài)吸附240 min 后，HPD300大孔吸附樹脂對韭蓮提取液總生物堿的吸附基本達到飽和；靜態(tài)吸附640 min 后，已達最大吸附率的97 %以上。綜合吸附效果和時間因素，本實驗選擇240 min 作為靜態(tài)吸附時間。

2.2.5 上樣濃度考察精密稱取6 份已處理好的HPD300 大孔吸附樹脂9.8 g，柱體積（Bed volume,BV）為10 mL，濕法裝柱。量取6 份韭蓮提取液，每份40 mL，分別加入適量的純化水，使稀釋后提取液中總生物堿的質(zhì)量濃度分別為0.664、0.885、1.328、1.593、1.992、2.656 mg/mL，上柱動態(tài)吸附，收集流出液，并測定其中總生物堿的泄漏量，繪制動態(tài)吸附曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 上樣濃度對吸附效果的影響

由圖3 的結(jié)果可知，當上樣濃度為0.664～1.328 mg/mL時，上樣流出液中生物堿的泄露量隨濃度的增加而減少；濃度為1.328～1.593 mg/mL 時泄漏量降至最低，隨后隨濃度升高，泄漏量又逐步增加。因此上樣濃度控制在1.328～1.593 mg/mL 之間時，吸附量最佳。

2.2.6 上樣流速考察精密稱取5 份已處理好的HPD300 大孔吸附樹脂9.8 g（柱體積為10 mL），濕法裝柱。量取稀釋好的韭蓮提取液5 份，每份80 mL，分別以1、2、3、4、5 BV/h 的流速上柱，進行動態(tài)吸附，收集流出液，并測定其在292 nm 波長下的吸光度，結(jié)果見圖4。

圖4 上樣流速對吸附效果的影響

由“2.1.4”標準曲線結(jié)果可知，上樣流出液的吸光度值與其總生物堿含量為正向線性關(guān)系。因此，可通過觀察其吸光度與上樣流速之間的關(guān)系來推測其總生物堿含量與上樣流速之間的關(guān)系。由圖4 可知，上樣流出液中總生物堿的含量與上樣流速之間成正相關(guān)，當上樣流速為1、2、3 BV/h 時，上樣流出液中總生物堿含量增幅相對平緩，綜合考慮吸附效果和時間因素，本實驗選擇2 BV/h 作為上樣流速。

2.2.7 最大上樣量考察精密稱取已處理好的HPD300大孔吸附樹脂9.8 g（柱體積為10 mL），濕法裝柱，取稀釋好的韭蓮提取液，以2 BV/h 的流速上柱進行動態(tài)吸附，每5 mL 收集一管，測定上樣流出液中總生物堿的濃度，泄露曲線見圖5。

圖5 動態(tài)吸附泄露曲線

由圖5 結(jié)果可知，當上樣體積大于10 BV 時，上樣流出液中總生物堿的濃度開始升高；上樣體積大于22 BV 時，上樣流出液中總生物堿的含量顯著增高。為減少損失，提高樣品回收率，本實驗采用10 BV 作為最大上樣量。

2.2.8 梯度洗脫試驗精密稱取已處理好的HPD300大孔吸附樹脂9.8 g（柱體積為10 mL），濕法裝柱，取稀釋好的韭蓮提取液100 mL，以2 BV/h 的流速上柱進行動態(tài)吸附，上樣完后，靜置吸附4 h。然后，依次用8 BV 水，8 BV 10%、30%、50%、70%、95%乙醇洗脫，洗脫流速2 BV/h，每10 mL 收集一管洗脫液，測定每管洗脫液中總生物堿的含量，梯度洗脫曲線見圖6。

圖6 韭蓮總生物堿梯度洗脫曲線

試驗結(jié)果顯示，水洗至6 BV 時，洗脫液已經(jīng)無色，此時水洗液中生物堿含量已經(jīng)非常低。由圖6 結(jié)果可知，水洗液和95 %乙醇洗脫液中生物堿含量較少，生物堿類成分主要分布在10 %、30 %、50 %、70 %洗脫液中。故將韭蓮總生物堿的純化工藝初定為：先用6 BV 水洗脫至流出液無色，再用70 %乙醇洗脫。

2.2.9 醇洗脫體積考察精密稱取已處理好的HPD300大孔吸附樹脂9.8 g（柱體積為10 mL），濕法裝柱，取稀釋好的韭蓮提取液100 mL，以2 BV/h 的流速上柱進行動態(tài)吸附，上樣完后，靜置吸附4 h。然后，先用6 BV 的水洗脫至流出液無色，然后用70%乙醇洗脫，洗脫流速2 BV/h，分段收集洗脫液，測定其中總生物堿含量，洗脫曲線見圖7。

由圖7 結(jié)果可知，5 BV 的70 %乙醇基本能把韭蓮總生物堿洗脫完全，之后隨洗脫體積的增加，洗脫液中生物堿的含量極少，故確定70 %乙醇洗脫體積為5 BV。

2.2.10 洗脫流速考察精密稱取已處理好的HPD300大孔吸附樹脂9.8 g（柱體積為10 mL），5 份，濕法裝柱。量取稀釋好的韭蓮提取液5 份，每份100 mL，以2 BV/h 的流速上柱，進行動態(tài)吸附，上樣完后，靜置吸附4 h。按上述優(yōu)化方案，分別以1、2、3、4、5 BV/h 的流速洗脫，收集洗脫液，測定其中總生物堿的含量，計算洗脫量，結(jié)果見表8。

由圖8 結(jié)果可知，隨著洗脫流速的增加，洗脫量逐步降低。由于洗脫流速為1 BV/h 和2 BV/h 時，洗脫量變化不大，而采用1 BV/h 洗脫耗時較長，因此，確定最佳洗脫流速為2 BV/h。

圖8 洗脫流速考察結(jié)果

綜上所述，采用HPD300 大孔吸附樹脂純化韭蓮提取液中總生物堿的最佳工藝為：上樣提取液濃度1.328～1.593 mg/mL，上樣流速2 BV/h，上樣后靜態(tài)吸附4 h，先用6 BV 水洗脫至無色，再用5 BV 70 %乙醇洗脫，洗脫流速2 BV/h，收集洗脫液，減壓濃縮后凍干。

2.2.11 驗證試驗采用上述優(yōu)選的純化工藝，進行3 批次的驗證試驗，收集洗脫液，減壓濃縮后凍干，測定凍干粉中總生物堿的含量。結(jié)果顯示，三批次樣品70 %乙醇洗脫部位凍干粉總生物堿含量分別為65.63%、70.42%、66.80%，平均含量為67.62%（RSD=2.50%），表明HPD300 大孔吸附樹脂對韭蓮總生物堿的分離純化效果良好，且純化條件簡單，重現(xiàn)性好。

3 討論

中藥由于具有多通路、多成分、多靶點綜合作用的特點，在臨床上擁有獨特優(yōu)勢。因此，如何使中藥有效部位更加富集，提高活性成分的含量，是提高中藥臨床療效的關(guān)鍵技術(shù)問題。韭蓮的主要化學成分是生物堿，現(xiàn)已從韭蓮中分離出包括石蒜堿、加蘭他敏、Haemanthidine 等幾十種生物堿［2］。當前對這些生物堿藥理作用研究較多［10-11］，但未見有韭蓮總生物的分離純化工藝研究。因此，基于中藥的多通路、多成分、多靶點作用的特點，本研究以石蒜堿為指標，對韭蓮總生物堿的分離純化工藝做了系統(tǒng)研究。

大孔吸附樹脂是一種具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的有機高聚吸附劑，比表面積大，對多種常見中藥有效成分均具有良好的選擇吸附性，相較于其他傳統(tǒng)分離工藝，具有成本低，吸附容量大、速度快，穩(wěn)定性高，可反復使用等優(yōu)點［12］，在中藥有效成分的分離純化領域已得到廣泛應用。目前，通過樹脂來進行生物堿的純化仍是主要手段之一，針對不同中藥中生物堿類化合物的性質(zhì)，選擇合適的大孔吸附樹脂，不斷研究開發(fā)全新的、分離效果更優(yōu)的純化工藝，推動實驗室成果轉(zhuǎn)化，有利于促進我國中藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，充分挖掘中藥產(chǎn)業(yè)的巨大社會效益、生態(tài)效益潛力［13］。極性是決定大孔吸附樹脂對不同有機物吸附能力的關(guān)鍵因素，選擇合適極性的樹脂對中藥有效成分的分離純化至關(guān)重要?；诖耍狙芯拷Y(jié)合樹脂性能和參考文獻選擇了6 種不同極性的大孔吸附樹脂，并比較它們對韭蓮生物堿的吸附與解吸附性能，發(fā)現(xiàn)HPD300 大孔吸附樹脂對韭蓮總生物堿的分離純化效果良好，且純化條件簡單，重現(xiàn)性好，為進一步研究開發(fā)韭蓮生物堿奠定了基礎。