王銀紅，羅疆南，李靖云，陳征，胡亮，羅艷

湖南省藥品檢驗檢測研究院，湖南省藥品質(zhì)量評價工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410001

金雞系列品種（金雞片/顆粒/膠囊/丸）處方包含6 味藥材（金櫻根、雞血藤、千斤拔、功勞木、兩面針、穿心蓮），其藥理作用為清熱解毒，健脾除濕，通絡(luò)活血［1-2］。查詢國家藥品監(jiān)督管理局官網(wǎng)國產(chǎn)藥品查詢系統(tǒng)，共有4 家生產(chǎn)企業(yè)，9 個批準(zhǔn)文號，4 個劑型，7 個規(guī)格，分布于全國3 個?。ㄊ?、自治區(qū)）。經(jīng)查詢資料，金雞系列制劑的原研制劑為金雞顆粒（金雞沖劑）［3］，其余劑型為在金雞顆粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行劑型改變得到的?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)情況為金雞顆粒和金雞膠囊收載于中藥成方制劑第十六冊［1］；金雞丸為國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ09292006-2011Z；糖衣片收載于中藥成方制劑第十八冊［2］，三個企業(yè)的薄膜衣片均為國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的單頁標(biāo)準(zhǔn)，與糖衣片設(shè)置的檢驗項目一致。除金雞丸外，其他三種劑型的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基本一致，僅設(shè)置了功勞木和兩面針的薄層色譜鑒別項，檢驗項目較少，方中君藥金櫻根，臣藥雞血藤、千斤拔，佐藥兩面針均無相關(guān)質(zhì)控項目。本課題對金雞系列品種（片/顆粒/膠囊/丸）中六味藥材的薄層色譜鑒別方法及含量測定方法分別進(jìn)行了研究，并建立了其中四味藥材的薄層色譜方法及金雞系列品種（金雞片/膠囊/丸）的含量測定方法。同時，對原標(biāo)準(zhǔn)中兩面針和穿心蓮兩味藥材的薄層色譜方法進(jìn)行了優(yōu)化，建立了該系列品種更為完善的定性及定量檢驗標(biāo)準(zhǔn)，可為全面地評價金雞系列品種的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

半自動薄層點樣儀（Scanner 3/REPROSTAR3，瑞士卡瑪公司）；電子分析天平（AE240、XSE205DU,德國梅特勒公司）；高效液相色譜儀（LC-20AT，日本島津公司）；超聲清洗儀（CG-300，張家港市港威超聲電子有限公司）。

1.2 試劑與試藥

實驗中所用金櫻根（批號121481-201103）、雞血藤（批號121510-201105）、芒柄花素（批號110857-201412）、鹽酸小檗堿（110713-201212，供含量測定用，純度86.7 %）、鹽酸藥根堿（121481-200802，供鑒別用）、鹽酸巴馬?。?10732-200907，供含量測定用，純度86.1 %），均為中國食品藥品檢定研究院國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；鹽酸藥根堿純度為98.0 %（采用面積歸一化法計算）。試劑中除甲醇、乙腈（色譜純，Honeywell）外均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)分析純試劑；水為超純水。金雞丸（批號：20160101、20160305、20160306）由D 企業(yè)提供，金雞膠囊（批號：7516018、1115004、7516013）由A 企業(yè)提供，金雞片（批號：2616002、QC001、20160502）、金雞顆粒（批號：1315003、QC002、20160304）分別由A、B 及C 企業(yè)提供，陰性樣品按處方自制。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 TLC 方法研究與統(tǒng)一

2.1.1 新增金櫻根的TLC新增了金雞片/顆粒/膠囊三種劑型的金櫻根薄層色譜方法，修訂了金雞丸中金櫻根的薄層方法，對四種劑型方法進(jìn)行了統(tǒng)一。本方法以金櫻根對照藥材為對照，取供試品12 片（糖衣片）/8 片（薄膜衣片）/1 袋（顆粒）/5粒（膠囊）/3 g（丸），研細(xì)，經(jīng)乙醇超聲處理后，提取液蒸干，用0.05 mol/L 氫氧化鈉溶液20 mL溶解，用乙酸乙酯萃取，提取液蒸干，再用乙酸乙酯1 mL 溶解即得。對照藥材溶液的制備方法同供試品溶液，濃度為3 g/mL。薄層板采用硅膠G板，展開劑選用二氯甲烷-甲醇（8.5∶1.5），顯色采用噴以10 %硫酸乙醇溶液后加熱顯色。經(jīng)檢驗，四種劑型樣品均檢出金櫻根，陰性對照無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 金櫻根TLC圖譜

2.1.2 新增雞血藤的TLC新增了金雞片/顆粒/膠囊三種劑型的雞血藤薄層色譜方法，修訂了金雞丸中雞血藤的薄層方法，對四種劑型方法進(jìn)行了統(tǒng)一。本方法以芒柄花素對照品和雞血藤對照藥材為對照，取供試品4 片（糖衣片）/3 片（薄膜衣片）/1 袋（顆粒）/3 粒（膠囊）/1 g（丸），研細(xì)，經(jīng)乙醇回流提取后，提取液蒸干，用乙酸乙酯1 mL 溫?zé)崛芙?，即得。對照藥材溶液的制備方法同供試品溶液，濃度? g/mL。芒柄花素對照品用甲醇制成1 mg/mL 的溶液，即得。薄層板采用硅膠G 板，展開劑使用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（30∶6∶0.3），展開晾干后在紫外光燈（254 nm）下檢視。經(jīng)檢驗，四種劑型樣品均檢出雞血藤及芒柄花素，陰性對照無干擾。結(jié)果見圖2。

圖2 雞血藤TLC圖譜

2.1.3 新增千斤拔的TLC新增了金雞片/顆粒/膠囊/丸四種劑型的千斤拔薄層色譜方法，并對四種劑型方法進(jìn)行了統(tǒng)一。本方法以千斤拔對照藥材為對照，供試品溶液取金櫻根薄層鑒別項下供試品溶液。對照藥材溶液的制備同供試品溶液，濃度為1 g/mL。薄層板采用硅膠G 板，展開劑使用環(huán)己烷-丙酮（8∶3），顯色采用噴以10 %磷鉬酸乙醇溶液后加熱顯色。經(jīng)檢驗，四種劑型樣品均檢出千斤拔，陰性對照無干擾。結(jié)果見圖3。

圖3 千斤拔TLC圖譜

2.1.4 新增兩面針的TLC新增了金雞片/顆粒/膠囊/丸四種劑型的兩面針薄層色譜方法，并對四種劑型方法進(jìn)行了統(tǒng)一。本方法以兩面針對照藥材為對照，取供試品10 片（糖衣片）/7 片（薄膜衣片）/8 g（顆粒）/3.5 g（膠囊）/3 g（丸），研細(xì)，水溶后用濃氨試液調(diào)pH 值至11，用二氯甲烷萃取，提取液蒸干，加二氯甲烷1 mL 溶解，即得。對照藥材按照制法加水煮沸30 分鐘后，同供試品溶液制備方法制備為濃度為1 g/mL 的溶液。薄層板采用硅膠G 板，展開劑使用二氯甲烷-甲醇-濃氨試液（40∶1∶0.2），展開晾干后在紫外光燈（365 nm）下檢視。經(jīng)檢驗，四種劑型樣品均檢出兩面針，陰性對照無干擾。結(jié)果見圖4。

圖4 兩面針TLC圖譜

2.1.5 功勞木的TLC 修訂對四種劑型功勞木的薄層方法進(jìn)行了修訂，用二氯甲烷替代三氯甲烷，并優(yōu)化了供試品的制備方法。本方法以鹽酸小檗堿對照品、鹽酸巴馬汀對照品及功勞木對照藥材為對照，供試品取樣量修訂為3 片（糖衣片）/2片（薄膜衣片）/4 g（顆粒）/2 粒（膠囊）/1 g（丸），提取過程中用二氯甲烷替代三氯甲烷，其他同原標(biāo)準(zhǔn)。對照藥材溶液制備同供試品溶液，濃度為0.2 g/mL；對照品溶液均采用甲醇配制成濃度為0.2 mg/mL 溶液。薄層板采用硅膠G 板，展開劑使用正丁醇-冰乙酸-水（7∶1∶2）上層溶液，展開晾干后在紫外光燈（365 nm）下檢視。經(jīng)檢驗，四種劑型樣品均檢出功勞木、鹽酸小檗堿及鹽酸巴馬汀，陰性對照無干擾，結(jié)果見圖5。

圖5 功勞木TLC圖譜

2.1.6 穿心蓮的TLC 修訂修訂了四種劑型穿心蓮薄層色譜鑒別中供試品制備方法，增加脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品為對照，并將現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的展開劑三氯甲烷改為二氯甲烷。其余條件均與原標(biāo)準(zhǔn)一致。經(jīng)檢驗，四種劑型樣品均檢出穿心蓮、穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯，陰性對照無干擾，結(jié)果見圖6。

圖6 穿心蓮TLC圖譜

2.2 含量測定方法研究與統(tǒng)一

2.2.1 色譜條件采用安捷倫公司250 mm C18 色譜柱，型號Agilent C18 TC（2）（內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm）；流動相采用乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫：0～20 min，15 %→20 %乙腈；20～60 min，20 %乙腈；檢測波長：345 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫30 ℃。

2.2.2 對照品溶液的制備用甲醇作為溶劑，分別配制鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿對照品溶液，作為對照品母液（濃度均約為0.2 mg/mL）；對照品溶液為對照品母液加甲醇稀釋而成，濃度均約為0.004 mg/mL。

2.2.3 供試品溶液的制備金雞片除去包衣，研細(xì)，取約0.7 g/金雞膠囊研細(xì)，取約0.5 g/金雞丸研細(xì)，取約0.5 g；精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸-70 %乙醇溶液（1∶100）50 mL（金雞膠囊為25 mL），稱定重量，超聲處理30 min，放冷，用溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備按樣品制法制備缺功勞木的陰性樣品，取適量，按供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性試驗分別吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液按上述色譜條件測定，結(jié)果陰性對照無干擾，樣品中各色譜峰分離度良好。結(jié)果見圖7。

圖7 金雞片HPLC色譜圖：A.對照品溶液；B.陰性溶液；C.供試品溶液

2.2.6 線性關(guān)系的考察精密吸取“2.2.2”項下的對照品母液，分別稀釋成鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的系列對照品溶液，精密吸取上述對照品溶液各5 μL，分別按“2.2.1”項下的色譜條件測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為（X，ng）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明：鹽酸小檗堿對照品、鹽酸巴馬汀對照品、鹽酸藥根堿對照品均線性關(guān)系良好，其線性范圍分別為4.007～1 335.8 ng、3.245～1081.7 ng、3.320 1～1 106.7 ng，線性方程分別為Y鹽酸小檗堿=4 747.1x-4705 7，R2=0.999 5；Y鹽酸巴馬汀=4 883x-43 608，R2=0.999 4；Y鹽酸藥根堿=5 904.3x+2871.5，R2=1.000 0。

2.2.7 精密度試驗按“2.2.1”項下色譜條件，精密吸取對照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積，結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積、鹽酸巴馬汀峰面積、鹽酸藥根堿峰面積的RSD 分別為1.3 %、1.6 %、1.6 %，結(jié)果表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗分別測定鹽酸小檗堿對照品、鹽酸巴馬汀對照品、鹽酸藥根堿對照品于配制后的0、4、9、14、19、24 h 的峰面積，其RSD 分別為0.9 %、1.1 %、0.9 %，表明對照品溶液在配制后24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗取同一批號（金雞片批號：2 616002；金雞膠囊批號：7 516018；金雞丸批號：20160101）樣品，按“2.2.3”供試品處理方法各平行制備6 份供試品溶液，依法測定鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿三種成分的含量。結(jié)果見表1。

表1 重復(fù)性試驗結(jié)果表（n=6）

2.2.10 加樣回收率試驗取已知含量的樣品（同重復(fù)性項下）各6 份，金雞片0.35 g/金雞膠囊0.25 g/金雞丸0.25 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對照品適量，按“2.2.3”供試品處理方法處理，測定，計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗結(jié)果表（n=6） %

2.2.11 樣品的含量測定取不同批次的樣品，按“2.2.3”供試品處理方法制備，測定，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別藥味的選擇

金雞系列制劑中金雞片、金雞顆粒及金雞膠囊原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均僅建立了功勞木和穿心蓮的薄層色譜鑒別，而方中君藥金櫻根，臣藥雞血藤、千斤拔及佐藥兩面針［4］均無有效的質(zhì)控方法。因此，本課題對四種劑型中該4 味藥材進(jìn)行了薄層色譜鑒別的研究［5-7］，建立了相應(yīng)的薄層色譜鑒別方法，同時，對本系列制劑中穿心蓮和功勞木的薄層色譜方法進(jìn)行了改進(jìn)，增強(qiáng)了系列制劑質(zhì)量的可控性。

3.2 含量測定指標(biāo)的選擇

結(jié)合四種劑型特征圖譜的研究結(jié)果［8-9］可知，樣品中主要色譜峰歸屬于金櫻根及功勞木，而雞血藤、千斤拔、兩面針及穿心蓮中的主要成分峰均較小。因此，選擇可同時測定方中金櫻根和功勞木的含量測定色譜條件，對樣品進(jìn)行研究，樣品色譜圖中，金櫻根的三個特征峰暫無對照品，功勞木中非洲防己堿量太小，且雜質(zhì)峰有干擾，均無法定量，故僅對功勞木中的鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸藥根堿三種成分的總量進(jìn)行了定量研究，建立并統(tǒng)一了金雞丸、金雞片、金雞膠囊中的含量測定方法。由于金雞顆粒樣品中鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀及鹽酸小檗堿的含量均極低，未達(dá)到定量限以上，故暫未建立金雞顆粒含量測定方法。

3.3 結(jié)果分析

實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)金雞顆粒相較于其他劑型樣品，各薄層色譜斑點較淡，特別是千斤拔的薄層鑒別，但為了嚴(yán)格控制制劑質(zhì)量，防止少投料、不投料以及采用質(zhì)量較差的藥材投料的情況發(fā)生，仍將千斤拔的薄層鑒別方法納入該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

從兩面針的薄層色譜圖中可以看出，不同企業(yè)的樣品色譜行為差異較大，表明不同企業(yè)采用的兩面針?biāo)幉脑诨?、質(zhì)量等方面均有差異。而現(xiàn)階段市場上部分兩面針?biāo)幉臑樗庌r(nóng)散種，極易造成基源混亂、質(zhì)量參差不齊的現(xiàn)象。故建立兩面針的質(zhì)控方法，并結(jié)合毛兩面針?biāo)氐暮Y查［10-11］，可以有效地控制兩面針投料藥材的真?zhèn)渭百|(zhì)量，對系列制劑的質(zhì)量評價具有非常重要的意義。

本研究建立了金雞系列品種（金雞片/膠囊/丸）中三種生物堿的含量測定方法。從含量測定結(jié)果來看，不同劑型、同一劑型不同生產(chǎn)企業(yè)之間的測定結(jié)果差異均較大，該方法可有效地用于金雞系列品種質(zhì)量分析和評價中。