程海玲，王 寧，曹芹雪，霍會蠶，王 琛

宮頸癌是婦科惡性腫瘤致死的重要原因。每年約1/3的新發(fā)病例發(fā)生在我國，且發(fā)病率逐年升高[1]。既往研究[2-3]顯示，腫瘤細(xì)胞中線粒體數(shù)量多于正常細(xì)胞，且線粒體復(fù)合物一、三抑制劑可抑制腫瘤生長，推測腫瘤細(xì)胞中線粒體功能活躍。該課題組根據(jù)組蛋白去乙?；敢种苿?trichostatin a，TSA)對腫瘤細(xì)胞凋亡具有特異性誘導(dǎo)作用的原理，篩選出凋亡相關(guān)基因泛醇-細(xì)胞色素C還原酶亞基2(ubiquinol-cytochrome C reductase subunit 2，QCR2)，且發(fā)現(xiàn)其異常高表達(dá)于宮頸癌組織，推測QCR2作為致癌基因參與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展。該研究通過構(gòu)建沉默QCR2的宮頸癌SiHa細(xì)胞株，研究其對該細(xì)胞的周期阻滯作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞宮頸癌SiHa細(xì)胞株購于上海江林生物科技有限公司。培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基，標(biāo)準(zhǔn)條件(37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)箱。

1.2 藥物、主要試劑和儀器攜帶綠色熒光蛋白的QCR2 siRNA(上游：5′-AUGACUGCCGCAUGUUACG CACAC-3′，下游：5′-UGCACAGCUGUGCACGCUAC GUGC-3′)、QCR2 siRNA2(上游：5′-UGCAGCGUG CGUGCACGCGUGACG-3′，下游：5′-UGCACGCUGCA CUAGUGGCUGCAC-3′)、control siRNA質(zhì)粒(深圳默賽爾生物醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司)；LipofectamineTM3000脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；TRIzol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(美國Sigma公司)；QCR2、p53一抗(美國Santa Cruz公司)；碘化丙啶(propidium iodide，PI)染液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；泛素-蛋白酶體抑制劑PS341(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Pierce Crosslink IP kit試劑盒(上海北諾生物科技有限公司)。DMI4000B型熒光顯微鏡(德國徠卡微系統(tǒng)有限公司)；FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 收集對數(shù)期SiHa細(xì)胞，胰蛋白酶消化，接種于24孔板，細(xì)胞融合度達(dá)75%時(shí)，更換成雙抗完全培養(yǎng)基。嚴(yán)格按照LipofectamineTM3000脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染說明書操作，LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑5 μl加至Opti-MEM無血清培養(yǎng)基100 μl中(A液)，待轉(zhuǎn)質(zhì)粒(QCR2 siRNA1、QCR2 siRNA2、control siRNA)各5 μl加至Opti-MEM無血清培養(yǎng)基100 μl中(B液)，A液與B液混合，室溫孵育5 min。孵育期間，每個(gè)孔板更換為新鮮培養(yǎng)基1.8 ml，孵育完成后每孔加入混合液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，篩選有效siRNA。將轉(zhuǎn)染有效siRNA、control siRNA質(zhì)粒的細(xì)胞分別設(shè)為QCR2 siRNA組、control siRNA組，未經(jīng)處理的SiHa細(xì)胞設(shè)為空白組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。熒光顯微鏡下觀察，發(fā)出明亮的綠色熒光者為陽性細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.2qRT-PCR、Western blot檢測QCR2 mRNA與蛋白相對表達(dá)量 取空白組、control siRNA組、QCR2 siRNA組細(xì)胞，加入TRIzol 1 ml，經(jīng)濃度、純度檢測后逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，鑒定后對反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行設(shè)置，重復(fù)40次，72 ℃延伸5 min。以GAPDH為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。QCR2上游引物序列：5′-TGCACGCATAGCAGGCACGTGCAC-3′，下游引物序列：5′-GTACGTGTGACAGTCGTACAACGC-3′；GAPDH上游引物序列：5′-GTGACCGTGAATTCACCGCACGCT-3′，下游引物序列：5′-TGACACGACGTGCACACAGTCGTG-3′。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

取空白組、control siRNA組、QCR2 siRNA組細(xì)胞，PBS洗滌，RIPA細(xì)胞裂解液裂解，離心收集沉淀，BCA試劑盒定量。取40 μg樣品混合上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，10 000 r/min離心15 min，收集上清液，恒壓下分離，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，加入QCR2一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBTS漂洗，加入山羊抗兔IgG二抗(1 ∶8 000)常溫孵育2 h，TBTS漂洗。暗室顯影，F(xiàn)luor Chem FC2成像系統(tǒng)掃描、分析，以QCR2/GAPDH灰度值表示蛋白相對表達(dá)量。

1.3.3PI染色檢測細(xì)胞周期 取空白組、control siRNA組、QCR2 siRNA組細(xì)胞，至融合度80%左右時(shí)胰蛋白酶消化，培養(yǎng)基終止消化，輕吹細(xì)胞，移至15 ml離心管，4 ℃，2 500 r/min離心5 min；預(yù)冷PBS沖洗，同條件離心5 min；100 μl PBS重懸，加入1 ml 70%預(yù)冷乙醇，混合均勻；4 ℃固定12 h，2 500 r/min，半徑12 cm離心5 min，預(yù)冷PBS沖洗細(xì)胞；加入PI染液(RNaseA 10 μl，染色緩沖液0.5 ml，PI染液25 μl)，遮光冰浴30 min；300細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.4qRT-PCR、Western blot檢測p53 mRNA與蛋白相對表達(dá)量 取QCR2 siRNA組細(xì)胞，用生理鹽水(normal saline，NS)溶液溶解泛素-蛋白酶體抑制劑PS341，以終濃度50 nmol/L干預(yù)QCR2 siRNA組細(xì)胞4 h，設(shè)為QCR2 siRNA+PS341組，另取QCR2 siRNA組細(xì)胞以等量NS干預(yù)4 h，設(shè)為QCR2 siRNA+NS組。

qRT-PCR分別檢測空白組、control siRNA組、QCR2 siRNA組p53 mRNA相對表達(dá)量。操作同1.3.2， p53上游引物序列：5′-TGCGCGCAACTGCAC GCGTGCACGC-3′，下游引物序列：5′-CGTACGCTGCACGCTAGCTGCACGC-3′；GAPDH上游引物序列：5′-GTCGAAAACCACACTGCACCGCGTC-3′，下游引物序列：5′-GTCAACGGGTTTGCACGCTGCAACT-3′。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

Western blot檢測空白組、control siRNA組、QCR2 siRNA組，空白組、QCR2 siRNA組、QCR2 siRNA+NS組、QCR2 siRNA+PS341組p53蛋白相對表達(dá)量。操作同1.3.2，封閉液封閉后加入p53一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBTS漂洗，加入山羊抗兔IgG二抗(1 ∶8 000)常溫孵育2 h，TBTS漂洗。暗室顯影，F(xiàn)luor Chem FC2成像系統(tǒng)掃描、分析，以p53灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值表示其蛋白相對表達(dá)量。

1.3.5免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測p53泛素化水平 取空白組、control siRNA組、QCR2 siRNA組細(xì)胞，按照Pierce Crosslink IP kit試劑盒說明書要求操作。于NP-40裂解緩沖液中裂解，10 000 r/min離心15 min轉(zhuǎn)移上清液至新離心管。Protein A/G瓊脂糖珠經(jīng)PBS洗滌2次后制成50% Protein A/G瓊脂糖珠工作液。振蕩器4 ℃振蕩10 min以避免非特異性結(jié)合蛋白對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。10 000 r/min離心15 min轉(zhuǎn)移上清液至新離心管，棄去Protein A/G瓊脂糖珠，加入QCR2、p53一抗至總體積500 μl。振蕩器4 ℃緩慢振蕩過夜，離心收集免疫沉淀產(chǎn)物，PBS洗滌。加入上樣緩沖液15 μl，沸水浴5 min行Western blot檢測。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率觀察轉(zhuǎn)染48 h，熒光顯微鏡下觀察，QCR2 siRNA1的轉(zhuǎn)染效率大于QCR2 siRNA2，將其作為有效siRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率 ×200

2.2 QCR2 mRNA與蛋白相對表達(dá)量比較與空白組、control siRNA組比較，QCR2 siRNA組mRNA與蛋白相對表達(dá)量均降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 qRT-PCR、Western blot檢測QCR2表達(dá)與空白組比較：**P<0.01；與control siRNA組比較：##P<0.01

2.3 各組細(xì)胞周期分布對比與空白組、control siRNA組比較，QCR2 siRNA組G0/G1占比升高(P<0.01)，S、G2/M占比降低(P<0.01)。見圖3。

圖3 各組細(xì)胞周期分布情況A：各組細(xì)胞周期流式圖；B：各組細(xì)胞周期柱狀圖；與空白組比較：**P<0.01；與control siRNA組比較：##P<0.01

2.4 各組p53 mRNA與蛋白相對表達(dá)量比較

p53 mRNA相對表達(dá)量組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與空白組、control siRNA組比較，QCR2 siRNA組p53蛋白相對表達(dá)量升高(P<0.05)。見圖4。

圖4 qRT-PCR、Western blot檢測QCR2表達(dá)與空白組比較：**P<0.01；與control siRNA組比較：##P<0.01

2.5 各組p53蛋白相對表達(dá)量比較空白組、QCR2 siRNA組、QCR2 siRNA+NS組、QCR2 siRNA+PS341組p53蛋白相對表達(dá)量分別為(0.21±0.03)、(0.82±0.09)、(0.80±0.10)、(0.24±0.04)，與空白組、QCR2 siRNA+PS341組比較，QCR2 siRNA組、QCR2 siRNA+NS組p53蛋白相對表達(dá)量升高(P<0.05)。見圖5。

圖5 Western blot檢測p53蛋白表達(dá)A：空白組：B：QCR2 siRNA組；C：QCR2 siRNA+NS組；D：QCR2 siRNA+PS341組

2.6 各組p53泛素化程度比較空白組、control siRNA組、QCR2 siRNA組p53泛素化程度分別為(70.58±8.54)%、(71.03±8.62)%、(20.27±4.15)%，與空白組、control siRNA組比較，QCR2 siRNA組p53泛素化程度降低(t=11.848，P<0.001；t=11.864，P<0.001)。見圖6。

圖6 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測p53泛素化水平1:空白組; 2:control siRNA組; 3:QCR2 siRNA組

3 討論

宮頸癌是婦科高發(fā)生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，目前臨床關(guān)于其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，多認(rèn)為與細(xì)胞周期調(diào)控異常、ATM信號通路被激活、3q區(qū)域擴(kuò)增、內(nèi)切酶活性增強(qiáng)等有關(guān)[4-5]。由于該病早期無明顯及特異性癥狀，多數(shù)患者早期難以確診，僅能采取放化療為主的姑息治療方式，但治療靶向性不足，且具有較強(qiáng)的神經(jīng)、肝腎毒性，預(yù)后不良[6]。隨著對宮頸癌分子機(jī)制研究的逐步深入，基因靶向干預(yù)為該病治療提供了新的方向。

研究[7-8]證實(shí)，細(xì)胞周期調(diào)控基因突變是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一。該研究結(jié)果中，與空白組、control siRNA組比較，QCR2 siRNA組QCR2 mRNA與蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞周期G0/G1占比升高，提示沉默QCR2可將宮頸癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，從而抑制腫瘤。Abbaszadeh et al[9]研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞中無氧糖酵解途徑增強(qiáng)的主要原因是線粒體氧化磷酸化水平提高，且伴隨相關(guān)蛋白表達(dá)的增加。QCR2是線粒體氧化磷酸化復(fù)合體三的重要組成蛋白，本課題組以其與腫瘤細(xì)胞凋亡具有相關(guān)性為線索，進(jìn)一步檢測其在多種腫瘤組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其普遍高表達(dá)于乳腺癌、宮頸癌、肺癌、食管癌等疾病中，且與部分臨床特征具有相關(guān)性，揭示其致癌作用，為進(jìn)一步研究其參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

p53是目前公認(rèn)的作用最廣泛、最重要的抑癌基因，恢復(fù)其表達(dá)及功能活性是治療腫瘤的重要思路[10-11]。調(diào)控p53蛋白可從轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白修飾等層面進(jìn)行，其中泛素化降解過程是最重要的調(diào)控方式。泛素化是一種對靶蛋白進(jìn)行特異性修飾的過程，可調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡等多種進(jìn)程，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[12]。該研究結(jié)果顯示，與空白組、control siRNA組比較，QCR2 siRNA組p53 mRNA表達(dá)未發(fā)生明顯變化，蛋白表達(dá)升高，推測QCR2對p53具有調(diào)控作用，且該調(diào)控并非在轉(zhuǎn)錄水平，而是發(fā)生在蛋白水平，可能經(jīng)p53泛素-蛋白酶體降解途徑對其蛋白表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。為驗(yàn)證該推測，該研究在沉默宮頸癌細(xì)胞QCR2的同時(shí)加入泛素-蛋白酶體抑制劑PS341，結(jié)果顯示p53蛋白表達(dá)未發(fā)生變化，提示QCR2對p53蛋白表達(dá)的調(diào)控可能依賴于蛋白酶體。由于蛋白酶體是泛素化蛋白發(fā)生降解的主要場所，該研究進(jìn)一步檢測了沉默QCR2對p53泛素化水平的影響，顯示其泛素化水平降低。綜合以上結(jié)果，推測沉默QCR2可將宮頸癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，其作用機(jī)制與抑制p53泛素化，提高其蛋白表達(dá)有關(guān)。Han et al[13]研究顯示，QCR2在多種人類腫瘤中表達(dá)上調(diào)，抑制其表達(dá)可通過激活p53信號傳導(dǎo)并誘導(dǎo)p21依賴性細(xì)胞周期阻滯和衰老來抑制癌細(xì)胞生長，該研究結(jié)果與其具有相似性。