李晶鈴，陰赪宏

內(nèi)毒素血癥是由于病原菌釋放大量內(nèi)毒素至血液而引起的，以多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)為主要病理特征的一系列綜合征[1-2]。肝臟是人體內(nèi)最大的解毒器官，也是內(nèi)毒素代謝的主要場所，極易受到內(nèi)毒素攻擊，這也是內(nèi)毒素血癥常常并發(fā)肝功能障礙的主要原因[3]。既往研究[4-5]表明，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)在膿毒癥導致的器官損傷中介導重要機制。在膿毒癥動物模型中，有學者發(fā)現(xiàn)肝臟亦存在著局部RAS系統(tǒng)，該系統(tǒng)以血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)為主要效應分子，通過與肝細胞膜的血管緊張素1型受體(angiotensin type 1 receptor, AT1R)結(jié)合而增加血管緊張素原的轉(zhuǎn)錄與翻譯，從而形成自身反饋機制，引起惡性循環(huán)和不斷放大的炎性級聯(lián)反應[6]。該研究重點分析肝損傷和RAS表達的相關(guān)性，以進一步明確其病理機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康清潔級(specific pathogen free, SPF)Wistar大鼠90只， 6～8周齡，體質(zhì)量250～280 g，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物中心(動物合格證號：44007200004126，許可證號：SCXK(京)2018-0005)。本研究方案經(jīng)北京友誼醫(yī)院動物倫理委員會審批(批號：TUH18260001)，符合實驗室動物管理與使用準則。

1.2 試劑與儀器智能放免測量儀(上海原子能研究所日環(huán)儀器廠)；小型垂直電泳與電轉(zhuǎn)印裝置(美國Bio-Rad公司)；高速低溫離心機(美國SIGMA 公司)；一氧化氮(nitric oxide, NO)化學法試劑盒、內(nèi)皮素(endothelin, ET)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase, LDH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme Ⅱ, ACE Ⅱ)試劑盒購自海軍總醫(yī)院；血管緊張素Ⅰ(Angiotensin Ⅰ, Ang Ⅰ)、Ang Ⅱ、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白介素(IL)-10試劑盒購自北京市福瑞生物工程公司；AT1R及內(nèi)參引物購自美國Santa Cruz公司；脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)購自美國Sigma公司。

1.3 模型制備與取樣方法所有大鼠，適應性飼養(yǎng)一周，隨機分為9組，對照組10只和模型組8個亞組(注射后2、4、8、12、24、48、72 h和7 d共8個時間點)，模型組腹腔注射10 mg/kg LPS，對照組注射等體積無熱原水。對照組于注射后8 h取樣，模型組各個亞組以注射時為0點計時，分別于注射后2、4、8、12、24、48、72 h及7 d時取樣，1%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，取心臟血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心取血清，-20 ℃存儲。之后摘取肝臟，并分兩種樣本保存，一種制備為石蠟切片樣本，另一種液氮保存。

1.4 血清學指標檢測所得血清，采用內(nèi)毒素測定儀測定內(nèi)毒素水平；采用硝酸還原酶法測定NO水平；采用全自動放射免疫分析儀和ELISA試劑盒測定NOS、TNF-α、IL-10的血清水平，以及肝功能標志物ALT、AST、LDH的血清水平。

1.5 肝臟組織HE染色與病理評分隨機抽取大鼠1只/組，取肝臟組織，制備病理切片，HE染色，顯微鏡下觀察肝臟病理評分。評分標準：0分：肝組織結(jié)構(gòu)正常，細胞排列規(guī)則，無壞死和炎性浸潤；1分：肝細胞點狀壞死，存在散在的炎性浸潤和嗜酸小體；2分：肝細胞片狀或灶狀壞死，但壞死范圍在小葉1/3內(nèi)；3分：肝細胞廣泛壞死，占小葉1/3～2/3；4分：肝細胞廣泛壞死，超過小葉2/3。

1.6 組織學指標檢測所得肝臟組織，分為兩部分，一部分采用ELISA實驗測定ACE、Ang Ⅱ、AT1R水平；另一部分采用RT-qPCR實驗測定AT1R mRNA表達。RT-qPCR實驗的主要步驟：采用TRIzol總RNA抽提試劑盒提取組織的總RNA，所得RNA以DEPC水配置為1 μg/μl的溶液。采用核酸蛋白儀測定A260/A280的相對吸光度，1.8～2.2之間的為純凈度良好。再取2 μl RNA溶液，進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，90 V電泳30 min，采用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察18S和28S的條帶亮度，條帶清晰且28S/18S≥2為完整度良好。將合格產(chǎn)品納入反轉(zhuǎn)錄實驗，PCR儀中操作，常規(guī)反轉(zhuǎn)錄體系和條件生成cDNA。進行PCR擴增實驗，AT1R引物上游序列：5′-GGC GCG GGT TTG ATA TTT GAC A-3′，下游序列：3′-CAA AGG GCC AGC GGT ATT CCA TAG-5′。擴增條件：預變性，95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40 個循環(huán)。反應結(jié)束后確認擴增曲線和融合曲線，以2-ΔΔCt法計算表達量。

2 結(jié)果

2.1 血清應激和炎性介質(zhì)的比較模型組大鼠循環(huán)LPS在注射后迅速升高，于2 h時達峰，7 d時降至正常水平，中間時間段均高于對照組(P<0.05)。TNF-α和IL-10在注射后也迅速升高，于2 h時達峰；TNF-α和IL-10分別在8、12 h時降至正常水平，中間時間段均高于對照組(P<0.05)。NO與NOS在注射后逐漸升高，12 h時達峰；NO在4～48 h時高于對照組，NOS在2～48 h時高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠應激和炎性介質(zhì)水平變化

2.2 肝臟病理觀察對照組在注射前、注射后48 h和7 d三個時間點，肝臟形態(tài)正常，細胞排列整齊，肝組織病理評分基本為0，均無肝細胞變性及壞死現(xiàn)象；模型組注射前，大鼠肝臟形態(tài)正常，細胞排列整齊，注射后2 h和4 h時，也未發(fā)現(xiàn)明顯病理改變，注射后48 h，細胞出現(xiàn)變形和壞死，胞核增大，炎性細胞灶狀浸潤，評分為(1.5±0.5)分；注射后7 d，細胞廣泛壞死，炎性細胞廣泛浸潤，評分為(3.3±0.6)分。見圖1。

圖1 兩組大鼠各個時間點肝臟病理HE染色后觀察 ×200A:對照組；B:注射后2 h；C:注射后4 h；D:注射后8 h；E: 注射后48 h；F:注射后7 d

2.3 肝功能標志物的比較模型組大鼠的循環(huán)AST、ALT及LDH水平在LPS注射后即逐漸升高，8 h時達峰；AST與LDH在4～48 h時均高于對照組，ALT在2～72 h時均高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肝功能標志物的比較

2.4 循環(huán)RAS水平的比較模型組大鼠的循環(huán)PRA在注射后2 h顯著升高，之后逐漸降低，在48 h內(nèi)的水平均高于對照組(P<0.05)。ACE和Ang Ⅱ在注射后也呈現(xiàn)出先增后減的變化趨勢，ACE在2～24 h時，Ang Ⅱ在2～48 h時均高于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠循環(huán)RAS水平比較

2.5 肝組織RAS水平的比較模型組大鼠肝臟PRA在注射后2 h顯著升高，之后逐漸降低，在48 h內(nèi)的水平均高于對照組(P<0.05)。ACE、Ang Ⅱ、AT1R水平也呈現(xiàn)出先增后減的趨勢；ACE在2～24 h，Ang Ⅱ在2～48 h，AT1R在4～48 h時高于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠肝臟RAS水平比較

3 討論

內(nèi)毒素血癥是一組由血液中內(nèi)毒素積聚而引發(fā)的全身炎癥反應綜合征，極易引發(fā)多器官功能障礙綜合征，RAS過度激活是內(nèi)毒素血癥導致多器官功能障礙的重要機制之一[7]。本研究在前期也已證實LPS誘導的內(nèi)毒素血癥中，腎臟損傷、心臟損傷均伴隨有RAS的參與。肝臟亦存在著局部RAS，以Ang Ⅱ為主要效應分子，通過與肝細胞膜上面的AT1R結(jié)合增強血管緊張素原表達，進一步促進ACE合成和Ang Ⅰ、Ang Ⅱ的產(chǎn)生，形成一種肝臟內(nèi)部的自身反饋機制，在包括肝纖維化、脂肪肝、病毒性肝炎、肝癌、化療所致肝損傷等多種肝臟疾病中發(fā)揮了重要作用[8-10]。然而，關(guān)于肝臟系統(tǒng)中RAS是否參與了內(nèi)毒素血癥所致肝功能損傷，目前報道較為少見。

本研究表明，模型組大鼠在LPS注射后，應激和炎性介質(zhì)成數(shù)十倍增長，這與其他學者的報道[11]結(jié)果基本一致。既往研究[12]指出，LPS進入循環(huán)系統(tǒng)后被多種免疫細胞俘獲并發(fā)生免疫應答，其中巨噬細胞活化后可產(chǎn)生大量炎性因子，包括TNF-α、IL-6和IL-10等，其中TNF-α和IL-6還是凋亡信號通路的重要介質(zhì)，NF-κB/TNF-α和IL-6/STAT3等信號的激活可進一步促進細胞凋亡與組織損傷。在內(nèi)毒素血癥中，炎性損傷與氧化應激相輔相成，共同參與組織破壞，TNF-α積聚后可促進中性粒細胞脫顆粒釋放氧自由基，誘發(fā)與加重氧化應激損傷，而氧化應激產(chǎn)生的大量中間產(chǎn)物如白三烯、血栓素A2等都是強效促炎介質(zhì)，可促進炎性因子的產(chǎn)生，從而形成瀑布級聯(lián)反應[13]。因此應激和炎性介質(zhì)的升高證實內(nèi)毒素血癥模型制備相對成功。

肝臟病理觀察結(jié)果顯示模型組大鼠在注射后48 h，肝臟組織有較為嚴重的損傷，且注射結(jié)束后的7 d損傷程度并未見恢復，這說明內(nèi)毒素血癥引發(fā)的肝臟損傷可能是不完全可逆的。本研究顯示模型組大鼠在LPS注射后肝功能標志物均有較大幅度的升高，注射后4～48 h之間的水平均高于對照組。有研究指出，作為代謝和解毒的主要場所，肝臟也是內(nèi)毒素血癥最易受累的器官之一，為分析肝臟內(nèi)部的RAS變化，本研究進一步測定了循環(huán)系統(tǒng)和肝組織的PRA、ACE、Ang Ⅱ及AT1R。在RAS中，Ang Ⅰ來源于血管緊張素原，并進一步在ACE的催化作用下形成Ang Ⅱ，Ang Ⅱ是該系統(tǒng)的主要效應分子，可與受體結(jié)合，調(diào)節(jié)血壓、血管張力和水電解質(zhì)的代謝等活動[14]，這也是本研究選擇ACE、Ang Ⅱ、AT1R的重要原因。本研究結(jié)果顯示RAS的變化趨勢與肝功能損傷趨勢基本一致，這說明在內(nèi)毒素血癥所致肝臟損傷機制中，RAS可能也是重要的參與者。

綜上所述，該研究分析了內(nèi)毒素血癥大鼠模型發(fā)病的不同時間點肝功能損傷及局部RAS的變化，結(jié)果顯示肝臟損傷過程中均伴隨著局部RAS表達異常。研究認為內(nèi)毒素血癥所致肝損傷中可能有局部RAS的參與。