張建新, 劉雨露, 朱子貴, 趙 紅, 姚平波

肺癌是一種與吸煙、輻射、遺傳、環(huán)境等因素有關(guān)的呼吸道惡性腫瘤，早期通常不表現(xiàn)明顯癥狀，隨病情發(fā)展可出現(xiàn)咳嗽、咯血、胸痛、消瘦等[1]。肺癌惡性程度較高，可以直接擴(kuò)散或者經(jīng)血、淋巴道轉(zhuǎn)移至周圍的組織，預(yù)后較差[2]。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(transglutaminase 2，TGM2)屬于轉(zhuǎn)谷氨酰胺家族，可以催化蛋白質(zhì)多肽內(nèi)部的結(jié)構(gòu)變化，調(diào)控蛋白分子間的相互作用，調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[3-4]。近年來研究[5]顯示，TGM2高表達(dá)可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲，在肺癌的惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。但目前國內(nèi)關(guān)于TGM2在肺癌中研究報(bào)道較少，且其作用于肺癌的機(jī)制尚不明確。該研究探討了TGM2基因干擾對肺癌細(xì)胞的作用及可能機(jī)制，旨在為肺癌新靶向藥物的研發(fā)提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器3111型CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司；多功能酶標(biāo)檢測儀(iMark 680)購自美國Bio-Rad公司；光學(xué)顯微鏡(BX60型)購自日本Olympus公司；IQTM5型熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；FACScan流式細(xì)胞儀購自美國FranklinLakes；A549細(xì)胞購自中科院上海生命科學(xué)研究院；TGM2-shRNA質(zhì)粒(TGM2-shRNA1：5′-CCGGTGAGAAATACCGTGACTGCCTCTCGAGAGGC AGTCACGGTATTTCTCATTTTT-3′，作用位點(diǎn)為NM_004613.x-1779s1c1；TGM2-shRNA2：5′-CCGGCCACCCACCATATTGTTTGATCTCGAGATCAAACAATATG GTGGGTGGTTTTT-3′，作用位點(diǎn)為NM_004613.x-2519s1c1；TGM2-shRNA3：5′-CCGGAGAAATACCGTGACTGCCTTACTCGAGTAAGGCAGTCACGGTATTTC TTTTTT-3′，作用位點(diǎn)為NM_004613.x-1781s1c1；shRNA NC：5′-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTT CAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTT-3′)、TGM2 mRNA的RT-PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；RT-PCR反應(yīng)相關(guān)試劑盒、lipofectamineTM2000試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；兔抗人E鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)、N鈣黏蛋白(N-cadherin，N-cad)、纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、β-actin、辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗兔二抗購自美國CST中國公司。

1.2 A549細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染將A549細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%融合時(shí)，開始進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，按照操作說明將lipofectamineTM2000分別與shRNA-NC、TGM2-shRNA1、TGM2-shRNA2和TGM2-shRNA3進(jìn)行稀釋混合，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染6 h后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收取細(xì)胞。采用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染各組A549細(xì)胞中TGM2 mRNA水平，PCR上游引物：5′-CCCAGCAGGGCTTTATCTACCA-3′，下游引物：5′-GCAGATGTCTAGGATCCCATCTTCA-3′，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析TGM2 mRNA的相對表達(dá)量。Western blot檢測轉(zhuǎn)染各組A549細(xì)胞中TGM2蛋白表達(dá)水平。選擇干擾后相對表達(dá)量最低的shRNA1進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，將其分為對照組(Control)、shRNA-NC組(shRNA-NC)、TGM2-shRNA1組(TGM2- shRNA1)。對照組只加入lipofectamineTM2000，shRNA-NC組轉(zhuǎn)染shRNA-NC，TGM2-shRNA1組轉(zhuǎn)染TGM2-shRNA1。

1.4 A549細(xì)胞的克隆形成率測定取各組轉(zhuǎn)染后對數(shù)生長期A549細(xì)胞，調(diào)整為單細(xì)胞懸液(1×105個(gè)/ml)，以2×104個(gè)/孔接種于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12～14 d，待孔中大多數(shù)克隆中的細(xì)胞數(shù)量大于50個(gè)，PBS輕輕洗滌2次，每孔加入4%多聚甲醛室溫固定10 min后，每孔加入1%結(jié)晶紫染色5 min，觀察每孔內(nèi)A549細(xì)胞的克隆形成情況。

1.5 CCK-8法檢測A549細(xì)胞的增殖取各組轉(zhuǎn)染后對數(shù)生長期A549細(xì)胞，調(diào)整為單細(xì)胞懸液(1×105個(gè)/ml)，以2×104個(gè)/孔接種于96孔板中培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)1、2、3、4 d進(jìn)行CCK-8檢測，嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀檢測波長為450 nm時(shí)，各個(gè)孔的吸光度值。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測A549細(xì)胞凋亡取各組轉(zhuǎn)染后對數(shù)生長期A549細(xì)胞，調(diào)整為單細(xì)胞懸液(1×105個(gè)/ml)，PBS洗滌2次后，采用Annexin V-FITC/PI雙染法進(jìn)行染色，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，嚴(yán)格按照凋亡試劑盒的說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.7 Transwell檢測A549細(xì)胞的侵襲力取各組轉(zhuǎn)染后對數(shù)生長期A549細(xì)胞，調(diào)整為單細(xì)胞懸液(1×105個(gè)/ml)，向Transwell上室(自帶Matrigel膠)加入100 μl稀釋好的細(xì)胞懸液，然后加入200 μl的無血清培養(yǎng)基，下室為常規(guī)的含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室，除去上腔底部剩余的細(xì)胞，采用Diff-Quik Fix固定2 min，diff-quick染色液進(jìn)行染色，清水洗3次以上，顯微鏡下觀察觀察下室侵襲的細(xì)胞數(shù)。

1.8 小管形成實(shí)驗(yàn)檢測A549細(xì)胞小管形成數(shù)目取各組轉(zhuǎn)染后對數(shù)生長期A549細(xì)胞，調(diào)整為單細(xì)胞懸液(1×105個(gè)/ml)，以2×104個(gè)/孔接種于鋪Matrigel基質(zhì)膠(冰上預(yù)冷，避免氣泡出現(xiàn))的24孔板，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，每間隔4 h，密切監(jiān)測細(xì)胞小管結(jié)構(gòu)變化，在顯微鏡下觀察A549細(xì)胞的小管結(jié)構(gòu)，繼續(xù)培養(yǎng)16 h后，計(jì)數(shù)細(xì)胞小管形成數(shù)目。

1.9 Western blot檢測E-cad、N-cad、FN和VEGF蛋白表達(dá)水平取各組轉(zhuǎn)染后對數(shù)生長期A549細(xì)胞，采用細(xì)胞裂解液提取A549細(xì)胞的總蛋白，并進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜至PVDF，加入5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗(分別為E-cad、N-cad、FN和VEGF，β-actin為內(nèi)參，稀釋比例均為1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜緩沖液洗膜后加入二抗(稀釋比例為1 ∶5 000)，室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光顯影，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)對比條帶強(qiáng)弱。

2 結(jié)果

2.1 TGM2基因干擾后肺癌細(xì)胞中TGM2表達(dá)RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，TGM2-shRNA組細(xì)胞TGM2 mRNA水平和蛋白表達(dá)低于shRNA-NC組(F=277.416、348.639，P<0.05)，其中轉(zhuǎn)染TGM2-shRNA1后TGM2 mRNA水平和蛋白表達(dá)最低。見圖1。

圖1 TGM2基因干擾后肺癌細(xì)胞中TGM2表達(dá)A：RT-PCR檢測A549細(xì)胞mRNA水平；B：Western blot檢測A549細(xì)胞TGM2蛋白表達(dá)；1：對照組；2：shRNA-NC組；3：TGM2-shRNA1組；4：TGM2-shRNA2組；5：TGM2-shRNA3組；與shRNA-NC組比較：#P<0.05

2.2 TGM2基因干擾對肺癌細(xì)胞克隆形成率的影響克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組與shRNA-NC組A549細(xì)胞的克隆形成率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與shRNA-NC組比，TGM2-shRNA1組A549細(xì)胞的克隆形成率降低(F=62.534，P<0.05)。見圖2。

圖2 TGM2基因干擾對肺癌細(xì)胞克隆形成率的影響 結(jié)晶紫染色×100A：克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測A549細(xì)胞克隆形成情況；B：A549細(xì)胞克隆形成率；1：對照組；2：shRNA-NC組；3：TGM2-shRNA1組；與shRNA-NC組比較：#P<0.05

2.3 TGM2基因干擾對肺癌細(xì)胞增殖活性的影響CCK-8檢測結(jié)果顯示，對照組與shRNA-NC組A549細(xì)胞的增殖活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與shRNA-NC組比，TGM2-shRNA1組A549細(xì)胞的增殖活性降低(F=47.339，P<0.05)。見圖3。

圖3 TGM2基因干擾對肺癌細(xì)胞的增殖活性的影響與shRNA-NC組比較：#P<0.05

2.4 TGM2基因干擾對肺癌細(xì)胞凋亡率的影響流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與shRNA-NC組相比，對照組A549細(xì)胞的凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； TGM2-shRNA1組A549細(xì)胞的凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=75.827，P<0.05)。見圖4。

圖4 TGM2基因干擾對肺癌細(xì)胞凋亡率的影響A：流式細(xì)胞儀檢測A549細(xì)胞凋亡；B：A549細(xì)胞凋亡率；1：對照組；2：shRNA-NC組；3：TGM2-shRNA1組；與shRNA-NC組比較：#P<0.05

2.5 TGM2基因干擾對肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell檢測結(jié)果顯示，與shRNA-NC組相比，對照組侵襲A549細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TGM2-shRNA1組侵襲A549細(xì)胞數(shù)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=52.930，P<0.05)。見圖5。

圖5 TGM2基因干擾對肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響 Diff-Quik×400A：Transwell檢測A549細(xì)胞侵襲；B：侵襲A549細(xì)胞數(shù)；1：對照組；2：shRNA-NC組；3：TGM2-shRNA1組；與shRNA-NC組比較：#P<0.05

2.6 TGM2基因干擾對肺癌細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，與shRNA-NC組相比，對照組A549細(xì)胞E-cad、N-cad和FN蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TGM2-shRNA1組A549細(xì)胞E-cad蛋白表達(dá)升高，N-cad和FN蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=76.315、143.342、102.716，P<0.05)。見圖6。

圖6 TGM2基因干擾對肺癌細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白的影響A：Western blot檢測A549細(xì)胞蛋白表達(dá)圖譜；B：A549細(xì)胞E-cad、N-cad和FN蛋白相對表達(dá)量；與shRNA-NC組比較：#P<0.05

2.7 TGM2基因干擾對肺癌細(xì)胞小管形成數(shù)及VEGF蛋白表達(dá)的影響小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組與shRNA-NC組A549細(xì)胞小管形成數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與shRNA-NC組比，TGM2-shRNA1組A549細(xì)胞小管形成數(shù)減少(F=53.373，P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示，與shRNA-NC組相比，對照組A549細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TGM2-shRNA1組A549細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=162.451，P<0.05)。見圖7。

圖7 TGM2基因干擾對肺癌細(xì)胞小管形成數(shù)及VEGF蛋白表達(dá)的影響A：小管形成實(shí)驗(yàn)檢測A549細(xì)胞小管形成數(shù)，箭頭所指為小管 ×40；B：A549細(xì)胞小管形成數(shù)；C：Western blot檢測A549細(xì)胞蛋白表達(dá)；1：對照組；2：shRNA-NC組；3：TGM2-shRNA1組；與shRNA-NC組比較：#P<0.05

3 討論

肺癌是一種預(yù)后較差的呼吸道惡性腫瘤，近年來有研究基于肺癌的發(fā)病機(jī)制，研發(fā)了多種小分子靶向藥物，并將其應(yīng)用于臨床，取得了較好的臨床療效，可以改善晚期肺癌患者的預(yù)后[6]。TGM2是近年來研究比較多的一種廣泛存在于人體的蛋白質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶，在胃癌、乳腺、肺癌等許多惡性腫瘤中均出現(xiàn)表達(dá)異常升高，且異常升高的TGM2可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展。該研究中，相較于正常的A549細(xì)胞，TGM2基因沉默后，A549細(xì)胞的克隆形成率和增殖活性降低，細(xì)胞的凋亡率升高。研究結(jié)果表明，TGM2基因可以調(diào)控A549細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，TGM2基因沉默可以抑制肺癌A549細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究[7]顯示，TGM2高表達(dá)可以調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的血管生成，還可以激活NF-κB信號通路，改變腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，提示TGM2基因可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)，調(diào)控肺癌的惡性進(jìn)展，有望成為肺癌治療的新靶點(diǎn)，但其具體的調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

該研究中，TGM2基因沉默后，A549細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)降低。肺癌細(xì)胞的侵襲力是腫瘤細(xì)胞侵犯鄰近血管、組織的基礎(chǔ)，是影響患者肺癌預(yù)后的關(guān)鍵，提示TGM2基因沉默可以抑制肺癌的轉(zhuǎn)移，改善患者預(yù)后。該研究中，TGM2基因沉默可以促進(jìn)A549細(xì)胞E-cad蛋白表達(dá)，抑制N-cad和FN蛋白表達(dá)水平。E-cad和N-cad蛋白均為機(jī)體重要的Ca2+依賴的跨膜蛋白，其中E-cad廣泛分布于多種正常上皮細(xì)胞，對于維持細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞間連接具有重要的作用，可以介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞間的相互作用，其表達(dá)下調(diào)是細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)換的標(biāo)志[8]。N-cad在正常上皮細(xì)胞表達(dá)水平較低，N-cad蛋白表達(dá)上調(diào)可以誘導(dǎo)細(xì)胞表型發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)換，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表面的黏附作用，增強(qiáng)肺癌細(xì)胞侵襲的能力[9]。FN是廣泛存在于細(xì)胞表面的蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，也可以介導(dǎo)細(xì)胞間黏附作用，參與腫瘤細(xì)胞的遷移、黏附、侵襲等多種生物學(xué)過程[10]。Shan et al[11]研究表明，TGM2可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定性，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)骨架重建，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲，提示TGM2基因沉默可以影響細(xì)胞外基質(zhì)的形成，抑制A549細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

該研究中，TGM2基因沉默后，A549細(xì)胞的小管形成數(shù)降低。小管形成實(shí)驗(yàn)是臨床常用的一種評估血管生成的方法，可以反應(yīng)腫瘤細(xì)胞的血管形成情況[12]。已有研究[13]顯示，血管形成數(shù)可以反映腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，抑制腫瘤細(xì)胞的血管形成，可以抑制腫瘤的惡性進(jìn)展，提示TGM2基因沉默后，A549細(xì)胞的血管形成減少，增殖活性和侵襲能力下降。該研究中，TGM2基因沉默后，A549細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)降低。VEGF是細(xì)胞內(nèi)最重要的促血管生成因子，可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞血管的生成，為肺癌細(xì)胞惡性增殖提供營養(yǎng)，同時(shí)也為肺癌的侵襲和遷移提供途徑[14]。Lee et al[15]研究顯示，TGM2干擾可以抑制VEGF蛋白表達(dá)，抑制VEGF誘導(dǎo)的纖維化，促進(jìn)血管內(nèi)皮E-cad蛋白表達(dá)，提示TGM2基因沉默可能通過抑制A549細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

綜上所述，TGM2基因沉默可以抑制A549細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)，抑制血管形成，抑制肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。