曾振芳，袁 芳，黃秋萍，龐華鈺，楊紅蘭，黃秋嬋

(廣西民族師范學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，崇左 532200)

0 引 言

銅是人體必要的微量元素，參與機體內(nèi)許多生理過程，如細胞呼吸[1]、心血管健康[2]和代謝[3]。銅金屬配合物的合成及性質(zhì)研究受到了廣大學(xué)者的關(guān)注，岳愛琴等[4]合成的兩個銅(Ⅱ)配合物對體外HeLa、HepG2和SGC7901腫瘤細胞具有抑制增殖的能力。王大偉等[5]合成的2-羥基萘-1-甲醛Cu(Ⅱ)配合物對稻疫真菌具有抗菌活性。鄧燕等[6]合成槲皮苷銅配合物具有P-糖蛋白抑制作用。HSA(人血清蛋白)是人體循環(huán)系統(tǒng)中含量最豐富的載體蛋白，它可以與許多內(nèi)因性和外因性物質(zhì)相結(jié)合，在儲存和運輸中起著重要的作用[7]，因其易溶于水，且不易與其他物質(zhì)反應(yīng)，可以用作臨床藥物研究中的模型蛋白質(zhì)，在臨床醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)中具有重要的應(yīng)用價值[8]?？鼓[瘤藥物與蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系及其引起的蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化亦是其誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡作用機制研究的目標(biāo)、內(nèi)容和途徑，故抗腫瘤藥物與HSA間相互作用的研究在生命科學(xué)以及生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要理論價值[9]。為了發(fā)現(xiàn)和發(fā)展新型金屬配合物作為抗腫瘤藥物，本文合成了一個新型對氯苯甲酸構(gòu)筑的銅(Ⅱ)配合物 [Cu(pcba)2·(phen)(H2O)]，通過紅外、元素分析及 X-射線單晶衍射等方法對配合物進行表征及結(jié)構(gòu)分析，并研究了配合物與HSA 的相互作用方式及配合物對胃癌細胞A549、宮頸癌細胞Hela和肝癌細胞HepG2的抗增殖能力。

1 實 驗

1.1 主要儀器和試劑

實驗儀器：XTL-220型顯微鏡(中國上海天省)，Spectrum 65型傅里葉變換紅外光譜儀(美國PerkinElmer)，HERA cell CO2型細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo)，Smart ApexII CCD X 型X-射線單晶衍射儀(德國 Bruker)，Multiskan Spectrum型酶標(biāo)儀(美國Thermo)，RF-5301 PC型熒光分光光度計(日本島津)，VarioEL Ⅲ元素分析儀(德國艾樂曼)，常數(shù)毛細管黏度計(中國上海申誼)，UV-8000型紫外可見分光光度計(中國上海元析儀器)。

實驗試劑：對氯苯甲酸(上海阿拉丁生化科技)，三水合硝酸銅(天津市光復(fù)科技)，甲醇(成都市科龍化工試劑廠)，三羥甲基氨基甲烷(Tris，武漢市恒沃科技)，DMEM培養(yǎng)液(Hyclone)，F(xiàn)12K培養(yǎng)液(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，CCK-8試劑(Biosharp)，0.25% 胰酶溶液(索來寶)，人正常肝細胞LO2、胃癌細胞A549、宮頸癌細胞Hela和肝癌細胞HepG2(中國科學(xué)院細胞庫)，順鉑(上海麥克林生化科技)，人血清蛋白(HSA，Sigma)，三羥甲基氨基甲烷(Tris，武市恒沃科技)。緩沖溶液是pH值為7.2的Tris-HCl/NaCl溶液，緩沖溶液和人血清蛋白(HSA)溶液根據(jù)文獻[10]配制。

1.2 配合物 [Cu(pcba)2·(phen)(H2O)] 的合成

稱取對氯苯甲酸0.047 0 g (0.3 mmol)、1-10-菲羅啉0.018 1 g (0.1 mmol)和三水硝酸銅0.024 2 g (0.1 mmol)，分別置于三個50.0 mL的燒杯中，各加5.0 mL甲醇將固體溶解，攪拌，將對氯苯甲酸溶液和1,10菲羅啉溶液分別滴至三水硝酸銅溶液中，滴加完畢，常溫下攪拌30 min，保鮮膜封口，10 d后析出淡藍色塊狀晶體，過濾后50 ℃下烘干。[Cu(pcba)2·(phen)(H2O)] 的分子式為C26H18Cl2CuN2O5，相對分子質(zhì)量MW=572.86。元素分析理論值(%)：C 54.51, H 3.17, N 4.89；實驗值(%)：C 54.38, H 3.12, N 4.78。IR(ν/cm-1): 3 414, 1 593, 1 388, 1 089, 1 017, 831, 776, 721, 533。

1.3 配合物的晶體結(jié)構(gòu)測定

選擇合適大小為0.26 mm×0.24 mm×0.18 mm的晶體置于CCD X 射線面探衍射儀上，衍射光源為石墨單色化的Mo-Kα(λ=0.071 073 nm)，溫度為300.75 K，數(shù)據(jù)收集角度范圍為2.053°<θ<29.340°，衍射區(qū)為(-10≤h≤10,-12≤k≤14,-19≤l≤20)，收集15 983個衍射點，其中獨立衍射點有5 207個。結(jié)構(gòu)分析工作采用OLEX2和SHEXTL-97軟件完成。由理論加氫法確定氫原子的坐標(biāo)，對氫原子和非氫原子分別采用各向同性和各向異性溫度因子進行全矩陣最小二乘法修正。配合物的晶體學(xué)、主要鍵長與鍵角分別列于表1、表2。CCDC:2104589。R(int)=0.034 0，R1=0.035 9，wR2=0.089 1。

表1 配合物的晶體學(xué)數(shù)據(jù)Table 1 Crystallographic data of the complex

表2 配合物的主要鍵長和鍵角Table 2 Selected bond lengths and bond angles of the complex

1.4 配合物與HSA相互作用

1.4.1 紫外-可見吸收光譜

在樣品池和空白池中分別加入2.5 mL 緩沖溶液校準(zhǔn)基線，將樣品池的緩沖溶液換成5 μmol·L-1的HSA溶液，并在250～300 nm的波長下掃描。用移液槍加入50 μL的配合物溶液(50 μmol·L-1)，吹打混勻。室溫下放置5 min后，在同樣波長范圍內(nèi)掃描，共加7次配合物溶液。

1.4.2 熒光光譜

向樣品池中加入2.5 mL的 5.0 μmol·L-1HSA溶液，最優(yōu)激發(fā)波長為300 nm，在波長為320～365 nm下掃描。用移液槍加入30 μL的配合物溶液(50 μmol·L-1)，吹打混勻，室溫下放置5 min后，在同樣波長范圍內(nèi)掃描，共加4次配合物溶液。

1.5 細胞毒性

將LO2、HepG2、HeLa和A549細胞消化，配制成濃度為5×104個/mL的細胞懸液，在96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL細胞懸液(每孔5×103個細胞)，將細胞培養(yǎng)板在37 ℃、5%CO2條件下過夜培養(yǎng)，使用培養(yǎng)液(90%培養(yǎng)液+10%胎牛血清)配制不同濃度配合物溶液，每孔加入100 μL配合物溶液，每種濃度重復(fù)3次，細胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后棄上清液，培養(yǎng)液洗滌細胞1次，CCK-8染色，λ=450 nm下用酶標(biāo)儀測定OD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物晶體結(jié)構(gòu)解析

配合物部分鍵長、鍵角列于表2，分子晶體結(jié)構(gòu)如圖1所示。

2.2 配合物與HSA的相互作用

2.2.1 紫外-可見吸收光譜

HSA與的配合物結(jié)合產(chǎn)生的紫外吸收光譜如圖2所示。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)α-螺旋化，HSA在273 nm處產(chǎn)生特征吸收峰。隨著配合物濃度增大，273 nm處的吸收峰發(fā)生減色效應(yīng)，表明配合物與HSA發(fā)生了相互作用[11]。

2.2.2 熒光光譜分析

HSA內(nèi)部含有氨基酸殘基，能吸收紫外線而發(fā)射內(nèi)源性熒光。由圖3可以看出，HSA強吸收峰在336 nm處，隨配合物濃度增高，熒光強度由96.89%降低至78.49%，這是由于配合物對HAS發(fā)生熒光猝滅作用。蛋白質(zhì)的熒光猝滅可分為兩種，一是動態(tài)猝滅，為電子轉(zhuǎn)移過程。二是靜態(tài)猝滅，因結(jié)合而導(dǎo)致熒光猝滅[12]。判斷熒光猝滅是動態(tài)猝滅還是靜態(tài)猝滅，可以用Stern-Volmer方程：F0/F=1+Kqτ0[C]=1+Ksv[C][9]，式中F和F0分別為加入和不加入配合物時EB-CT-DNA的熒光強度，Kq為分子猝滅過程的速率常數(shù)，Ksv為猝滅常數(shù)，τ0為猝滅劑不存在時熒光分子的平均壽命，[C]為猝滅劑的濃度?？汕蟮肒sv=2.35×105L·mol-1，猝滅速率常數(shù)Kq=Ksv×108=2.35×1013L·mol-1·s-1，顯然配合物對HSA的猝滅速率常數(shù)遠大于藥物小分子與生物大分子之間的最大擴散的碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L·mol-1·S-1[13]，表明配合物對HSA的熒光猝滅是靜態(tài)猝滅。對靜態(tài)猝滅，以lg[(F0-F)/F]對lg[C]作圖(見圖4)，計算得到配合物與HSA的結(jié)合常數(shù)Ka=2.14×1013L·mol-1，結(jié)合位點n=2.37，結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點比較大[14-16]，說明所合成配合物和HSA的結(jié)合能力較強。

2.3 細胞毒性

配合物 [Cu(pcba)2·(phen)(H2O)] 對胃癌細胞A549、宮頸癌細胞Hela、肝癌細胞HepG2和肝細胞LO2作用48 h后細胞的IC50值見表3，由表3可知，配合物對四種細胞都具有抗增殖作用，相同條件下，配合物對三種癌細胞的抗增殖效果遠遠大于配體pcba，抗癌效果沒有順鉑好，對四種細胞的毒性作用順序為LO2>A549>HepG2>HeLa。本文合成的 [Cu(pcba)2·(phen)(H2O)] 細胞毒性不如文獻[10]報道的配合物1細胞毒性效果好，[Cu(pcba)2·(phen)(H2O)] 的結(jié)構(gòu)單元中含有兩個對氯苯甲酸根，文獻[10]報道的配合物1結(jié)構(gòu)單元中含有四個4-氯3-硝基苯甲酸，可能是結(jié)構(gòu)單元中氯原子和硝基的數(shù)量導(dǎo)致細胞毒性差異。

表3 配合物的對LO2、A549、HeLa和HepG2細胞的毒性Table 3 IC50 of the complex against LO2, A549, HeLa, and HepG2 cell

3 結(jié) 論