牙周炎和種植體周圍炎是天然牙和種植體脫落的主要原因，其始動(dòng)因素主要為菌斑生物膜的堆積，致病菌包括牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、中間普氏菌等

。牙齦卟啉單胞菌可釋放多種毒力因子，如脂多糖、牙齦蛋白酶、肽聚糖、菌毛和凝血酶等，刺激宿主的先天免疫反應(yīng)

。另外牙齦卟啉單胞菌還可直接刺激其他類型細(xì)胞，顯著上調(diào)細(xì)胞的炎癥因子分泌，表現(xiàn)為典型的炎癥狀態(tài)

。

基于上述情況，本研究提出一種新的對(duì)菌液濃度的表示方法，利用圖像檢測(cè)方法[6]提取到的顏色特征值通過實(shí)驗(yàn)得到菌體生長期間數(shù)量變化時(shí)菌液渾濁度的改變與顏色特征值的關(guān)系，為以后對(duì)符合要求的菌體設(shè)定合適的閾值自動(dòng)檢測(cè)篩選提供基礎(chǔ).

自然界中細(xì)菌多數(shù)情況下以生物膜形式存在，附著于組織表面，并通過自分泌的細(xì)胞外基質(zhì)，如胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）、蛋白質(zhì)和環(huán)境DNA（e-DNA），將自身包裹其中，對(duì)抗環(huán)境壓力

。研究表明生物膜狀態(tài)下牙齦卟啉單胞菌等致病菌的致病性大約是浮游狀態(tài)下細(xì)菌的500倍

。

特定D-氨基酸可抑制某些細(xì)菌生物膜的形成。例如，枯草芽孢桿菌可產(chǎn)生D-甲硫氨酸（D-Methionine，D-Met）、D-色氨酸、D-酪氨酸和D-亮氨酸的混合物，防止生物膜的過度形成

；25 mmol/L的D-Met可顯著抑制與根管治療后持續(xù)感染相關(guān)的糞腸球菌生物膜的形成

。筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與單種D-氨基酸相比，D-精氨酸、D-Met和D-組氨酸的聯(lián)用增強(qiáng)了單種D-氨基酸對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜的清除作用

。另外，牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌、具核梭桿菌等在牙周組織中產(chǎn)生硫化物及蛋白代謝過程也與利用甲硫氨酸有關(guān)

。但是，D-Met對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜影響的具體機(jī)制尚不清楚。本試驗(yàn)擬初步探討D-Met通過影響環(huán)二鳥苷酸（cyclic diguanosine monophosphate，c-di-GMP）清除牙齦卟啉單胞菌生物膜的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

主要材料與試劑：牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277（ATCC，美國）；小鼠成纖維細(xì)胞L929（ATCC，美國）；BHI 培養(yǎng)基、DMEM 高糖培養(yǎng)基（索萊寶，中國）；c-di-GMP、D-Met（Sigma，美國）；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基（上海申啟，中國）；牛腦心浸液培養(yǎng)基（青島海博，中國）；胎牛血清（Thermo Fisher，美國）；0.1%結(jié)晶紫（北京酷來博，中國）；CCK-8試劑（Dojindo，日本）；乙酸銨、100%甲醇（北京瑞康，中國）；苯酚（上海研生，中國）。

1.2.3 D-Met 對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜生物量及胞外多糖的影響 ①生物膜形成抑制實(shí)驗(yàn)：細(xì)菌培養(yǎng)同上，對(duì)照組加入0 mmol/L D-Met，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度D-Met（5、10、15、20、25、30、35 mmol/L），37 ℃厭氧孵育3 d。以結(jié)晶紫染色法評(píng)估牙齦卟啉單胞菌生物膜形成過程中的生物量，即PBS 沖洗3 次，室溫干燥20 min，加入37%多聚甲醛，固定15 min，PBS 沖洗，加入0.1%結(jié)晶紫染液，室溫20 min，PBS 沖洗，加入乙醇（95%），20 min 后轉(zhuǎn)板，測(cè)定吸光度值（OD

）；以苯酚-硫酸法（OD

）測(cè)定牙齦卟啉單胞菌生物膜形成過程中胞外多糖含量，采用無水葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。②成熟生物膜裂解實(shí)驗(yàn)：37 ℃厭氧孵育3 d 形成成熟生物膜后，每組分別加入不同濃度D-Met（20、25、30、35 mmol/L），繼續(xù)厭氧孵育3 d，以上述同樣的方法測(cè)定牙齦卟啉單胞菌生物膜生物量及胞外多糖量。

1.2.4 掃描電鏡觀察牙齦卟啉單胞菌生物膜形態(tài)的變化 生物膜形成抑制及成熟生物膜裂解的實(shí)驗(yàn)過程及分組同上。PBS 沖洗3 次，2.5%戊二醛固定過夜（4 ℃）。乙醇梯度脫水（各10 min），烘干，噴金，采用掃描電鏡觀察生物膜形態(tài)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 D-Met 對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929 增殖的影響 將D-Met 以梯度濃度（5、10、15、20、25、30、35、40、45 mmol/L）溶解于細(xì)菌培養(yǎng)基中，使用0.22 μm濾膜進(jìn)行過濾滅菌。取100 μL 小鼠成纖維細(xì)胞（L929），復(fù)蘇消化后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成細(xì)胞濃度為5.0 × 10

個(gè)/mL，培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度D-Met的培養(yǎng)基100 μL，對(duì)照組加入等體積的DMEM 培養(yǎng)基，每天更換培養(yǎng)基。分別在第1、3、5 天，加入CCK-8 試劑，避光37 ℃孵育4 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 吸光度值（optical density，OD），計(jì)算各組細(xì)胞的增殖活力。

1.2.2 D-Met 對(duì)牙齦卟啉單胞菌細(xì)菌活性的影響 復(fù)蘇牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277，于BHI 液體培養(yǎng)基37 ℃厭氧培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，將菌液濃度調(diào)整為1.0 × 10

CFU/mL，接種于含不同濃度DMet 的BHI 液體培養(yǎng)基，對(duì)照組為不含D-Met 的BHI 液體培養(yǎng)基，每4 h 檢測(cè)其吸光度值，持續(xù)至72 h，評(píng)估最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）；取高于MIC 實(shí)驗(yàn)組孵育3 d，以菌落生長情況評(píng)估最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。

政府是消除貧困的主體，具有強(qiáng)大的政治優(yōu)勢(shì)和資源動(dòng)員能力，是我國扶貧攻堅(jiān)取得成功的關(guān)鍵。通過“當(dāng)?shù)卣鲗?dǎo)、人民銀行牽頭、金融機(jī)構(gòu)參與”的組織形式，建立多部門聯(lián)動(dòng)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)資源聯(lián)結(jié)，彌補(bǔ)單靠政府或僅依靠金融機(jī)構(gòu)實(shí)施金融精準(zhǔn)扶貧的弊端，解決易地扶貧搬遷后續(xù)扶持金融服務(wù)工作的政策保障、資源整合、信貸支持、精準(zhǔn)匹配以及風(fēng)險(xiǎn)分擔(dān)等問題。

主要儀器：恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（BB15，Thermo，美國）；酶標(biāo)檢測(cè)儀（synergy HT，Bio-TEK，美國）；低溫離心機(jī)（5810R，Eppendorf，德國）；掃描電子顯微鏡（S-4800，Hitachi，日本）；透射電子顯微鏡（（JEM 1400 PLUS，JEOL，美國）；高效液相色譜儀（Waters 1525，Waters，美國）。

低收入家庭在獲得住房救助方面，主要是獲得住房改造補(bǔ)貼，占比18.2%，且主要集中在農(nóng)村地區(qū)；獲得廉租房/公租房的比例為8.9%，主要集中在中心城市、城鄉(xiāng)郊區(qū)城鄉(xiāng)結(jié)合部以及縣城和建制鎮(zhèn)；僅有0.2%的低收入家庭獲得經(jīng)濟(jì)適用房/限價(jià)房。這跟低收入家庭住房來源密切相關(guān)，農(nóng)村地區(qū)低收入家庭主要居住自建房，獲取住房改造補(bǔ)貼較多，而中心城市居住租賃房較多，購房比例較少，因此獲取廉租房/公租房的較多。值得留意的是，低收入家庭購買經(jīng)濟(jì)適用房/限價(jià)房的比例極低，即使房?jī)r(jià)比市場(chǎng)價(jià)更低，但是并沒有因房?jī)r(jià)的降低而縮小低收入家庭自身資本與房?jī)r(jià)之間的差距。

在L929 細(xì)胞增殖第1、3、5 天，與對(duì)照組相比，5、10、15、20、25、30、35、40 mmol/L D-Met 組細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＞0.05）；45 mmol/L D-Met組吸光度值低于對(duì)照組（第1 天：

＝0.046，第3 天：

＜0.001，第5 天：

＜0.001）（圖1a）。各組牙齦卟啉單胞菌生長曲線在28～36 h 時(shí)達(dá)到峰值，與對(duì)照組相比，當(dāng)D-Met ≥35 mmol/L 時(shí)，L929 細(xì)胞的生長曲線平緩，無明顯對(duì)數(shù)期，即35 mmol/L D-Met 為MIC（圖1b）；在40 mmol/L D-Met 組，瓊脂板上無菌落生長，即40 mmol/L D-Met 為MBC（圖1c）。

孕婦去戶外運(yùn)動(dòng)，陽光中的紫外線為身體制造出了活化的維生素D3，它可以促進(jìn)體內(nèi)鈣、磷的吸收和利用。既有利于寶寶骨骼的發(fā)育，又可防止孕媽媽發(fā)生骨質(zhì)疏松。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，采用方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)各組間差異，以

＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用Graphpad Prism7 繪制曲線。

2 結(jié) 果

2.1 D-Met 對(duì)L929 細(xì)胞增殖及牙齦卟啉單胞菌細(xì)菌活性的影響

1.2.5 牙齦卟啉單胞菌細(xì)胞膜完整性的變化 生物膜形成抑制及成熟生物膜裂解的實(shí)驗(yàn)過程同上，分組為對(duì)照組和35 mmol/L D-Met 組。收集生物膜后置于離心機(jī)中，4 000 rpm 離心10 min（4 ℃）。2.5%戊二醛固定1 h，1%四氧化鋨固定1 h，PBS 洗滌4 次，乙醇梯度和丙酮脫水，樹脂包裹后行切片，3%醋酸鈾和檸檬酸鉛對(duì)切片進(jìn)行雙染色。采用透射電鏡觀察生物膜中細(xì)胞膜完整性的變化。

2.2 D-Met 對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜生物量及胞外多糖的影響

在生物膜形成抑制實(shí)驗(yàn)及成熟生物膜裂解實(shí)驗(yàn)中，D-Met ≥20 mmol/L 時(shí)，生物膜生物量低于對(duì)照組（圖2a-2b）；圖2c 為標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線；D-Met ≥20 mmol/L 時(shí)同樣能抑制生物膜形成時(shí)胞外多糖的產(chǎn)生（圖2d），以及促進(jìn)成熟生物膜中胞外多糖的消散，呈濃度依賴性（圖2e）。

2.3 D-Met 對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜形態(tài)的影響

紅色復(fù)合體是一群與牙周病顯著相關(guān)的病原體，包括牙齦卟啉單胞菌、齒垢密螺旋體和福賽類桿菌

。它們與宿主組織接觸，介導(dǎo)大量炎性趨化因子、細(xì)胞因子釋放，導(dǎo)致牙周/種植體周圍結(jié)構(gòu)破壞

。由于細(xì)菌多數(shù)以生物膜的形式存在，細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)細(xì)菌的包裹作用以及細(xì)菌間的群體感應(yīng)效應(yīng)導(dǎo)致傳統(tǒng)的抗菌藥物往往無法有效對(duì)抗感染部位的生物膜

。

2.4 D-Met 對(duì)牙齦卟啉單胞菌細(xì)胞膜完整性的影響

對(duì)照組中細(xì)胞的形狀規(guī)則，細(xì)胞壁完整，細(xì)胞中染色顆粒稀少；相反，在生物膜形成抑制實(shí)驗(yàn)中，35 mmol/L D-Met 使細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞中的內(nèi)容物通過細(xì)胞膜上的裂孔溢出；而在成熟生物膜裂解實(shí)驗(yàn)中，35 mmol/L D-Met 組中細(xì)胞內(nèi)容物深染，大量細(xì)胞內(nèi)染色顆粒表明膜通透性增加，大量染色劑滲入細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)中，見圖4。

1.2.6 D-Met 對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜內(nèi)c-di-GMP的影響 生物膜形成抑制及成熟生物膜裂解的實(shí)驗(yàn)過程同上，分組同1.2.4。c-di-GMP 的提?。撼暽锬づ囵B(yǎng)物10 s，獲得混懸液，測(cè)定吸光度（OD

），離心（16 000 g，2 min，4 ℃），棄上清液。PBS 洗滌沉淀（16 000 g，2 min，4 ℃），棄上清液。沉淀物加入PBS，100 ℃下水浴5 min。加入冰乙醇使最終乙醇濃度為65%，萃取15 s。離心樣本（16 000 g，2 min，4 ℃），保留上清液。使用剩余沉淀重復(fù)上述步驟2 次，混合上清液。使用真空濃縮蒸發(fā)器干燥上清液，獲得含有c-di-GMP 的粉末狀樣品。c-di-GMP的檢測(cè)：將c-di-GMP樣品溶解于1 mL無菌蒸餾水，使用Waters 1525 高效液相色譜儀檢測(cè)及分析c-di-GMP 的含量，使用商品化c-di-GMP繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 D-Met 對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜內(nèi)c-di-GMP的影響

圖5a為c-di-GMP的標(biāo)準(zhǔn)曲線；在生物膜形成抑制實(shí)驗(yàn)及成熟生物膜裂解實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，D-Met ≥20 mmol/L 時(shí)可明顯降低生物膜內(nèi)c-di-GMP的含量（

＜0.05），且呈濃度依賴性，見圖5b-e。

3 討 論

在生物膜形成抑制實(shí)驗(yàn)中，掃描電鏡下可見，對(duì)照組的生物膜致密且多層，細(xì)胞外基質(zhì)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。20、25、30 mmol/L 組中的細(xì)菌密度減低，細(xì)菌通過稀疏的細(xì)胞外基質(zhì)連接，35 mmol/L 組生物膜完整性徹底消失，細(xì)胞膜出現(xiàn)破裂（圖3a）。在成熟生物膜裂解實(shí)驗(yàn)中，生物膜的密度隨著DMet 濃度的增加呈下降趨勢(shì)；尤其是35 mmol/L 組細(xì)胞外基質(zhì)完全缺失，細(xì)胞表面變得更光滑，沒有可見的細(xì)胞外附屬器（圖3b）。

積雪在短時(shí)間內(nèi)不同時(shí)相高分四號(hào)衛(wèi)星近紅外圖像上均表現(xiàn)為穩(wěn)定的強(qiáng)反射特征，而同一區(qū)域不同時(shí)相的云層受到成分、厚度、高度等因素影響，其反射值會(huì)出現(xiàn)波動(dòng).因此，在基于多時(shí)相全色圖像得到的雪蓋范圍內(nèi)，針對(duì)高分四號(hào)衛(wèi)星近紅外波段圖像，進(jìn)行多時(shí)相近紅外圖像的最小值合成.結(jié)合積雪在近紅外波段的高反射特征，通過二值化分割，取亮度值不小于0.9倍動(dòng)態(tài)范圍值的像元為雪.由于這是在全色圖像上提取積雪范圍的基礎(chǔ)上進(jìn)行的再處理，因此，采用基于動(dòng)態(tài)范圍的相對(duì)閾值作為門限值，就可進(jìn)一步消除變化云層因素的影響，計(jì)算方法如下：

作為細(xì)菌內(nèi)源性的固有成分，D-氨基酸在對(duì)抗微生物生物膜方面與傳統(tǒng)藥物有本質(zhì)的區(qū)別。D-氨基酸可由細(xì)菌自身產(chǎn)生，主動(dòng)觸發(fā)生物膜的分散，而分散的游離菌可定植到新的部位再次形成生物膜，以實(shí)現(xiàn)適應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)耗盡的不利環(huán)境

。因此，D-氨基酸不僅是細(xì)菌自身適應(yīng)微環(huán)境改變的一種生存策略，也為生物膜的清除提供了一種新的思路?；魜y弧菌能夠分泌大量的D-精氨酸，以調(diào)整生物膜及細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性

。Tong 等

研究發(fā)現(xiàn)，外源性加入40 mmol/L 的D/L-半胱氨酸、天冬氨酸或谷氨酸均可顯著抑制變異鏈球菌生物膜的形成。本實(shí)驗(yàn)中，D-Met 濃度高于20 mmol/L 顯著抑制了牙齦卟啉單胞菌生物膜的形成并有效分散了成熟的生物膜，且最為顯著的是，35 mmol/L D-Met 完全消除了細(xì)胞膜外附屬器的產(chǎn)生，提示D-Met 可能通過特定機(jī)制影響了牙齦卟啉單胞菌的合成代謝。另外，D-Met 的濃度高于20 mmol/L 顯著降低了生物膜中EPS 的生物量。D-酪氨酸在低濃度時(shí)可促進(jìn)銅綠卟啉單胞菌EPS 的產(chǎn)生，而在高濃度時(shí)則導(dǎo)致EPS 的減少

，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。因此，EPS 可能同樣受到D-Met 參與調(diào)控合成代謝的影響。

c-di-GMP 作為第二信使，普遍存在于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌中，是細(xì)菌生物代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，包括多糖及蛋白的生物合成、細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性和毒力等

。高濃度的c-di-GMP 可以促進(jìn)生物膜的形成，而低濃度的c-di-GMP 可以抑制生物膜的形成

。在費(fèi)氏弧菌中，Ca

可激活二胍基酸環(huán)化酶，從而促進(jìn)合成c-di-GMP，導(dǎo)致細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性降低而纖維素的合成增加

。c-di-GMP G-四聯(lián)體誘導(dǎo)劑可誘導(dǎo)c-di-GMP 形成四聯(lián)體，從而干擾了cdi-GMP 正常的生物功能，包括細(xì)菌運(yùn)動(dòng)和胞外多糖的分泌，導(dǎo)致生物膜形成受阻

。與之相似，本實(shí)驗(yàn)中D-Met 濃度高于20 mmol/L 顯著降低了牙齦卟啉單胞菌c-di-GMP 的水平，尤其在35 mmol/L時(shí)，c-di-GMP 的表達(dá)水平下降至最低。綜上，牙齦卟啉單胞菌生物膜生物量、EPS 產(chǎn)生、生物膜形態(tài)、細(xì)胞膜完整性均與c-di-GMP 的變化趨勢(shì)協(xié)同一致，基于此，筆者推測(cè)D-Met 可能通過降低c-di-GMP 水平抑制和分散牙齦卟啉單胞菌生物膜。

本研究通過生物膜及胞外多糖的生物量、生物膜及細(xì)胞膜的微觀形態(tài)以及c-di-GMP 的蛋白水平首次揭示了D-Met 可能通過作用于c-di-GMP 從而抑制和分散牙齦卟啉單胞菌生物膜的機(jī)理。但是c-di-GMP 表達(dá)受抑制的分子機(jī)制以及其上游/下游信號(hào)通路仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

魚腥草中的揮發(fā)油成分能對(duì)動(dòng)物細(xì)胞中白細(xì)胞的吞噬作用進(jìn)行強(qiáng)化，提升動(dòng)物血清解毒的作用，進(jìn)而增強(qiáng)動(dòng)物的免疫力，這在動(dòng)物肺炎、動(dòng)物器官性疾病防治中的應(yīng)用較多，效果也比較顯著。

Xie LL and Zhang HY performed the experiments and wrote the article. Wang ZX， Li BR and Li Z performed the experiments. Meng WY designed the study and revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

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