王 洋 ，王立超 ，喻愛林 ，金明霞 ，劉曉華

（1.江西省林業(yè)科學院，江西 南昌 330013；2.南京林業(yè)大學林學院，江蘇 南京 210037）

松材線蟲病（Pine wilt disease）是由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）引起的一種毀滅性的森林病害，是當前世界上最具危險性和傳染性的森林病害[1]。由于該病具有易傳播、難防治、患病松樹死亡快等特點，而被世界多國列為重要的檢疫性病害。目前，該病害已侵入我國多個風景名勝區(qū)、重要生態(tài)功能區(qū)、以及東北地區(qū)。已經(jīng)對我國部分地區(qū)自然景觀、生態(tài)環(huán)境及松林資源造成嚴重破壞，給林業(yè)產(chǎn)業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，并對我國大面積林區(qū)及松林景觀生態(tài)區(qū)域構(gòu)成嚴重威脅。

松材線蟲的傳播需要借助媒介昆蟲進行。松墨天牛（Monochamus alternatus）在東亞地區(qū)是最主要的松材線蟲媒介昆蟲[2-4]。松墨天牛成蟲羽化后尋找健康松樹進行取食補充營養(yǎng)，并在松樹表皮造成傷口，其攜帶的擴散型松材線蟲脫離后通過傷口進入樹體，并脫皮轉(zhuǎn)化為繁殖型成蟲進而快速繁殖對松樹造成危害[5,6]。

松墨天牛羽化后其攜帶的松材線蟲并不能立即開始傳播，而是需要經(jīng)歷一段時間后才開始脫離。Enda等認為4齡擴散型松材線蟲幼蟲在媒介天牛羽化后的第10天開始脫離[7]，Hosoda等認為在媒介天牛羽化后的3～5天后松材線蟲開始脫離[8]，Aikawa等認為在媒介天牛羽化后的第7天其攜帶的松材線蟲開始脫離[9]，Jikunaru等認為在媒介天牛羽化后的第5天松材線蟲開始脫離[10]，Wang等認為松材線蟲起始脫離媒介天牛的時間主要集中在其羽化后的7～12天[11]。雖然各研究結(jié)果不盡相同，但是都普遍認為媒介天牛羽化需經(jīng)歷一段時間后松材線蟲才開始從媒介體內(nèi)脫離。

針對何種原因觸發(fā)導致了松材線蟲從媒介昆蟲的脫離，目前，雖有多種說法但是沒有統(tǒng)一的定論。Stamps等認為擴散型松材線蟲體內(nèi)中性脂肪的降解跟松材線蟲的脫離有密切關(guān)系，發(fā)現(xiàn)媒介天牛羽化后隨著時間的延長，其體內(nèi)攜帶的松材線蟲體內(nèi)的脂肪含量逐漸低，并認為松材線蟲自身內(nèi)在原因?qū)е铝怂刹木€蟲的脫離[12]。Ishkawa等在瓊脂平板上測試萜烯類物質(zhì) （松樹揮發(fā)物）對擴散型松材線蟲的吸引，發(fā)現(xiàn)β-月桂烯 （βmyrcene）對離體的擴散型松材線蟲具有很強的吸引力，認為松樹揮發(fā)物的誘引是導致松材線蟲脫離的原因[13]。Aikawa等用健康松樹枝條和經(jīng)過蒸煮后消除松樹揮發(fā)物質(zhì)的枝條分別喂養(yǎng)松墨天牛，結(jié)果認為松材線蟲的脫離是自發(fā)性行為，松樹揮發(fā)物反而在一定程度上抑制了線蟲的脫離[14]，認為松材線蟲的脫離可能是內(nèi)源性因素造成的[12,14]。Wu等認為松墨天牛羽化后其呼吸作用會逐漸增強，同時其產(chǎn)生二氧化碳的速率也加快，當其氣管內(nèi)的CO2濃度升高達到一定臨界值時，因松材線蟲對CO2的趨避性最終導致線蟲的脫離[15]。

松墨天牛成蟲取食行為是其生命周期中重要的環(huán)節(jié)，也是松材線蟲傳播的關(guān)鍵階段，松材線蟲可通過天牛取食造成的傷口進入健康樹體內(nèi)完成傳播[16,17]。但是，媒介天牛取食行為是否是觸發(fā)導致松材線蟲脫離的原因尚不明確。為了進一步研究媒介天牛攜帶的松材線蟲的脫離原因，本研究中我們分析了媒介天牛（松墨天牛）取食行為對松材線蟲脫離的影響，以及取食量與松材線蟲傳播比率的相關(guān)性，并分析了松樹揮發(fā)物對松材線蟲傳播的影響。

1 材料方法

1.1 松墨天牛幼蟲獲取與喂養(yǎng)

試驗用枯死馬尾松（Pinus massoniana）疫木，于2022年1月份收集于江西省梅嶺國家級風景名勝區(qū)，木段需被松墨天牛幼蟲侵染。將木段劈開，取出其中的松墨天牛幼蟲共130頭，并用人工飼料進行喂養(yǎng)，如圖1所示。于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至5齡幼蟲，每隔10天更換1次飼料。

（1）飼料配方：蔗糖：25 g，酵母粉：15.625 g，瓊脂：50 g，苯甲酸鈉：2.5 g，山梨酸：1.25 g，0.5mol/LH2SO4：12.5mL，松樹木屑：125 g，麥胚粉/大豆粉：25 g，膽固醇：1.875 g，抗壞血酸：5 g，干酪素（酪蛋白）：25 g，氯化膽堿：1.25 g，H2O：1000mL。

（2）飼料配制：松樹木屑過孔徑為1.0mm篩，于60℃干燥箱烘干。取不銹鋼鍋，加入1000mL雙蒸水煮至沸騰后加入50 g瓊脂，待瓊脂完全融化后加入除松樹木屑和H2SO4以外的所有組分，充分煮沸后，用H2SO4滴定調(diào)節(jié)飼料的pH，再加入木屑，充分攪拌；并分裝到圖1小杯中（40mL），于105℃滅菌15min，冷卻后保存于4℃冰箱。

圖1 松墨天牛幼蟲喂養(yǎng)Figure 1 Feeding of beetle larvae

1.2 攜帶松材線蟲天牛培育

本試驗所用松材線蟲AMA3蟲株由南京林業(yè)大學森林保護系森林病理實驗室提供。

采集新鮮馬尾松木段直徑約5 cm，將木段截為10 cm長小木段，并接種松材線蟲10000條，于25℃條件下?lián)嵊?個月。用鉆頭打1 cm×5 cm圓洞，將5齡松墨天牛幼蟲（挑選健康個體120頭）接種于圓洞中，用錫箔紙封口，并于25℃培養(yǎng)；如圖2所示；直至松墨天牛成蟲羽化。

圖2 攜帶線蟲天牛培養(yǎng)Figure 2 Culture of beetles carrying pine wood nematode

1.3 松墨天牛飼喂與松材線蟲傳播

及時收集新羽化的松墨天牛（每2～4 h觀察羽化情況，正常羽化并用于試驗個體共91頭），將天牛分為兩組，一組立即用健康新鮮馬尾松枝條進行喂養(yǎng)，另一組饑餓處理4天后再進行喂養(yǎng)，喂養(yǎng)方法如圖3所示,并每日更換新鮮枝條。

圖3 天牛成蟲喂養(yǎng)Figure 3 Feeding of adult beetles

天牛取食量：本研究以取食面積測算松墨天牛取食量，將天牛取食過的枝條留下的刻痕用刻度尺測量進行估算。天牛取食枝條如圖4-A所示。

天牛傳播線蟲數(shù)量：將每日更換下的枝條剪碎（以及養(yǎng)蟲瓶中碎屑）如圖4-B，用貝爾曼漏斗法[18]進行分離，12小時后收集分離液并于顯微鏡下計數(shù)松材線蟲數(shù)量：為單日松墨天牛傳播線蟲數(shù)量。首次分離到松材線蟲的日期為天牛起始傳播松材線蟲的日期。松墨天牛死亡后用上述方法分離其體內(nèi)殘余松材線蟲。松材線蟲傳播率=傳播線蟲總量/（傳播總量+殘余量）。

圖4 天牛取食枝條處理Figure 4 Treatment of branches fed by beetles

1.4 數(shù)據(jù)分析

Spass 19.0用于數(shù)據(jù)分析。分析不同飼喂方法松材線蟲起始脫離松墨天牛時間的差異性，以及松墨天牛取食量與傳播線蟲比率的相關(guān)性。

2 結(jié)果分析

2.1 不同飼喂處理對線蟲脫離影響

松材線蟲起始脫離松墨天牛的時間情況如圖5所示。羽化后立即喂養(yǎng)的松墨天牛共55頭，平均起始傳播線蟲時間為8.16天；經(jīng)饑餓處理后喂養(yǎng)的天牛共36頭，平均起始傳播線蟲時間為7.76天。對兩種飼喂處理下天牛起始傳播線蟲時間進行差異性分析P=0.2，表明羽化后立即喂養(yǎng)和饑餓處理后再進行喂養(yǎng)的天牛，其攜帶的松材線蟲起始脫離的日期無明顯差異；表明取食與否對松材線蟲的脫離沒有直接影響。

圖5 松材線蟲起始脫離天牛時間Figure 5 The start time of PWN departure from beetle

2.2 天牛取食量與傳播線蟲比率

本研究中，松墨天牛取食量與其傳播松材線蟲情況如表1所示。本研究中共有20頭天牛正常死亡，可用于分析取食與傳播線蟲關(guān)聯(lián)性。松材線蟲傳播平均比率為25.71。松墨天牛傳播線蟲期間平均取食量為8655.98mm2。對天牛取食量和松材線蟲傳播比率進行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r=-0.19。表明媒介昆蟲松墨天牛取食量大小與松材線蟲傳播比率呈現(xiàn)較弱的負相關(guān)性。

表1 天牛取食量與松材線蟲傳播Table 1 The feeding quantity of beetle and the transmission of pine wood nematode

3 討論

媒介昆蟲羽化后，松材線蟲隨媒介昆蟲進行傳播，取食階段是媒介昆蟲生命周期中重要的環(huán)節(jié)，也是松材線蟲傳播的關(guān)鍵階段，松材線蟲可通過天牛取食造成的傷口進入健康樹體內(nèi)完成傳播[16,17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)饑餓處理的媒介天牛與正常喂養(yǎng)的天牛其松材線蟲起始傳播的時間無明顯差異，表明松材線蟲的脫離不是由媒介昆蟲的取食行為觸發(fā)的。同時饑餓處理的天牛未接受到松樹揮發(fā)物的刺激，其攜帶的松材線蟲也未接收到揮發(fā)物質(zhì)的刺激，可以判斷松樹揮發(fā)物質(zhì)也不是觸發(fā)松材線蟲脫離媒介昆蟲的原因。Ishkawa在瓊脂平板上測松樹揮發(fā)物對擴散型松材線蟲的吸引， 發(fā)現(xiàn) β-月桂烯 （βmyrcene）對擴散型松材線蟲具有很強的吸引力[13]，而Aikawa等用正常枝條和經(jīng)過蒸煮后消除松樹揮發(fā)物質(zhì)的枝條分別喂養(yǎng)松墨天牛，結(jié)果認為松材線蟲的脫離是自發(fā)性行為，松樹揮發(fā)物反而在一定程度上抑制了線蟲的脫離[14]，這可能表明松樹揮發(fā)物僅對松材線蟲脫離后的移動起到信號指引作用。

對媒介昆蟲的不同飼喂處理，會導致媒介昆蟲代謝發(fā)生差異，但這種差異并未導致傳播線蟲起始發(fā)生明顯差異，表明媒介天牛羽化后代謝的變化也不是導致松材線蟲脫離的觸發(fā)機制。

本研究中媒介天牛取食量與松材線蟲傳播比率呈現(xiàn)弱的相關(guān)性，表明松材線蟲傳播數(shù)量的多少并非由媒介昆蟲取食所決定。Wang等研究認為松材線蟲的傳播具有明顯的規(guī)律性，而媒介天牛的取食量保持相對恒定[11]；也表明松材線蟲的傳播與媒介天牛的取食關(guān)聯(lián)性不大；媒介天牛取食行為僅為松材線蟲傳播的一個重要途徑，而非原因。

Stamps等認為松材線蟲體內(nèi)中性脂肪的降解跟其脫離媒介昆蟲有密切關(guān)系，發(fā)現(xiàn)媒介天牛羽化后隨著時間的延長，其攜帶的松材線蟲體內(nèi)的脂肪含量越來越低，認為松材線蟲自身內(nèi)在原因?qū)е铝怂刹木€蟲的脫離[12]，Aikawa等認為松樹揮發(fā)物不是松材線蟲脫離的原因，其脫離可能是內(nèi)源性因素造成的[12,14]。同時研究認為松材線蟲脫離媒介昆蟲需要消耗能量克服天牛氣管的阻力[19]，而能量產(chǎn)生需要消耗氧氣；天牛羽化后其呼吸作用逐漸增強[15]，這可能導致天牛氣管中的線蟲接受到充足氧氣，降解其體內(nèi)中性脂肪產(chǎn)生能量。

松材線蟲脫離媒介原因推測：媒介天牛羽化后兩個重要的行為是取食和呼吸。取食行為不是導致線蟲脫離的原因，呼吸行為的增強可導致線蟲產(chǎn)生充足的能量觸發(fā)其具有脫離的能力；天牛氣管中氧氣濃度變化差異對其移動方向起信號指引作用，媒介天牛取食行為僅是其傳播的途徑。