李志芳， 張 裕， 王 穎,2,3， 佐兆杭， 孫 維， 張乃丹， 周欣雨

(黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院1，大慶 163319) (國家雜糧工程技術研究中心2，大慶 163319) (黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室3，大慶 163319)

蕓豆，又名四季豆，在我國種植廣泛，已成為栽培面積僅次于黃豆的食用豆類農(nóng)作物[1]，富含蛋白質(zhì)、B族維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，同時含有多種人體必需氨基酸，且氨基酸比例較為均衡，是一種比較難得的高鉀、高鎂、低鈉食品[2]。蕓豆含有多種活性物質(zhì)，研究表明，蕓豆α-淀粉酶抑制劑可有效改善鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠高脂血癥、胰島素抵抗及抗氧化防御系統(tǒng)，降低機體氧化應激及血糖靈敏度[3，4]；蕓豆蛋白酶解成多肽后，不僅能夠提高營養(yǎng)價值，而且方便吸收，還具有抗氧化、降血壓、抗菌等多種功能活性[5]。

大豆，通稱黃豆，含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白、不飽和脂肪酸、鈣及B族維生素，其高含量的蛋白質(zhì)能夠提供潛在活性肽，可抑制與機體氧化應激相關的疾病，如冠心病、動脈粥樣硬化、糖尿病等[6]。大豆中的酚類化合物具有優(yōu)異的還原性能，能夠通過清除ROS來抑制脂質(zhì)過氧化而有效清除自由基，可作為抗氧化劑保護細胞[7，8]。發(fā)酵豆制品經(jīng)過微生物及其分泌的酶系作用后，把不溶性高分子物質(zhì)分解成可溶性低分子物質(zhì)，保留了大豆異黃酮和低聚糖等原有功能性物質(zhì)[9，10]，對于維持人類身體健康具有重要的營養(yǎng)價值。

蕓豆和大豆本身含有許多活性物質(zhì)，它們存在于各自的植物細胞中，其外層是由纖維素組成的細胞壁，機械方法能夠幫助破壞植物細胞，但是對于溶出或釋放活性物質(zhì)的效率不高，通過微生物的生化作用能有效解決這個問題。微生物通過發(fā)酵，能夠分泌多種酶并對植物細胞進行分解，從而有效地促進活性物質(zhì)的釋放[11]。同時，發(fā)酵原料經(jīng)過多種微生物共同發(fā)酵后，會使發(fā)酵液富含多種酶類，包括超氧化物歧化酶、蛋白酶、脂肪酶等功效酶[12，13]，保護機體不受自由基損害的同時提高功能性化合物的活性[14]。目前開發(fā)的發(fā)酵豆類產(chǎn)品多以單一原料為主，復合發(fā)酵的研究相對較少，因此本研究選用蕓豆、大豆為復合發(fā)酵原料，探究其最佳發(fā)酵條件及抗氧化活性，旨在為開發(fā)新型復合發(fā)酵產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫花蕓豆、大豆；活性干酵母、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)；耐高溫α-淀粉酶(20 000 U/mL)、糖化酶(10 000 U/mL)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、羥自由基檢測試盒。

1.2 儀器與設備

JYL-Y912料理機；S220 pH計；H1850R冷凍離心機；BCV-6S1超凈工作臺；DRP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱；V-5100B可見分光光度計；YXQ-30SII立式壓力蒸汽滅菌器。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點

菌種的活化與培養(yǎng)：乳酸菌活化時取10%液態(tài)保藏的植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌菌液于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，菌液待用。酵母菌活化時活性干酵母于10倍體積蒸餾水中溶解，30～35 ℃恒溫水浴鍋中活化30 min，待用。

清汁的發(fā)酵：紫花蕓豆、大豆清洗后去皮，按1∶3料水質(zhì)量體積比打漿。雙酶法進行水解，液化條件為α-淀粉酶添加量200 μL/100 mL、pH=6.0、酶解溫度97 ℃、時間20 min；糖化條件為加酶量200 μL/100 mL、pH 4.5、溫度60 ℃、時間30 min。酶解液于高速離心機中以1.0×104r/min離心15 min得清汁。調(diào)清汁pH 5.0、裝瓶量30 mL、糖添加量8%后滅菌。冷卻后接種0.2%酵母菌，32 ℃恒溫振蕩24 h進行預發(fā)酵，按1∶1(共同發(fā)酵)比例接種植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌恒溫發(fā)酵24 h。4 ℃后發(fā)酵并保藏備用。

1.3.3 單因素實驗設計

清汁初始pH 5.0，添加8%白砂糖后滅菌，接種3%復配乳酸菌，32 ℃發(fā)酵24 h(發(fā)酵時間由前期實驗優(yōu)化確定)，測定發(fā)酵液SOD活力。固定其他條件，分別考察糖添加量、初始pH、接種量、發(fā)酵溫度對SOD活力的影響，使用超氧化物歧化酶(SOD)測試盒測定。

1.3.4 響應面實驗設計

利用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken模型，以糖添加量、初始pH、接種量、發(fā)酵溫度4個單因素為自變量，以發(fā)酵液SOD活力為響應值，優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)。

1.3.5 抗氧化實驗

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測定

取2 mL樣品溶液與2 mL 0.02 mg/mL DPPH-乙醇溶液混勻，室溫下暗反應30 min，空白組以無水乙醇代替試樣，517 nm處測定樣品吸光度值。

DPPH清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為用無水乙醇代替DPPH時測得對應濃度的吸光度；A0為空白組的吸光度。

1.3.5.2 羥自由基清除能力測定

使用羥自由基測試試劑盒測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果分析

由圖1所示，SOD活力隨糖添加量增加而升高，在糖添加量為6%時出現(xiàn)峰值，隨后有所下降，推測糖類作為菌種發(fā)酵最重要的碳源物質(zhì)，在一定范圍內(nèi)糖濃度增大可能誘導細胞對胞內(nèi)主要代謝途徑的酶活力水平有所提升[15]，但是糖濃度過高會使發(fā)酵液滲透壓增高，造成細胞壁特性發(fā)生改變，使菌種生長周期停滯甚至凋亡[16]，影響發(fā)酵的正常進行。因此本實驗條件下確定最適糖添加量為6%。

由圖1所示，SOD活力隨初始pH的增大呈先上升后下降的趨勢，初始pH為4時達到峰值，原因可是SOD化學本質(zhì)為蛋白質(zhì)，其分子內(nèi)部規(guī)律性結(jié)構易受pH、溫度等物理或化學因素影響，導致氫鍵斷裂進而使空間結(jié)構遭到破壞[17]，使酶活性降低。

接種量的高低會影響發(fā)酵初期乳酸菌的生長速度，由圖可知，SOD活力隨接種量的增大而增大，但當接種量大于4%時，SOD活力呈下降趨勢，分析原因可能是當乳酸菌超過適宜接種量時，會縮短延滯期并很快到達對數(shù)生長期，體系的營養(yǎng)物質(zhì)在此階段易被迅速消耗掉[18]，不利于后期發(fā)酵的持續(xù)性進行，而接種量過低易污染雜菌不利于菌種生長增殖[19]，因此選用4%為最佳接種量以保證發(fā)酵過程的正常進行。

發(fā)酵溫度會影響微生物的生長代謝，進而影響發(fā)酵液中抗氧化物質(zhì)含量和活性[20]。由圖1所示，SOD活力隨著發(fā)酵溫度的升高逐漸增大，說明發(fā)酵溫度的升高有利于增強微生物的活性，可促進維生素C、酚類等抗氧化物質(zhì)的溶出或產(chǎn)生[21]，使體系抗氧化物質(zhì)含量增加而增強SOD活力，但是溫度過高就會抑制微生物中酶的活性，同時縮短發(fā)酵周期，影響微生物的正常生長代謝，從而使產(chǎn)生的SOD及各產(chǎn)物量變低。因此本實驗條件下選用32 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖1 單因素實驗結(jié)果

2.2 響應面實驗結(jié)果分析

2.2.1 響應面實驗因素與水平設計

響應面實驗因素與水平設計表見表1。

表1 響應面實驗因素與水平

2.2.2 響應面結(jié)果及分析

響應面設計各因素水平的復合發(fā)酵液SOD活力見表2。對表2實驗結(jié)果進行回歸擬合，所得回歸方程為：Y=270.03+2.44A-2.20B+4.43C+0.64D-2.10AB-4.23AC+2.72AD+6.16BC-5.05BD-1.92CD-23.06A2-18.79B2-18.64C2-11.43D2。

表2 響應面實驗設計與結(jié)果

表3 回歸方程方差分析及結(jié)果

2.2.3 交互作用分析

通過三維響應面和二維等高線圖分析可得，隨著糖添加量、初始pH、接種量和發(fā)酵溫度的增大，發(fā)酵液SOD活力隨之增大，但當4個因素增加到一定程度時，SOD活力呈下降趨勢，其中初始pH與接種量、發(fā)酵溫度兩因素交互作用等高線圖密集成橢圓形，說明兩因素交互作用顯著，由響應面圖對比可知，接種量和糖添加量曲面彎曲程度較大，表明其對發(fā)酵液SOD活力影響顯著，與方差分析結(jié)果相一致。經(jīng)Design Expert 8.0.6優(yōu)化復合發(fā)酵液工藝參數(shù)得：糖添加量6.10%，初始pH 3.98，接種量4.10%，發(fā)酵溫度32.07 ℃，此條件下發(fā)酵液SOD活力預測值可達270.383 U/mL。考慮到實踐操作可行性，調(diào)整工藝參數(shù)為糖添加量6%、初始pH 4.0、接種量4%、發(fā)酵溫度32 ℃，重復3次實驗得復合發(fā)酵液SOD活力為268.46 U/mL(誤差0.61%)，與理論值基本吻合，證明優(yōu)化的工藝參數(shù)具有準確性。

2.3 不同發(fā)酵階段復合發(fā)酵液抗氧化活性分析

2.3.1 發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率變化

DPPH是一個以氮原子為中心的穩(wěn)定脂溶性自由基，是體外檢測物質(zhì)抗氧化效果最常用的一種方法，可在短時間內(nèi)較穩(wěn)定評價物質(zhì)抗氧化活性[22]。如圖2所示，整個發(fā)酵過程中，發(fā)酵液對DPPH自由基清除率呈先迅速上升后趨于平緩的趨勢。發(fā)酵24 h時，DPPH自由基清除率迅速增長約2倍，隨后以小幅趨勢繼續(xù)增長，說明在適當發(fā)酵時間內(nèi)，發(fā)酵液DPPH自由基清除能力會隨發(fā)酵時間的延長而有所提高，至發(fā)酵結(jié)束可達90.72%，分析原因可能與發(fā)酵過程釋放的酚類、黃酮物質(zhì)有關，同時發(fā)酵過程中產(chǎn)生如超氧化物歧化酶等抗氧化酶，它們共同作用可提高DPPH自由基清除率。

圖2 發(fā)酵過程中DPPH、羥自由基清除能力的變化

2.3.2 發(fā)酵過程中羥基自由基清除能力變化

羥自由基是一種重要的活性氧，是人體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基，它可以使組織中的糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)發(fā)生氧化，遭受氧化性損傷和破壞，導致細胞壞死或突變[23]。如圖2所示，羥基自由基的清除能力隨發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)持續(xù)增長的趨勢，發(fā)酵結(jié)束時清除能力增長至606.26 U/mL，約為發(fā)酵初始值的2倍。羥基自由基清除能力的提高可能是由于發(fā)酵液中有機酸、大豆多酚等包含有自由羥基的酚類物質(zhì)，能提供活潑的氫終止自由基連鎖反應。同時，發(fā)酵能夠?qū)⒋蠓肿拥鞍追纸鉃槟┒税被釟埢哂锌寡趸钚缘男》肿佣嚯腫24]，增強體系抗氧化能力。

3 結(jié)論

通過對蕓豆/大豆復合發(fā)酵液工藝參數(shù)優(yōu)化及功能性分析，結(jié)果表明：復合發(fā)酵液最優(yōu)工藝條件為糖添加量6%、初始pH 4.0、接種量4%、發(fā)酵溫度32 ℃，此條件下發(fā)酵液SOD活力為268.46 U/mL。復合發(fā)酵液DPPH自由基清除率及羥自由基清除率能力顯著增長，至發(fā)酵結(jié)束其清除能力分別為90.72%和606.26 U/mL，證明經(jīng)工藝優(yōu)化后的發(fā)酵液具有良好的抗氧化活性。