汪浩洋 毛正發(fā) 鄒元章 盧俅董迪 姚勤 陳兵海

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，鎮(zhèn)江 212001）

近年腎癌發(fā)病率逐年遞增，且腎癌發(fā)病率與年齡增長密切相關(guān)［1］。2018年全球腎癌病死人數(shù)超過175 000例［2］。腎透明細胞癌（clear cell carcinoma of kidney，ccRCC）占 成 人 腎 細 胞 癌70%以 上［3］。ccRCC對放化療均不敏感，手術(shù)治療是其主要治療方式，但ccRCC缺乏早期臨床特征，導(dǎo)致部分患者就診時已失去根治性手術(shù)的機會［4］。即使切除腫瘤，仍有20%~30%患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移［5］。

分子靶向藥物的出現(xiàn)給腫瘤治療提供了新的視角［6］。舒尼替尼是一種血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）靶向抑制劑，可通過抑制血管生成而抑制腫瘤細胞生長，明顯改善晚期腎癌患者預(yù)后［7-8］。但長期使用舒尼替尼會誘導(dǎo)腫瘤耐藥，加上部分患者先天性耐藥，限制了該藥物的應(yīng)用［9］。腫瘤旁路信號激活可導(dǎo)致舒尼替尼耐藥，但耐藥機制尚不明確［10］。因此，揭示舒尼替尼耐藥的潛在機制并逆轉(zhuǎn)耐藥性迫在眉睫。

隨著基因測序技術(shù)發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了數(shù)以萬計的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。研究顯示，lncRNA在調(diào)控細胞功能、疾病和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［11-12］。但lncRNA影響舒尼替尼耐藥的分子機制鮮有報道。

KUCG1是新近發(fā)現(xiàn)的lncRNA，又名LINC00850，最初由TRAN等［13］在杜氏肌營養(yǎng)不良患者中發(fā)現(xiàn)，KUCG1下調(diào)可能與精神發(fā)育遲滯相關(guān)。但目前尚無相關(guān)文獻闡釋KUCG1的具體功能。而KUCG1表達、臨床意義和對舒尼替尼耐藥性的影響尚無相關(guān)研究。本研究通過體外試驗研究KUCG1對ccRCC細胞增殖、侵襲及凋亡的影響，研究KUCG1對ccRCC細胞舒尼替尼耐藥性的作用，并探討其可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料769-P和786-O腎癌細胞株購自ATCC；293-T細胞株購自漢恒生物科技有限公司（上海）；RNA提取試劑盒購自超研生物科技有限公司（上海）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒購自諾維贊生物科技有限公司（南京）；凋亡試劑盒購自福麥斯生物技術(shù)有限公司（南京）；酶標儀（Multiskan GO）購自Thermo公司；流式細胞分析儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)769-P和786-O腎癌細胞培養(yǎng)于RPMI1640培 養(yǎng)基，293-T細胞 培養(yǎng) 于DMEM培養(yǎng)基，所有培養(yǎng)基均含10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2。

1.2.2 qPCR檢測提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qPCR試劑盒檢測基因表達，以2μl cDNA作為qPCR反應(yīng)模板，以GAPDH為內(nèi)參，KUCG1正向引物序列：5'-TGCCTTCATCCCATTGTCCT-3'，反向引 物 序 列：5'-AGACATGGCACCACTGATGA-3'；MAGEA11正向引物序列：5'-ATGCTGGGGAGTGT?CATCAA-3'，反向引物序列：5'-ATGCAGTTCCCCTCCATGAA-3'；GAPDH正向引物序列：5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，反向引物序列：5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'。2-ΔΔCt法計算，實驗重復(fù)3次。

1.2.3 慢病毒感染慢病毒感染試驗參考文獻［14］。采用REV、GAG、VAVG 3種質(zhì)粒構(gòu)建慢病毒系統(tǒng)，包裝CRISPR/Cpf1-KUCG1基因序列的質(zhì)粒后感染293-T細胞獲取病毒液。病毒液感染腎癌769-P和786-O細 胞，構(gòu) 建 穩(wěn) 定 低 表 達KUCG1的769-P和786-O腎癌細胞株KUCG1（-）-1、KUCG1（-）-2。感染后培養(yǎng)24 h更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)基。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染采用吉瑪制藥技術(shù)有限公司（上海）的siRNA轉(zhuǎn)染試劑向穩(wěn)定低表達KUCG1的769-P和786-O腎癌細胞轉(zhuǎn)染siRNA-MAGEA11和陰性對照（NC），轉(zhuǎn)染6 h后更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)基。siRNA-MAGEA11正向引物序列：5'-GCACUACUUUCCUGAGAUATT-3'，反向引物序列：5'-UAUCUCAGGAAAGUAGUCCTT-3'；NC正向引物序列：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反向引物序列：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

1.2.5 CCK-8將細胞接種至96孔板，100μl/孔，密度為5 000個/孔。孵育4 h，加入舒尼替尼（10μmol/L）分別處理769-P和786-O細胞72 h和120 h，每48 h更換1次培養(yǎng)基。加入CCK-8試劑37℃孵育2 h，酶標儀測量各孔450 nm處吸光度值。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 侵襲實驗將細胞懸浮于500 μl不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，添加至小室上室（5 000個/室）。將500μl含10%FBS的完全培養(yǎng)基添加至小室下室，37℃孵育24 h，棉簽擦拭過濾器上側(cè)，冷甲醇固定過濾器，0.1%結(jié)晶紫染色30 min。隨機選擇多個區(qū)域進行細胞計數(shù)和拍照。

1.2.7 流式細胞術(shù)分析細胞凋亡采用凋亡試劑盒分析細胞凋亡，冷的PBS洗滌細胞，采用250μl結(jié)合緩沖液重新懸?。?×106個/ml）。取100 μl加入2.5 μl Annexin V/Alexa Flour 488和5 μl碘化丙啶避光孵育15 min，流式細胞儀測量樣品熒光強度，F(xiàn)lowJo_V10軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.8 Western blot收集細胞，加入含磷酸化酶抑制劑和PMSF的RIPA裂解液冰上裂解30 min，4℃、13 000 r/min離心10 min，取上清，采用蛋白標準曲線測定蛋白濃度，-80℃儲存。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜，3%BSA封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，加入二抗孵育2 h，TBST洗滌3次，化學(xué)發(fā)光成像儀獲取圖像，Image J軟件分析條帶灰度，以GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用方差分析（ANOVA），以±s表示。GraphPad Prism8軟件繪圖，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KUCG1表達下調(diào)與ccRCC舒尼替尼耐藥相關(guān)本研究建立一個包括244個lncRNA的gRNA文庫，采用CRISPR/cas9技術(shù)將244個lncRNA gRNA文庫感染769-P細胞，得到下調(diào)244個lncRNA的769-P細胞文庫，舒尼替尼（10μmol/L）作用6 d后得到舒尼替尼耐藥的769-P細胞，對244個lncRNA進行qPCR檢測，結(jié)果顯示，與未處理的769-P細胞相比，處理后細胞KUCG1表達明顯下降（P=0.004，圖1A、B、D）。推測KUCG1與腎癌細胞舒尼替尼耐藥有關(guān)，其位于染色體Xq28區(qū)域，長度為54 092個核苷酸（圖1C）。TCGA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，腎癌組織中KUCG1表達明顯下調(diào)（圖1E）。

圖1 KUCG1（LINC00850）與舒尼替尼耐藥有關(guān)Fig.1 KUCG1（LINC00850）is related to sunitinib resis?tance

2.2 KUCG1表達下調(diào)誘導(dǎo)ccRCC對舒尼替尼的耐藥性為研究KUCG1對ccRCC細胞舒尼替尼耐藥性的影響，以769-P和786-O ccRCC細胞建立穩(wěn)定低表達KUCG1的細胞株（圖2A），CCK-8結(jié)果顯示，舒尼替尼以時間依賴的方式抑制腎癌細胞活力，而KUCG1低表達顯著提高兩種細胞對舒尼替尼的耐藥性，提高769-P和786-O細胞生存能力（圖2B）。舒尼替尼處理48 h后，對照組比KUCG1下調(diào)組出現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變，包括細胞極性消失、細胞膜收縮、細胞質(zhì)空泡化（圖2C）。提示KUCG1下調(diào)可促進腫瘤細胞增殖和生長，降低腫瘤細胞對舒尼替尼的敏感性。

圖2 KUCG1表達下調(diào)誘導(dǎo)ccRCC細胞舒尼替尼耐藥性（×400）Fig.2 Down-regulation of KUCG1 expression induced sunitinib resistance in ccRCC cells（×400）

2.3 KUCG1表達下調(diào)促進腎癌細胞侵襲，抑制其凋亡侵襲實驗結(jié)果顯示，KUCG1下調(diào)，腎癌細胞侵襲細胞數(shù)明顯多于對照組（圖3A），提示KUCG1表達下調(diào)促進腫瘤細胞侵襲。采用流式細胞儀分析KUCG1下調(diào)對ccRCCs細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，KUCG1下調(diào)，腎癌細胞凋亡率明顯下降（圖3B），提示KUCG1下調(diào)可抑制腎癌細胞凋亡。

圖3 KUCG1表達下調(diào)增強腎癌細胞侵襲及抗凋亡能力（×400）Fig.3 Down-expression of KUCG1 enhanced invasion and anti-apoptosis ability of renal carcinoma cells（×400）

2.4 KUCG1表 達 下 調(diào) 可 調(diào) 節(jié)PTEN/AKT/mTOR信號通路Western blot檢測KUCG1下調(diào)對PTEN/AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達的影響，結(jié)果顯示，KUCG1下調(diào)，腎癌細胞mTOR和p-AKT表達增加，PTEN表達降低（圖4）。KUCG1通過調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白表達增強腎癌細胞增殖和侵襲，并增強其耐藥性。

圖4 KUCG1下調(diào)后PTEN/AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達Fig.4 Expressions of PTEN/AKT/mTOR signal-related proteins after KUCG1 down-regulation

2.5 KUCG1通過上調(diào)MAGEA11表達促進腫瘤細胞增殖KUCG1前后1 Mb基因表達情況分析結(jié)果顯示，與未處理的腎癌769-P細胞相比，舒尼替尼耐藥的腎癌細胞MAGEA11表達明顯升高且變化最為顯著，786-O細胞株同樣表現(xiàn)出相同結(jié)果（圖5A），推測KUCG1可能通過調(diào)控MAGEA11表達影響腎癌細胞生物學(xué)行為。Western blot結(jié)果顯示，實驗組相比對照組細胞MAGEA11蛋白水平明顯升高（圖5B）。為進一步研究KUCG1基因下調(diào)后促進腫瘤細胞增殖的分子機制，采用siRNA下調(diào)實驗組細胞MAGEA11表達，并采用qPCR和Western blot驗證其MAGEA11下調(diào)結(jié)果（圖5B、C）。STRING數(shù)據(jù)庫查詢發(fā)現(xiàn)，MAGEA11可通過調(diào)控AKT/mTOR信號通路影響腫瘤細胞生物學(xué)行為。Western blot檢測PTEN/AKT/mTOR信號通路發(fā)現(xiàn)，MAGEA11下調(diào)后mTOR和p-AKT表達下降，PTEN表達上升（圖6）。表明KUCG1下調(diào)通過上調(diào)MAGEA11表達增強細胞活力，促進細胞增殖，并增強其耐藥性。

圖5 KUCG1調(diào)控MAGEA11表達Fig.5 KUCG1 regulates expression of MAGEA11

圖6 MAGEA11影響PTEN/AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達Fig.6 MAGEA11 affects expressions of PTEN/AKT/mTOR signaling pathway related proteins

2.6 MAGEA11表達下調(diào)腎癌細胞增殖、侵襲減弱，凋亡增強為驗證MAGEA11對腎癌細胞生物學(xué)行為的影響，采用siRNA-MAGEA11下調(diào)769-P腎癌細胞KUCG1下調(diào)組MAGEA11表達，CCK-8、侵襲和凋亡實驗結(jié)果顯示，MAGEA11表達下調(diào)后腎癌細胞增殖和侵襲能力較處理前明顯降低，凋亡明顯增強（圖7）。

圖7 MAGEA11表達下調(diào)影響腎癌細胞生物學(xué)行為（×400）Fig.7 Down-regulation of MAGEA11 expression affects biological behavior of renal cell carcinoma（×400）

3 討論

本研究顯示，舒尼替尼以劑量依賴的方式抑制腫瘤細胞生存能力。KUCG1表達下調(diào)增強腫瘤細胞活力和對舒尼替尼的耐藥性。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，KUCG1下調(diào)后抑制腎癌細胞凋亡，可能依賴于細胞周期激活。G1/S期轉(zhuǎn)換過程中，周期蛋白依賴激酶（CDK）和細胞周期蛋白D和E結(jié)合維持細胞循環(huán)正常進行［15］。KUCG1下調(diào)可能促進細胞周期蛋白D和E表達，或與細胞周期蛋白/CDK復(fù)合物抑制劑表達降低有關(guān)，促進細胞循環(huán)及細胞生長。

KUCG1下調(diào)促進腫瘤細胞侵襲。顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，表明藥物誘導(dǎo)細胞損傷。KUCG1下調(diào)可抵抗舒尼替尼殺傷效應(yīng)。舒尼替尼可通過抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transi?tion，EMT）過程抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT過程中，由于上皮鈣黏蛋白表達減少導(dǎo)致上皮細胞極性喪失，細胞間黏附減少，誘導(dǎo)腎癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移［16］。同時腫瘤細胞耐藥性與EMT密切相關(guān)。KUCG1可能通過促進EMT促進腫瘤細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥。

晚期腎癌患者對靶向藥物產(chǎn)生耐藥性，目前臨床無有效治療方法。腫瘤對一線TKI藥物產(chǎn)生耐藥的可能機制包括：血管生成信號激活后血管再生；增加覆蓋的被膜細胞保護脈管系統(tǒng)；改變腫瘤微環(huán)境及增強腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移加強脈管系統(tǒng)再生以及其他旁路信號激活［17-18］。因此，探索舒尼替尼耐藥的分子機制，尋找新的作用靶點是臨床研究重點。腫瘤細胞生長抑制是由于藥物介導(dǎo)的AKT、MAPK、STAT等信號通路被抑制［19］。PTEN低表達與舒尼替尼耐藥密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，KUCG1在舒尼替尼耐藥腎癌細胞中低表達。KUCG1表達下調(diào)，PTEN表達被抑制，AKT/mTOR信號通路被激活，ccRCCs舒尼替尼的耐藥性增強。AKT/mTOR是經(jīng)典生存信號通路，與細胞活力密切相關(guān)，而PTEN表達可抑制此通路。

KUCG1對臨近編碼基因MAGEA11可能通過Cis調(diào)控機制進行調(diào)控，即KUCG1通過順式作用元件，包括增強編碼基因啟動子、增強子活性、調(diào)控序列和可誘導(dǎo)元件等激活轉(zhuǎn)錄和調(diào)控基因表達［20］。KUCG1可能通過形成多個RNP復(fù)合物或編碼微肽參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。lncRNA還可增強RNA聚合酶Ⅱ活性，此外，lncRNA調(diào)節(jié)miRNA表達，反過來抑制編碼基因和miRNA靶向結(jié)合［21］。lncRNA還可通過lncRNA-mRNA/miRNA相互作用調(diào)節(jié)腎細胞癌MAGEA11表達［22］。MAGEA11是腫瘤種系抗原，通過介導(dǎo)DNA低甲基化、血管形成和腫瘤轉(zhuǎn)移等多種途徑促進腫瘤細胞增殖生長及對多種化療藥物耐藥，并在黑色素瘤、前列腺癌和食管癌等多種腫瘤細胞中高表達［23-25］。且MAGEA11表達對于細胞自噬至關(guān)重要［26］。本研究發(fā)現(xiàn)KUCG1下調(diào)后兩種腎癌細胞株中MAGEA11表達明顯增加。為驗證MAGEA11表達對腎癌細胞特性的影響，直接利用siRNA敲減MAGEA11表達，MAGEA11表達下調(diào)后腫瘤細胞增殖、侵襲受抑制，表明KUCG1表達下調(diào)通過促進MAGEA11上調(diào)增強腎癌細胞活性，增強腎癌細胞耐藥性。

KUCG1通過磷酸化和促進AKT信號傳導(dǎo)抑制細胞凋亡。KUCG1正向調(diào)節(jié)PTEN表達，反向調(diào)節(jié)p-AKT水平，而p-AKT和mTOR通過MAGEA11表達升高，因此，KUCG1通過調(diào)節(jié)MAGEA11表達影響PTEN/AKT/mTOR信號通路。而mTOR又可正向調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D和E表達，從而促進細胞周期進展，促進細胞增殖［27］。因此，KUCG1通過MAGEA11調(diào)節(jié)PTEN/AKT/mTOR信號通路促進腫瘤細胞耐藥性。

綜上，KUCG1通過促進細胞周期、抑制凋亡和促進AKT信號通路促進腎癌細胞增殖和侵襲，本研究證明KUCG1下調(diào)可降低腎透明癌細胞對舒尼替尼藥物的敏感性，降低藥物治療效果。KUCG1通過MAGEA11上調(diào)影響PTEN/AKT/mTOR信號通路。本研究證實，KUCG1可降低晚期腎癌患者臨床治療效果，為尋找耐藥靶點提供了新的思路，將通過臨床研究進一步驗證。