石光 安麗萍

（北華大學藥學院，吉林 132000）

衰老很重要的方面就是免疫功能低下，引起衰老的環(huán)境因素必將導致免疫系統(tǒng)功能缺陷，即免疫衰老。有報道老年人T淋巴細胞不僅數(shù)目減少，且增殖能力較年輕人下降50%以上，體內(nèi)天然抗體與免疫抗體也下降［1］。許多研究發(fā)現(xiàn)，植物多糖可以抑制腫瘤生長，激活免疫細胞，提高機體的免疫功能［2］。桑黃（phellinus igniarius）屬于擔子菌亞門，層菌綱，多孔菌科，木層孔菌屬，又稱桑耳、桑黃菇，是一種珍貴的藥用真菌。桑黃含有多糖類、甾體類、萜類、黃酮類、吡喃酮類、呋喃類、氯化產(chǎn)物等多種成分，多糖為其主要藥效成分［3-4］。其功效包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗腫瘤、降血糖等，因此，桑黃多糖（phellinus igniarius polysaccharide，PIP）成為真菌研究領(lǐng)域中的一大熱點，本研究前期工作發(fā)現(xiàn)桑黃具有較強的體外抗氧化活性，并且可以修復H2O2誘導的細胞損傷，但其對免疫功能的調(diào)節(jié)作用及機制尚不明確［5］。

本實驗通過D-半乳糖（D-galactose，D-gal）誘導小鼠衰老模型，研究PIP的免疫調(diào)節(jié)作用，并初步探討其免疫調(diào)節(jié)機制，為桑黃進一步開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料、試劑桑黃，延吉百納和商貿(mào)有限公司，由北華大學藥學院生藥教研室韓東鑒定；ICR雄性小鼠由吉林大學實驗動物研究中心提供；小鼠飼料購自長春億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司；D-gal購自美國Genview公司；CCK-8購自美國Genview公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自塞默飛世爾生物化學制品有限公司；D-Hank's液購自美國Gen?view公司；刀豆蛋白A（Con A）購自美國Sigma公司；TNF-α、IL-6試劑盒購自ABclonal公司；RNA提取試劑盒、One Step RT-PCR kit試劑盒購自諾唯贊生物科技有限公司；TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB、P-CJun引物購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備UV-2550型紫外可見分光光度計（島津國際貿(mào)易有限公司）；Infinite M200型酶標儀（TECAN）；LIFE Countess全自動細胞計數(shù)儀（美國Life Technologies公司）；低溫高速離心機（美國eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 桑黃酸性多糖（phellinus igniarius polysac?charide acid，PIP-A）的制備及單糖組成取干燥至恒重的桑黃，按水料比40∶1（v/w），80℃水浴提取3次，每次4 h，提取液濃縮離心，80%乙醇沉淀上清液，靜置24 h，離心收集沉淀，依次用95%乙醇，無水乙醇洗滌，常規(guī)干燥得桑黃粗多糖，透析，冷凍干燥，得PIP；利用DEAE-纖維素柱（7.5 cm×30 cm，CI型）進行分級，0.5 mol/L NaCl洗脫，除鹽，冷凍干燥，得PIP-A。采用Shimadzu HPLC系統(tǒng)（LC-10ATVP泵和SPD-10AVD紫外光檢測器）檢測PIP-A中的單糖組成，以DIKMA Inertsil ODS-35為色譜柱（4.6 mm×150 mm），流動相為PBS（0.1 mol/L，pH7.0-乙腈82∶18（v/v），流速為1.0 ml/min，進樣量為20 μl，檢測波長為245 nm。

1.2.2 動物分組及模型的建立雄性ICR小鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。將其隨機分為4組，每組15只，采用造模給藥同時進行，以等效臨床劑量及體表面積公式計算為依據(jù)，選擇800 mg/kg為PIP-A、吡拉西坦的用藥劑量，即：空白組（CON組，灌胃蒸餾水，背頸部皮下注射生理鹽水）、模型組（MOD組，灌胃蒸餾水，背頸部皮下注射200 mg/kg D-gal）、陽性對照組（PC組，灌胃800 mg/kg吡拉西坦，背頸部皮下注射200 mg/kg D-gal）、桑黃酸性多糖給藥組（PIP-A，灌胃800 mg/kg PIP-A，背頸部皮下注射200 mg/kg D-gal），口服灌胃連續(xù)給藥10周，并且每隔3 d于固定時間稱重并記錄。

1.2.3 測定小鼠臟器指數(shù)末次給藥后，小鼠稱重，脫頸處死小鼠后取出胸腺及脾臟，去除血液、脂肪、系膜，濾紙吸干并稱重，計算臟器質(zhì)量與體質(zhì)量的比值（mg/g）。臟器指數(shù)（%）=臟器質(zhì)量（mg）/動物體質(zhì)量（g）×100%。

1.2.4 Con A引起的小鼠脾臟淋巴細胞增殖反應(yīng)采用CCK-8法測定脾的淋巴細胞的增殖。將小鼠斷髓處死，75%乙醇浸泡10 min，無菌操作下取出小鼠的脾臟，置于PBS預冷的瓶皿中洗滌，除去血液和外膜，PBS溶液洗滌3遍。小鼠脾臟碾碎，過200目金屬細胞濾網(wǎng)，并用D-Hank's連續(xù)沖洗采集細胞懸液，離心后收集細胞。應(yīng)用全自動細胞計數(shù)儀對脾細胞計數(shù)，將細胞調(diào)整至2.19×106個/ml，將懸浮的細胞（90 μl/孔）接種到96孔板上，分為對照組（10 μl培養(yǎng)液）和Con A組（10 μl 50 μg/ml Con A），每組3個復孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵化36 h后，向每孔中加入15 μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。培養(yǎng)終止后，使用全自動酶標儀于570 nm處測定光密度值（OD值）。

1.2.5 血清TNF-α、IL-6含量測定小鼠稱重后，眼球取血采集血漿標本，4 000 r/min離心20 min，取上清液，按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書測定TNF-α、IL-6的含量。

1.2.6小鼠脾臟組織切片對小鼠進行脫頸處死并快速在冰上分離脾臟，石蠟包埋備用，采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察病理切片變化，光學顯微鏡下觀察小鼠脾臟病理損傷情況。

1.2.7 脾臟組織中相關(guān)因子mRNA表達水平從脾臟中提取總RNA，并使用核酸檢測儀測定RNA的濃度和純度，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性。嚴格按照HiScriptⅡOne Step RT-PCR Kit說明書，檢測細胞中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB、P-C-Jun的表達水平，并以β-actin作為內(nèi)參基因，具體引物序列如表1所示。用PCR擴增儀進行目的基因擴增。

表1 相關(guān)引物序列表Tab.1 Sequence table of related primers

1.3 統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS16.0軟件數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PIP-A的制備PIP-A主要由葡萄糖和甘露糖組成，其中葡萄糖占46.17%，甘露糖占17.83%，葡萄糖酸占8.19%，鼠李糖占2.57%，半乳糖酸占2.35%，半乳糖占13.71%，木糖占3.90%，阿拉伯糖占2.26%，果糖占3.02%。

2.2 D-gal致衰老小鼠模型的建立與CON組小鼠相比，MOD組小鼠在造模后期逐漸變得不活潑，喜蜷縮，脊椎隆起，體形消瘦，皮膚松弛，食欲不振，毛發(fā)稀疏、豎起時失去光澤等一系列衰老體征，而PC組與PIP-A組小鼠表現(xiàn)為精神狀態(tài)明顯改善，反應(yīng)相對靈活，攝食量相對平穩(wěn)，故本實驗衰老模型建模成功。造模結(jié)束后，CON組小鼠成活15只，MOD組小鼠成活12只，PC組小鼠成活13只，PIP-A組小鼠成活13只。

2.3 PIP-A對小鼠臟器指數(shù)影響與CON組相比，MOD組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低（P<0.01）；與MOD組相比，PIP-A組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著增高（P<0.05，P<0.01，表2）。

表2 PIP-A對小鼠臟器指數(shù)的影響（±s，n=8，mg/g）Tab.2 Effect of PIP-A on organ index of mice（±s，n=8，mg/g）

表2 PIP-A對小鼠臟器指數(shù)的影響（±s，n=8，mg/g）Tab.2 Effect of PIP-A on organ index of mice（±s，n=8，mg/g）

Note：Compared with CON group，1）P<0.01；compared with MOD group，2）P<0.05，3）P<0.01.

Organ index Thymus Spleen CON 0.771 4±0.097 2 3.995 1±1.849 4 MOD 0.620 8±0.145 51）3.353 7±0.613 41）PC 0.777 8±0.115 73）4.306 4±1.758 02）PIP-A 0.722 3±0.101 12）4.642 4±0.994 43）

2.4 Con A引起的小鼠脾臟淋巴細胞增殖轉(zhuǎn)化結(jié)果與CON組相比，MOD組小鼠Con A誘導的淋巴細胞增殖能力顯著降低（P<0.01）。與MOD組相比，PIP-A組小鼠Con A誘導的淋巴細胞增殖能力顯著提高（P<0.05，表3）。

表3 PIP-A對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響（±s，n=8，mg/g）Tab.3 Effect of PIP-A on increment of spleen lymphocyte in mice（±s，n=8，mg/g）

表3 PIP-A對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響（±s，n=8，mg/g）Tab.3 Effect of PIP-A on increment of spleen lymphocyte in mice（±s，n=8，mg/g）

Note：Compared with CON group，1）P<0.01；compared with MOD group，2）P<0.05，3）P<0.01.Con A+.Add Con A；Con A-.No add Con A.

Groups CON MOD PC PIP-A Con A+0.715 3 0.511 4 0.618 8 0.664 0 Con A-0.316 0 0.254 1 0.308 5 0.357 2 Difference between OD 0.399 3 0.257 41）0.310 33）0.306 82）

2.5 血清中TNF-α、IL-6含量測定結(jié)果與CON組相比，MOD組小鼠中TNF-α、IL-6含量顯著降低；與MOD組小鼠相比，經(jīng)PIP-A處理后，血清中TNF-α、IL-6的含量逐漸升高，各劑量的組間差異顯著（P<0.05，圖1）。

圖1 PIP-A對小鼠血清中TNF-α、IL-6水平的影響Fig.1 Effect of PIP-A on TNF-α and IL-6 levels in serum of mice

2.6 小鼠脾臟組織切片分析與CON組相比，MOD組中脾臟的顯微照片顯示紅髓和白髓混合，脾小體被破壞消失，脾竇擴大，脾淋巴細胞減少；經(jīng)PIP-A處理后，脾淋巴細胞形態(tài)接近規(guī)則（圖2）。

圖2 PIP-A對小鼠脾臟組織病理學的影響（HE，×400）Fig.2 Effect of PIP-A on spleen histopathology in mice（HE，×400）

2.7 脾臟組織中TLR4信號通路中相關(guān)基因mRNA表達水平與CON組相比，MOD組小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB、P-C-Jun的mRNA表達水平降低；與MOD組相比，PIP-A組中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB、P-C-Jun的mRNA表達水平顯著升高（圖3）。

圖3 PIP-A對脾臟組織中TLR4信號通路中相關(guān)基因mRNA表達水平的影響Fig.3 Effect of PIP-A on expressions of TLR4 related genes mRNA in spleen by PIP-A

3 討論

免疫功能的減退是衰老最明顯的特質(zhì)之一［6］。隨著人體的衰老，免疫器官、免疫細胞、免疫分子的功能也日漸衰退［7］。D-gal可產(chǎn)生擬衰老反應(yīng)，對氧自由基代謝的損傷、免疫功能的影響與人體衰老的改變基本一致。因此，課題組通過利用D-gal誘導免疫功能低下動物模型。實驗結(jié)果顯示模型鼠的臟器指數(shù)明顯下降，Con A誘導的脾淋巴細胞增殖能力明顯下降，并且體內(nèi)相應(yīng)免疫器官呈現(xiàn)萎縮，給予PIP-A干預后其胸腺、脾臟臟器指數(shù)明顯升高，小鼠脾淋巴細胞增殖能力增強。

TNF-α是一種主要由巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生的促炎細胞因子，在宿主防御機制中起著非常重要的作用，也能刺激一系列免疫介質(zhì)和炎癥介質(zhì)的表達［8］。IL-6是由單核細胞、激活的淋巴細胞及多種活性細胞分泌的具有生物活性物質(zhì)，對機體的天然免疫和獲得性免疫都具有重要的調(diào)節(jié)作用［9-11］。實驗結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)PIP-A給藥處理后，其血清中TNF-α、IL-6含量明顯升高，說明其具有顯著的增強免疫力的作用。

Toll樣受體（toll like receptor，TLR）作為連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁，其介導的信號轉(zhuǎn)導通路及其作用一直是科研人員研究的焦點［12-14］。由髓樣分化因子88（myeloid differentiation primary response protein 88，MyD88）承接的轉(zhuǎn)導途徑稱為MyD88依賴途徑，其他稱為MyD88非依賴途徑［15-18］。其中MyD88依賴性途徑主要包括MyD88和TRAF6等主要元件，用于激活NF-κB途徑，調(diào)控相關(guān)節(jié)點和細胞因子的表達［19-22］。TLR4在接受抗原信息后，通過活化MyD88蛋白，促使TRAF6蛋白上調(diào)，最終激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB進入細胞核，促使核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB移位，啟動天然免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)免疫應(yīng)答［23-25］。在本實驗結(jié)果提示，PIP-A對模型小鼠脾臟組織TLR4及下游信號轉(zhuǎn)導通路主要元件MyD88及TRAF6的mRNA表達有明顯促進作用，從而發(fā)揮免疫刺激作用。

綜上所述，PIP-A對D-gal誘導的小鼠具有免疫調(diào)節(jié)功能，其機制可能是PIP-A促進TLR4及下游信號轉(zhuǎn)導通路主要元件MyD88及TRAF6的表達實現(xiàn)的，本研究為桑黃的開發(fā)與應(yīng)用奠定了理論和實踐依據(jù)。