宋佳易 劉春英

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，沈陽 110847）

肺癌是我國(guó)最常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率與病死率呈逐年遞增趨勢(shì)，已成為人類健康的第一威脅［1-3］。肺癌惡性程度較高，70%~90%病例在手術(shù)過程中即發(fā)現(xiàn)病理類型為浸潤(rùn)性癌，五年生存率顯著下降［4］。近年研究證實(shí)，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）與腫瘤發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥密切相關(guān)［5］。EMT是指在某種生理或病理?xiàng)l件下，具有緊密連接狀態(tài)的上皮樣細(xì)胞向紡錘形、多偽足、連接松散的間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)過度的過程［6］。正常上皮細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，腫瘤多處于原位癌階段。腫瘤細(xì)胞繼續(xù)發(fā)展則通過EMT原位擴(kuò)散侵入血管和淋巴管進(jìn)行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［7-9］。EMT發(fā)生過程中，腫瘤上皮相關(guān)標(biāo)志物E-Cad、α-CA表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志蛋白Vim、α-SMA表達(dá)增強(qiáng)［10-11］。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是EMT的重要誘導(dǎo)因子［12］。TGF-β1可與細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合，經(jīng)過相關(guān)信號(hào)通路使該誘導(dǎo)因子與細(xì)胞相互作用，促發(fā)EMT［13］。相關(guān)動(dòng)態(tài)研究發(fā)現(xiàn)，EMT過程中TGF-β和MAPK在起始階段發(fā)揮協(xié)同作用，而維持階段起主要作用的是PI3K/AKT通路［14］。本研究通過Transwell、Western blot和q-PCR等方法研究土荊皮乙酸（pseudolaric acid B，PAB）通過PI3K/AKT通路對(duì)肺癌細(xì)胞EMT及遷移、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料肺癌A549細(xì)胞株（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究中心細(xì)胞庫(kù)）；PAB（美國(guó)Sigma公司）；培養(yǎng)基（Hyclon公司）；E-Cad、α-CA、Vim、α-SMA抗體（Proteintech公司）；Western blot試劑盒（博奧公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo-Forma）；倒置熒光顯微鏡（Leica）；熒光定量PCR儀（生命技術(shù)公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞置于1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h~72 h（含100 μg/ml鏈霉素的胎牛血清）。培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2、飽和濕度。待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底70%~80%時(shí)胰酶消化傳代，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%融合加入無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h。

1.2.2 分組及處理CCK8實(shí)驗(yàn)顯示PAB對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞具有增殖抑制作用，且呈濃度依賴性。40 μmol/L PAB作用48 h，肺癌A549細(xì)胞達(dá)到半數(shù)抑制率，以此作為最佳作用濃度與最佳作用時(shí)間?？瞻捉M僅添加培養(yǎng)液，誘導(dǎo)組加入終濃度5 μg/L TGF-β1溶液，實(shí)驗(yàn)組在誘導(dǎo)組基礎(chǔ)上，同時(shí)加入最佳濃度PAB（40 μmol/L）作用48 h至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲制備基質(zhì)膠和終濃度藥物進(jìn)行添加或不添加PAB處理，按照上述分組加樣，并添加5μg/L TGF-β1誘導(dǎo)劑至小室，再加入200μl細(xì)胞懸濁液至上室，10%胎牛血清至下室，37℃孵育24 h。取小室，棄上清，染色，顯微鏡觀察，拍照。同樣實(shí)驗(yàn)方法，不進(jìn)行基質(zhì)膠制備，檢測(cè)A549細(xì)胞遷移能力。

1.2.4 免疫熒光實(shí)驗(yàn)取蓋玻片，接種適量濃度細(xì)胞，3組細(xì)胞均分別培養(yǎng)48 h，固定，通透，封閉1 h。加入一抗孵育過夜后洗滌，加入二抗孵育后染色。顯微鏡下觀察E-Cad表達(dá)情況并拍照。

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)3組細(xì)胞分別提取總蛋白，制備分離膠和濃縮膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗、二抗孵育，測(cè)量各條帶吸光度值，計(jì)算蛋白表達(dá)。

1.2.6 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)采用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物序列，GAPDH正向引物：5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，反向引物：5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′；α-CA正向引物：5′-TCCTACGTCGCCTCTACC-3′，反向引物：5′-CTTCTGAGATGCCC?GTTT-3′；Vim正向引物：5′-TTGAACGCAAAGTG?GATTC-3′，反向引物：5′-AGGTCAGGCTTGGAAA?CA-3′；α-SMA正向引物：5′-TCCCTTGAGAAGAGT?TACGAGTT-3′，反向引物：5′-ATGATGCTGTTGTAGGTGGTT-3′。分別提取各組細(xì)胞樣本總RNA，于冰上配制各反應(yīng)體系后進(jìn)行去DNA反應(yīng)。測(cè)定樣本純度，合格后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增反應(yīng)，合成相應(yīng)cDNA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)描述均符合正態(tài)分布，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAB對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響Transwell檢測(cè)PAB（40μmol/L）處理48 h的TGF-β1（5 μg/L）誘導(dǎo)的A549細(xì)胞，結(jié)果顯示，PAB可顯著抑制A549細(xì)胞遷移、侵襲能力（圖1）。

圖1 Transwell檢測(cè)PAB對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響（×100）Fig.1 Transwell to detect effect of PAB on migration and invasion of A549 cells（×100）

2.2 PAB對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞E-Cad蛋白表達(dá)的影響取PAB（40μmol/L）處理48 h的TGF-β1（5 μg/L）誘導(dǎo)的A549細(xì)胞，免疫熒光法檢測(cè)E-Cad蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與空白組相比，誘導(dǎo)組E-Cad蛋白表達(dá)下調(diào)，與誘導(dǎo)組相比，實(shí)驗(yàn)組E-Cad蛋白表達(dá)上調(diào)（圖2）。

圖2 免疫熒光檢測(cè)PAB對(duì)A549細(xì)胞E-Cad蛋白表達(dá)的影響（×100）Fig.2 Immunofluorescence to detect effect of PAB on expression of E-Cad protein in A549 cells（×100）

2.3 PAB對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路的影響與空白組相比，誘導(dǎo)組p-PI3K及p-AKT蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)（P<0.05），與誘導(dǎo)組相比，實(shí)驗(yàn)組顯著抑制活化的p-PI3K及p-AKT蛋白表達(dá)，說明PAB可抑制PI3K/AKT信號(hào)通路活化（圖3）。

圖3 Western blot檢測(cè)PAB對(duì)A549細(xì)胞PI3K、AKT表達(dá)的影響Fig.3 Western blot to detect effect of PAB on expressions of PI3K and AKT in A549 cells

2.4 PAB對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞E-Cad、α-CA、Vim、α-SMA蛋白表達(dá)的影響取PAB（40 μmol/L）處理48 h的TGF-β1（5 μg/L）誘導(dǎo)的A549細(xì)胞，Western blot檢測(cè)E-Cad、α-CA、Vim、α-SMA蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示，與空白組相比，誘導(dǎo)組E-Cad、α-CA蛋白表達(dá)下調(diào)，Vim、α-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)。與誘導(dǎo)組相比，實(shí)驗(yàn)組E-Cad、α-CA蛋白表達(dá)上調(diào)，而Vim、α-SMA蛋白表達(dá)下調(diào)（圖4）。

圖4 Western blot檢測(cè)PAB對(duì)A549細(xì)胞E-Cad、α-CA、Vim、α-SMA表達(dá)的影響Fig.4 Western blot to detect effect of PAB on expressions of E-Cad，α-CA，Vim and α-SMA in A549 cells

2.5 PAB對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞α-CA、Vim、α-SMA mRNA表 達(dá) 的 影響PAB作 用48 h后，RT-qPCR結(jié)果顯示，與空白組相比，誘導(dǎo)組α-CA mRNA表達(dá)下調(diào)，Vim、α-SMA mRNA表達(dá)上調(diào)。與誘導(dǎo)組相比，實(shí)驗(yàn)組α-CA mRNA表達(dá)上調(diào)，而Vim、α-SMA mRNA表達(dá)下調(diào)（圖5）。

圖5 RT-qPCR檢 測(cè)PAB對(duì)A549細(xì) 胞 中α-CA、Vim、α-SMA表達(dá)的影響Fig.5 RT-qPCR detection of effect of PAB on expressions of α-CA，Vim and α-SMA in A549 cells

3 討論

EMT可發(fā)生于生理和病理過程，腫瘤細(xì)胞伴隨形態(tài)、黏著力、基質(zhì)性狀改變。病理?xiàng)l件下，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)EMT，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂懈咔忠u力的間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，入侵周圍組織、血管、淋巴管，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［15］。E-Cad、α-CA是主要的上皮標(biāo)志蛋白，在維持細(xì)胞形態(tài)、參與細(xì)胞間黏附、保持細(xì)胞完整性中起重要作用。EMT發(fā)生過程中，上皮標(biāo)志蛋白E-Cad、α-CA表達(dá)下降，而Vim、α-SMA表達(dá)上調(diào)［10-11］。作為一種重要的細(xì)胞因子，TGF-β1可在腫瘤發(fā)生進(jìn)展中起促進(jìn)作用，可與腫瘤細(xì)胞表面相關(guān)受體結(jié)合，促進(jìn)多種轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，使上皮來源的腫瘤細(xì)胞失去原有的緊密連接狀態(tài)而向纖維樣、梭形細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，促發(fā)EMT，腫瘤細(xì)胞也更易轉(zhuǎn)移，相關(guān)上皮標(biāo)志蛋白表達(dá)下降，間質(zhì)標(biāo)志蛋白表達(dá)升高。因此，抑制或阻斷TGF-β1介導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞EMT發(fā)生，可成為抑制腫瘤發(fā)生、進(jìn)展的新方向［16］。目前抑制EMT的相關(guān)報(bào)道較多，如單克隆抗體、miRNA及小分子藥物等，而中藥因其效果佳、副作用小而深受臨床藥物開發(fā)者青睞。

PAB也稱為土槿皮乙酸，為中國(guó)特有松科植物金錢松的近根樹皮提取物，具有殺蟲止癢、祛風(fēng)除濕作用［17］。始載于趙學(xué)敏的《本草綱目拾遺》，亦是《中華人民共和國(guó)藥典》收載的常用中藥，近年對(duì)PAB的研究越來越多，尤其是其抗腫瘤功效引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。但關(guān)于其逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞EMT和侵襲轉(zhuǎn)移的研究卻鮮有報(bào)道。本研究驗(yàn)證了PAB可逆轉(zhuǎn)TGF-β1介導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞EMT和侵襲轉(zhuǎn)移能力。

PI3K/AKT信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及EMT等過程中起重要作用，因此，調(diào)控該信號(hào)通路對(duì)預(yù)防和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移或耐藥等惡性進(jìn)程，發(fā)現(xiàn)臨床治療新靶點(diǎn)具有重要意義。研究表明，胰腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT過程依賴于AKT激活［18］。研究顯示，TGF-β1誘導(dǎo)EMT的過程中，PI3K/AKT激活必不可少［19］。E-Cad、α-CA作為EMT的重要上皮標(biāo)志蛋白，受PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控。AKT可被PI3K激活而磷酸化，使磷酸化后的AKT蛋白表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而下游轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)，直接降低細(xì)胞內(nèi)E-Cad、α-CA水平，導(dǎo)致EMT發(fā)生。另外，基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)可受PI3K/AKT信號(hào)通路激活而升高表達(dá)，從而降解E-Cad、α-CA使細(xì)胞更易發(fā)生轉(zhuǎn)移［20-21］。表明激活PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)誘導(dǎo)EMT、促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導(dǎo)可促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞EMT進(jìn)程，PAB處理后，不僅降低肺癌A549細(xì)胞EMT進(jìn)程，PI3K/AKT信號(hào)通路也受到一定抑制作用，侵襲和轉(zhuǎn)移能力被抑制，表現(xiàn)為上調(diào)E-Cad、α-CA蛋白表達(dá)水平而同時(shí)下調(diào)Vim、α-SMA、PI3K、AKT蛋白表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)PAB可能通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，降低AKT磷酸化蛋白表達(dá)，從而抑制TGF-β1介導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞EMT進(jìn)程，進(jìn)而抑制細(xì)胞遷移和侵襲。

綜 上所 述，PAB可 抑制TGF-β1介 導(dǎo) 的肺 癌A549細(xì)胞EMT發(fā)生和遷移侵襲能力，其機(jī)制可能為通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)，為PAB在肺癌分子靶向治療中的應(yīng)用提供參考。