田亞麗 王芳 田東惠 周逢強(qiáng)

（濱州市人民醫(yī)院，濱州 256610）

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎（neonatal necrotizing enterocolitis，NEC）為臨床新生兒尤其是早產(chǎn)兒較為常見(jiàn)且嚴(yán)重的腸道炎癥疾病，主要表現(xiàn)為血便、腹脹及腸壁積氣等癥狀，其致病機(jī)制尚未完全明確［1］。近年研究表明，NEC發(fā)生與腸道菌群紊亂密切相關(guān)，早產(chǎn)兒腸道菌落種類和數(shù)量減少，尤其是益生菌減少，導(dǎo)致克雷伯菌屬處于相對(duì)優(yōu)勢(shì)，可能是NEC發(fā)病機(jī)制中的重要因素［2-3］。糞菌移植（fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）對(duì)復(fù)發(fā)性難辨梭菌芽孢桿菌性腸炎（clostfidium difficile infection，CDI）患者及潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）小鼠治療均有顯著療效，F(xiàn)MT預(yù)防及治療能夠顯著改善結(jié)腸炎引起的腸道菌群及炎癥因子改變，從而促進(jìn)結(jié)腸黏膜修復(fù)［4-5］。因此，F(xiàn)MT是增加結(jié)腸炎患者腸道有益菌、改變腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂、重建腸道內(nèi)環(huán)境最直接的方式。為探討FMT對(duì)NEC的預(yù)防作用，本研究將建立NEC新生小鼠模型，探討FMT對(duì)NEC新生小鼠腸道菌群的影響，并分析具體機(jī)制，以期為NEC臨床治療提供新的方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物48只SPF級(jí)3日齡C57BL/6新生雌性小鼠，體質(zhì)量1.5~3.0 g，購(gòu)于山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（魯）2018-0012。

1.1.2 藥品與試劑雅培嬰幼兒奶粉購(gòu)自美國(guó)雅培公司；HE染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；兔抗鼠Gata-3、T-bet抗體購(gòu)自武漢博士德公司；小鼠IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司。

1.1.3 儀器CX-31顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司產(chǎn)品；ELX-800酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及建模48只C57BL/6新生小鼠置于保育箱，（36±1）℃，45%~60%相對(duì)濕度，經(jīng)口插入PICC管，灌胃給予代乳品，每4 h喂養(yǎng)1次，0.03~0.05 ml/（g·次）。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為對(duì)照組、NEC模型組、FMT預(yù)防組、FMT治療組，每組12只。除對(duì)照組外，其余三組均參照文獻(xiàn)［6］采用缺氧+冷刺激+人工喂養(yǎng)法連續(xù)刺激3 d建立NEC模型：新生小鼠放入自制密閉缺氧箱（100%N2）90 s，4℃冷刺激10 min，缺氧、冷刺激2 d/次，交叉進(jìn)行。對(duì)照組幼鼠自由飲水6 d；FMT預(yù)防組在建立NEC模型同時(shí)灌胃給予FMT，飲水恢復(fù)3 d；FMT治療組建模成功后灌胃給予FMT，連續(xù)3 d。

1.2.2 FMT菌液制備實(shí)驗(yàn)期間每日收集對(duì)照組小鼠3 h內(nèi)新鮮糞便，混勻，稱重，加入生理鹽水制成400 mg/ml FMT混懸液，隨后按小鼠自身體質(zhì)量1/500劑量給予FMT預(yù)防組及FMT治療組（80~120μl/只），同時(shí)實(shí)驗(yàn)期間每天收集各組小鼠糞便，制備FMT菌液，-80℃保存用于菌群分析。

1.2.3 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)第7天處死各組小鼠，取出腸管（十二指腸下端至回盲部），于白色無(wú)菌紗布上肉眼觀察腸管是否有出血、壞死或無(wú)腸腔積氣等NEC樣病變。清除腸道內(nèi)容物，取各組幼鼠腸組織（近回盲部1~2 cm），4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察腸組織病理學(xué)變化。

1.2.4 ELISA測(cè)定結(jié)腸組織細(xì)胞因子水平準(zhǔn)確稱取各組小鼠結(jié)腸組織，參考文獻(xiàn)［7］制備結(jié)腸組織勻漿，加入預(yù)冷PBS緩沖液并超聲粉碎，4℃、3 000 g離心15 min，取上清，檢測(cè)炎癥因子含量，嚴(yán)格按照IL-4、IL-10、TNF-α及IFN-γ ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.5 免疫組化檢測(cè)結(jié)腸組織Gata-3和T-bet陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)參考文獻(xiàn)［8］SP法檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織Gata-3和T-bet陽(yáng)性因子表達(dá)，加入一抗Gata-3（1∶100）、T-bet（1∶50）4℃孵育過(guò)夜，加入二抗室溫孵育。已知陽(yáng)性片為陽(yáng)性對(duì)照，PBS緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。每張片隨機(jī)選取3個(gè)無(wú)交叉視野，Olym-pusBX41顯微鏡拍照，Image-pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比例。

1.2.6 小鼠腸道菌群分析收集各組小鼠實(shí)驗(yàn)期間糞便制備FMT菌液，-80℃保存。參考文獻(xiàn)［9］采用Illumina miseq platform測(cè)序平臺(tái)（Illumina公司）對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行小鼠糞便菌群測(cè)序（16 S rDNA），聚類分析和PCA分析等方法分析樣本屬水平上的菌群結(jié)構(gòu)與數(shù)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組新生小鼠體質(zhì)量變化及生存情況建模前4組新生小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。建模結(jié)束時(shí)，模型組及FMT干預(yù)組小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但較正常對(duì)照組明顯降低（P<0.05）。正常對(duì)照組小鼠進(jìn)食和排便均正常，精神狀態(tài)良好，未出現(xiàn)NEC癥狀，而模型組及FMT干預(yù)組均出現(xiàn)不同程度胃潴留、腹脹、活動(dòng)減少等癥狀，模型組均出現(xiàn)黑便、血便等癥狀。建模7 d，F(xiàn)MT預(yù)防組和FMT治療組體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但較模型組明顯升高（P<0.05，表1）。

表1 各組小鼠體質(zhì)量及生存率比較（±s）Tab.1 Comparison of body weight and survival rate of mice in each group（±s）

表1 各組小鼠體質(zhì)量及生存率比較（±s）Tab.1 Comparison of body weight and survival rate of mice in each group（±s）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with NEC model，2）P<0.05.

Groups Control NEC model FMT prevention FMT treatment Body weight/g 0 d 6.22±0.65 6.17±0.43 6.23±0.94 6.15±0.76 3 d 7.24±1.21 5.65±0.451）5.76±0.611）5.81±0.661）7 d 8.15±0.84 5.14±0.381）6.43±0.491）2）6.39±0.511）2）Survival rate/%100 66.7 83.3 83.3

2.2 各組新生小鼠結(jié)腸組織形態(tài)及病理學(xué)改變正常對(duì)照組小鼠腸組織腸管色澤鮮嫩，彈性佳，呈淡黃色，無(wú)出血、積氣和水腫等；NEC模型組小鼠腸管呈黑紅色改變，彈性差，腸管有出血現(xiàn)象，明顯擴(kuò)張有積氣，呈串珠樣改變；FMT預(yù)防組和FMT治療組小鼠腸組織均呈淺紅色，彈性尚可，腸管有輕度積氣及輕微出血現(xiàn)象（圖1）。HE染色病理學(xué)觀察顯示：對(duì)照組回腸部結(jié)構(gòu)完整，隱窩結(jié)構(gòu)規(guī)則，腺體排列規(guī)則，組織結(jié)構(gòu)清楚，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及潰瘍；NEC模型組回腸部隱窩數(shù)扭曲，融合減少，絨毛脫落消失，且有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；FMT預(yù)防組和FMT治療組小鼠結(jié)腸炎癥均明顯緩解，隱窩數(shù)增加，上皮較為完整，結(jié)腸黏膜呈愈合趨勢(shì)（圖2）。

圖1 各組新生小鼠腸管形態(tài)及結(jié)腸組織病理學(xué)變化（×200）Fig.1 General morphology of intestines and histopatho?logical changes in colon of newborn mice in each group（×200）

2.3 各組新生小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞因子測(cè)定與對(duì)照組相比，NEC模型組及FMT預(yù)防、治療組細(xì)胞因子IL-4及IL-10水平明顯降低（P<0.05），TNF-α及IFN-γ水平明顯升高（P<0.05）。與NEC模型組相比，F(xiàn)MT預(yù)防組及治療組IL-4及IL-10水平明顯提高（P<0.05），TNF-α及IFN-γ水平明顯降低（P<0.05，圖2）。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織各細(xì)胞因子含量比較Fig.2 Comparison of cytokine content in colon tissue of mice in each group

2.4 各組新生小鼠結(jié)腸組織Gata-3和T-bet陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織Gata-3和T-bet陽(yáng)性細(xì)胞僅存在于黏膜上皮，固有層細(xì)胞存在少量浸潤(rùn)，NEC模型組、FMT預(yù)防組、FMT治療組陽(yáng)性細(xì)胞均不同程度增加，且浸潤(rùn)明顯。與對(duì)照組相比，NEC模型組T-bet陽(yáng)性細(xì)胞比例及T-bet/Gata-3明顯提高（P<0.05），Gata-3陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯降低（P<0.05）。與NEC模型組相比，F(xiàn)MT預(yù)防組及治療組T-bet陽(yáng)性細(xì)胞比例及T-bet/Gata-3明顯降低（P<0.05），Gata-3陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯提高（P<0.05，圖3、表3）。

表3 各組小鼠結(jié)腸組織Gata-3和T-bet陽(yáng)性細(xì)胞占比（±s）Tab.3 Proportion of Gata-3 and T-bet positive cells in colon tissue of mice in each group（±s）

表3 各組小鼠結(jié)腸組織Gata-3和T-bet陽(yáng)性細(xì)胞占比（±s）Tab.3 Proportion of Gata-3 and T-bet positive cells in colon tissue of mice in each group（±s）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with NEC model，2）P<0.05.

Groups Control NEC model FMT prevention FMT treatment T-bet/%12.25±4.78 65.65±9.461）42.68±5.891）2）33.78±4.271）2）Gata-3/%33.35±6.68 10.54±2.321）18.39±4.481）2）22.78±5.711）2）T-bet/Gata-3 0.36±0.01 6.76±0.231）2.37±0.071）2）1.58±0.031）2）

圖3 各組新生小鼠結(jié)腸組織Gata-3和T-bet陽(yáng)性細(xì)胞（×400）Fig.3 Gata-3 and T-bet positive cells in colon tissue of newborn mice in each group（×400）

2.5 各組新生小鼠腸道菌群分析NEC模型組小鼠乳桿菌屬明顯減少，擬桿菌屬和顫螺菌屬增加，建模7 d時(shí)，顫螺菌屬連續(xù)增加，擬桿菌屬含量下降，乳桿菌屬未見(jiàn)明顯改變。FMT預(yù)防組在建立NEC模型時(shí)菌群改變與NEC模型組變化趨勢(shì)相同，但建模7 d時(shí)擬桿菌屬及顫螺菌屬有所減少，Allo?baculum菌屬及乳桿菌屬占比有所提高。FMT治療組顫螺菌屬及擬桿菌屬降幅明顯，乳桿菌屬出現(xiàn)更明顯增加趨勢(shì)（圖4）。

圖4 各組新生小鼠建模前后腸道菌群分析Fig.4 Analysis of intestinal flora of each group of new?born mice before and after modeling

3 討論

NEC為新生兒常見(jiàn)危重癥，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能與新生兒腸道功能不全、腸黏膜功能受損及感染有關(guān)［10］。正常腸道黏膜屏障可有效防止多種有害物質(zhì)穿過(guò)腸黏膜進(jìn)入人體及血液，從而防止結(jié)腸炎的發(fā)生［11］。研究顯示，F(xiàn)MT對(duì)于調(diào)節(jié)結(jié)腸炎患者腸道菌群平衡、重建腸道微生態(tài)系統(tǒng)及恢復(fù)腸黏膜屏障有明顯療效，但對(duì)于新生兒NEC的治療未見(jiàn)報(bào)道［12］。本研究中結(jié)果顯示，NEC模型組小鼠一般生存情況、體質(zhì)量和腸道大體形態(tài)、回盲腸組織病理學(xué)損傷等方面均明顯差于對(duì)照組，表明本研究模型建立成功。FMT干預(yù)組或FMT治療組均能明顯改善NEC誘導(dǎo)的體質(zhì)量下降，兩組小鼠的一般生存情況良好，腸道大體形態(tài)及腸組織病理學(xué)損傷較輕微，表明FMT在NEC小鼠動(dòng)物模型中具有明顯保護(hù)作用。

腸道微生態(tài)激發(fā)的免疫應(yīng)答在NEC的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中有重要作用，抑制免疫反應(yīng)介導(dǎo)的腸黏膜損傷可促進(jìn)腸黏膜屏障恢復(fù)［11］。正常狀態(tài)下，腸道黏膜在Th1、Th2和Treg等不同CD4+T細(xì)胞亞群的協(xié)調(diào)下維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，結(jié)腸炎患者病變部位CD4+T細(xì)胞增殖和浸潤(rùn)增加，其中Th1/Th2細(xì)胞平衡紊亂為重要表現(xiàn)。轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Gata-3轉(zhuǎn)錄因子分別特異性表達(dá)于Th1和Th2細(xì)胞，因此T-bet和Gata-3是判斷Th1/Th2細(xì)胞增殖和浸潤(rùn)程度的良好指標(biāo)［13-14］。本研究結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織的Th1/Th2平衡以Th2抗炎為主導(dǎo)，而NEC模型小鼠則以Th1促炎為主導(dǎo)。FMT預(yù)防或治療后T-bet陽(yáng)性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯降低，Gata-3陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加，且以Th1細(xì)胞分泌為主的TNF-α、IFN-γ等促炎因子明顯減少，以Th2細(xì)胞分泌為主的IL-4、IL-10等抗炎因子明顯增加，且FMT治療組的效果優(yōu)于FMT預(yù)防組。以上研究表明FMT干預(yù)可調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡右移介導(dǎo)腸黏膜修復(fù)，改善腸道微生態(tài)環(huán)境。

腸道菌群平衡對(duì)維持小鼠腸黏膜免疫屏障功能具有重要作用，若腸道菌群失調(diào)便可激活腸道內(nèi)多種免疫細(xì)胞，釋放大量炎癥介質(zhì)因子，因此FMT干預(yù)對(duì)NEC抗炎和腸道黏膜修復(fù)作用與FMT調(diào)節(jié)腸道菌群平衡密不可分［15］。在本研究中，F(xiàn)MT治療組新生小鼠擬桿菌屬及乳桿菌屬明顯改變，產(chǎn)生短鏈脂肪酸的Allobaculum菌明顯增加，顫螺菌屬所占比例明顯降低。增加的乳桿菌可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用有效抑制致病菌過(guò)度繁殖，進(jìn)而維持腸道微生態(tài)平衡，并調(diào)節(jié)新生小鼠膽汁酸鹽活性影響脂質(zhì)代謝，增加體質(zhì)量，同時(shí)乳桿菌還可通過(guò)促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2等抗炎因子進(jìn)一步發(fā)揮抗炎作用［16-18］。短鏈脂肪酸對(duì)于維持結(jié)腸上皮細(xì)胞正常的形態(tài)和功能具有重要作用，人體腸道菌群中顫螺菌屬的水平高低與體質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)［19］。因此FMT干預(yù)后顫螺菌屬的減少可能與小鼠體質(zhì)量增加有關(guān)。

因此，糞菌移植可有效調(diào)節(jié)NEC模型小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，減輕結(jié)腸炎癥損害，促進(jìn)腸黏膜屏障功能恢復(fù)，可能與FMT干預(yù)后調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，下調(diào)炎癥因子表達(dá)，介導(dǎo)Th2免疫修復(fù)有關(guān)。